林傳彬，毛春梅，李昌波

(內(nèi)江市第二人民醫(yī)院肛腸胃腸外科，四川 內(nèi)江 641000)

膿毒癥是感染、燒傷、創(chuàng)傷、休克等急危重病癥的嚴(yán)重并發(fā)癥[1]。腸道是膿毒血癥發(fā)生及發(fā)展的重要始動(dòng)及關(guān)鍵因素，膿毒癥發(fā)生時(shí)可使腸黏膜上皮發(fā)生水腫，腸上皮細(xì)胞膜和細(xì)胞間連接發(fā)生斷裂，細(xì)胞壞死，腸上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)過度激活，黏膜下血流灌注減少，引起腸道的通透性增加、腸道屏障功能損傷，腸道細(xì)菌和毒素被吸收進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)從而引起細(xì)菌移位，使全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)加重、失控，嚴(yán)重時(shí)引發(fā)多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，并危及患者生命[2]。因此小腸損傷的治療、保護(hù)成為膿毒癥治療中極為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。

核因子κB(NF-κB)是膿毒血癥發(fā)生發(fā)展過程中的核心通路[3]，因此積極尋求抑制NF-κB通路的藥物及治療手段是減緩膿毒血癥發(fā)展的關(guān)鍵。有研究[4-5]顯示，多種中藥可通過抑制NF-κB通路進(jìn)而發(fā)揮其對(duì)膿毒癥的治療作用，對(duì)臨床治療具有重要的指導(dǎo)意義。香葉木素(Diosmetin，Dio)屬于黃酮苷香葉木甙的糖苷配基，發(fā)現(xiàn)于金合歡樹莢果和橄欖葉中，具有抗癌[6]、抗炎[7]、改善代謝[8]、保護(hù)心血管[9]等作用，但其在膿毒血癥腸保護(hù)中的作用尚未得到驗(yàn)證。本研究旨在通過構(gòu)造膿毒癥所致小腸損傷大鼠模型，進(jìn)而研究Dio對(duì)其的治療保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 大鼠膿毒癥模型的建立及分組

30只7周齡健康雄性成年SD大鼠購自東方生物服務(wù)公司(南京)。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理與使用指南》(IACUC-190525-12)。所有大鼠維持12 h的光/暗循環(huán)，并隨意喂食食物和水。實(shí)驗(yàn)前讓大鼠適應(yīng)環(huán)境1周。將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組及治療組，每組10只。膿毒癥大鼠模型利用盲腸結(jié)扎穿刺法進(jìn)行誘導(dǎo)：異氟醚麻醉下，正中切口1.5 cm暴露盲腸，隨后在距盲腸尖端1 cm處用5-0絲線結(jié)扎，用18號(hào)針頭穿刺盲腸，擠壓出少量糞便，然后用無菌4-0絲線縫合切口。對(duì)照組大鼠行剖腹手術(shù)，不結(jié)扎、不穿孔。術(shù)后予液體復(fù)蘇(皮下注射1 mL生理鹽水)。對(duì)照組術(shù)后每日后腹腔注射生理鹽水20 mg·kg-1，連續(xù)7 d；模型組術(shù)后每日后腹腔注射生理鹽水20 mg·kg-1,連續(xù)7 d；治療組術(shù)后每日腹腔注射Dio 20 mg·kg-1，連續(xù)7 d，Dio純度≥ 95.7%，購自中國食品藥品檢定研究院。

1.2 小腸微血管灌注

大鼠麻醉后，沿腹中線進(jìn)行剖腹手術(shù)并在Treitz韌帶遠(yuǎn)端5 cm處確定空腸。利用激光多普勒灌注成像儀(瑞典Perimed aB公司)評(píng)估大鼠空腸黏膜血流，激光波長為670 nm；ldPi成像軟件(版本2.5，瑞典Perimed aB公司)用于記錄、分析和處理胃血流圖像，單位：PU。

1.3 小腸組織的病理學(xué)觀察

收集各組大鼠小腸組織，并在10%福爾馬林中固定48 h。然后進(jìn)行脫水、洗滌、石蠟包埋、切片及HE染色。在光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)下觀察形態(tài)學(xué)變化。

1.4 IL-1β、IL-6以及TNF-α檢測

根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附劑測定(ELISA)試劑盒(美國Signosis公司，生產(chǎn)批號(hào)：20201024)說明書，對(duì)3組大鼠結(jié)腸組織上清液進(jìn)行IL-1β、IL-6以及TNF-α測定，重復(fù)3次，取平均值。

1.5 Western blot法檢測

利用RIPA裂解液對(duì)大鼠小腸組織全蛋白進(jìn)行萃取。利用BCA法將各腸組織蛋白樣品定量至相同濃度，取20 μg蛋白進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳結(jié)束后，濕轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至甲醇預(yù)活化的PVDF膜，以1：1000的稀釋比例孵育抗體(ZO-1、Claudin-1及NF-κB p65)，4 ℃下過夜。次日，TBST洗滌后加入二抗，室溫下孵育1 h，再次洗滌后，最后利用化學(xué)發(fā)光成像儀顯影。

1.6 免疫熒光染色

各組大鼠小腸組織切片封閉后，先加入兔抗NF-κB p65抗體(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：20200906)后，4 ℃下孵育過夜，然后在室溫下與二級(jí)山羊抗兔抗體孵育1 h，然后熒光顯微鏡(日本Olympus公司)下觀察并采集圖像。隨后將組織和細(xì)胞與4，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)溶液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司,生產(chǎn)批號(hào)：20200814)混合，在室溫下反應(yīng)5 min，然后在熒光顯微鏡(日本Olympus公司)下觀察并采集圖像。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，多組之間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Dio治療對(duì)膿毒癥大鼠小腸組織病理學(xué)形態(tài)的影響

