王 維，曹亦楠，劉嘉莉，趙曉東，魏慧軍，魏明清，馬亞茹，黃存生，薛旭升

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)a.孫思邈醫(yī)院腦病科，陜西 銅川 727031；b.孫思邈醫(yī)院腦病研究所，陜西 銅川 727031；c.東直門醫(yī)院腦病科三區(qū)，北京 100700；2.北京廣安睡眠科學(xué)研究院，北京 100032)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種不可逆的神經(jīng)退行性疾病，在老年人口中發(fā)病率較高，其導(dǎo)致人體認(rèn)知和神經(jīng)功能發(fā)生進(jìn)行性減退，直至最終喪失獨(dú)立生活能力，嚴(yán)重威脅著人類生命和健康。隨著世界人口老齡化加劇，AD發(fā)病率隨之逐年上升，目前全世界估計(jì)已有4400萬(wàn)人患有AD，預(yù)計(jì)2050年AD患者數(shù)量將增長(zhǎng)為1.52億[1]。目前關(guān)于AD發(fā)病機(jī)制的觀點(diǎn)主要有β-淀粉樣蛋白(Aβ)假說、Tau蛋白過度磷酸化以及膽堿能神經(jīng)元損傷等[2]，但AD具體發(fā)病機(jī)制仍未明確，因此積極探索AD的發(fā)病機(jī)制以及推動(dòng)AD治療進(jìn)展一直是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。

生物信息學(xué)是一門適應(yīng)大數(shù)據(jù)需求的前沿交叉學(xué)科，該學(xué)科的高速發(fā)展為研究AD帶來(lái)新的思路[3]。本研究基于多重生物信息學(xué)的整體思路，通過運(yùn)用基因表達(dá)數(shù)據(jù)集(GEO)、mirTarBase、Starbase以及Targetscan等多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的同時(shí)結(jié)合計(jì)算機(jī)R語(yǔ)言等工具篩選出AD的關(guān)鍵基因、microRNA(miRNA)、轉(zhuǎn)錄因子(TF)以及信號(hào)通路等信息，并從多角度、多層面且較系統(tǒng)地對(duì)AD的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制展開探索，以期為未來(lái)AD的基礎(chǔ)與臨床研究提供有益的理論參考。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

美國(guó)國(guó)立生物中心建立的GEO數(shù)據(jù)庫(kù)為全球最大且內(nèi)容最豐富的公共數(shù)據(jù)資源平臺(tái)，因此選擇GEO數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行下載AD的基因芯片作為數(shù)據(jù)來(lái)源。以“Alzheimer’s disease”為檢索詞，在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)展開檢索相關(guān)基因芯片數(shù)據(jù)集。

數(shù)據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)：1)樣本為人大腦組織；2)樣本僅包含正常對(duì)照樣本與AD組織樣本；3)正常對(duì)照與AD組織的樣本數(shù)均≥80；4)芯片數(shù)據(jù)為基因表達(dá)譜。

1.2 差異表達(dá)基因的數(shù)據(jù)處理與篩選

通過Bioconductor平臺(tái)中的affy數(shù)據(jù)包對(duì)2個(gè)原始數(shù)據(jù)集進(jìn)行背景校準(zhǔn)、歸一化以及基因表達(dá)值log2轉(zhuǎn)換的預(yù)處理，同時(shí)當(dāng)多個(gè)探針對(duì)應(yīng)一個(gè)共同基因時(shí)，取平均值作為其表達(dá)值。另外運(yùn)用SVA數(shù)據(jù)包消除2個(gè)數(shù)據(jù)集之間的批次效應(yīng)和其他非必要變異。最后，應(yīng)用limma包篩選差異表達(dá)基因(DEGs)，篩選條件設(shè)置為P<0.05，log2Fold Change>0.5。

1.3 DEGs的疾病本體富集分析、基因本體功能注釋和京都基因與基因組百科全書通路富集分析

疾病本體(DO)富集分析是研究目標(biāo)基因是否在某個(gè)疾病或某類疾病中富集的一種分析方法，對(duì)于研究復(fù)雜疾病發(fā)病機(jī)制、新藥研發(fā)具有重要作用[4]。使用DOSE數(shù)據(jù)包對(duì)DEGs進(jìn)行DO富集分析，P<0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

基因本體(GO)是用于篩選3項(xiàng)獨(dú)立類別的基因富集功能：生物過程(BP)，細(xì)胞成分(CC)和分子功能(MF)；京都基因與基因組百科全書(KEGG)是用于搜索與已篩選基因相關(guān)的通路。使用可視化和集成發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)(DAVID)在線工具，對(duì)篩選的DEGs進(jìn)行GO功能注釋和KEGG通路富集分析，每個(gè)項(xiàng)目的基因數(shù)≥5并且P<0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將DEGs上傳至STRING(the