對(duì)照組的腸黏膜形態(tài)無明顯變化，小腸絨毛排列整齊，黏膜上皮厚度無明顯差異；模型組絨毛高度、寬度減少，絨毛斷裂較多，且腸黏膜固有層出現(xiàn)單核細(xì)胞和漿細(xì)胞慢性炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象；而治療組顯示Dio能減輕膿毒癥對(duì)小腸的損傷，使小腸形態(tài)得到明顯改善。見圖1。

圖1 各組大鼠小腸組織的組織病理學(xué)表現(xiàn)(×100,HE染色)

2.2 Dio治療對(duì)膿毒癥大鼠空腸黏膜血流灌注的作用

與對(duì)照組相比，模型組大鼠空腸黏膜血流灌注明顯減少(P<0.01)；而相較于模型組，治療組大鼠空腸黏膜血流灌注顯著增加(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠空腸黏膜血流灌注

2.3 Dio治療對(duì)膿毒癥大鼠小腸炎癥反應(yīng)的影響

與對(duì)照組相比，模型組大鼠小腸炎癥因子均明顯增加(P<0.001)，表明膿毒癥大鼠小腸存在明顯的炎癥反應(yīng)；而治療組大鼠小腸組織中的炎癥因子與模型組相比，均顯著下降(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠小腸組織中IL-1β、IL-6以及TNF-α的水平

2.4 Dio治療對(duì)NF-κB p65通路修復(fù)膿毒癥誘導(dǎo)大鼠的緊密連接蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，模型組大鼠小腸組織中ZO-1和Claudin-1表達(dá)水平顯著下降(P<0.001)；與模型組比較，治療組上述蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.001)。NF-κB p65在模型組中的表達(dá)水平顯著升高(P<0.001)；治療組該蛋白水平顯著下降(P<0.01)。DAPI染色結(jié)果顯示，模型組染色質(zhì)固縮、形成很多顆粒物質(zhì)、細(xì)胞核出現(xiàn)破裂形成碎片，核解體；治療組中該現(xiàn)象得到明顯的改善，其細(xì)胞核完整性提高。NF-κB p65染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，模型組NF-κB p65數(shù)量明顯增多，而治療組NF-κB p65數(shù)量明顯下降(P<0.001)。見表3、圖2。

表3 各組大鼠小腸組織中ZO-1、Claudin-1及NF-κB p65的相對(duì)表達(dá)水平

A：Western blot檢測；B:免疫熒光染色圖像。

3 討論

目前，膿毒癥的臨床治療藥物以抗生素及糖皮質(zhì)激素為主，但是上述藥物易出現(xiàn)耐藥性及免疫抑制等風(fēng)險(xiǎn)，使臨床治療膿毒癥的難度增加[10]。中醫(yī)講究論辨證論治，認(rèn)為毒邪入侵、正氣不足是膿毒癥發(fā)病過程中的兩個(gè)重要因素，因此在治療時(shí)應(yīng)合理使用活血化瘀、清熱解毒、補(bǔ)益元?dú)忸愔兴嶽11]。本研究表明Dio對(duì)膿毒癥所致的小腸損傷具有治療作用，包括改善小腸的組織病理學(xué)形態(tài)及小腸黏膜下血流灌注。

Dio在多種疾病的治療中具有抗炎作用，如在特應(yīng)性皮炎中，Dio可減少皮膚病變中促炎性細(xì)胞因子(TNF-α，IL-4和IL-1β)的水平[12]；在內(nèi)毒素誘導(dǎo)的大鼠急性肝衰竭過程中，Dio可發(fā)揮其抗炎、抗氧化、抗凋亡的作用[13]。本研究結(jié)果顯示，Dio治療可減輕膿毒癥所致小腸損傷大鼠小腸中炎癥因子水平，小腸局部炎癥反應(yīng)減輕，提示在膿毒癥所致的小腸損傷疾病中Dio可同樣發(fā)揮其抗炎的作用，并且Dio可能通過降低小腸的炎癥，對(duì)小腸損傷具有治療保護(hù)作用。

ZO-1和Claudin-1同屬緊密連接蛋白。Claudin-1在腸上皮中廣泛表達(dá)，具有屏障形成功能，對(duì)緊密連接完整性具有重要作用[14]。ZO-1屬于含有細(xì)胞質(zhì)斑塊結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，有助于穩(wěn)定具有肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架[15]。膿毒癥發(fā)生時(shí)，會(huì)破壞小腸的屏障功能，緊密連接蛋白被破壞。本研究結(jié)果顯示，膿毒癥大鼠小腸組織中ZO-1和Claudin-1的表達(dá)降低，而Dio治療促進(jìn)了它們的表達(dá)。提示Dio可提高小腸細(xì)胞緊密連接和腸屏障功能，發(fā)揮其保護(hù)作用。在膿毒癥的發(fā)病過程中，NF-κB 活化的主要誘導(dǎo)介質(zhì)有細(xì)菌釋放的脂多糖，熱休克蛋白90和高遷移率組蛋白等[16]。本研究結(jié)果顯示，Dio治療后大鼠小腸組織中NF-κB p65顯著下降，提示NF-κB可能是Dio在膿毒癥誘導(dǎo)的小腸損傷中保護(hù)作用的機(jī)制之一。

綜上所述，Dio通過抑制NF-κB對(duì)膿毒癥小腸損傷具有治療保護(hù)作用。因此，Dio可能是膿毒癥誘導(dǎo)的小腸損傷的潛在治療藥物，但詳細(xì)機(jī)制尚需進(jìn)一步闡明。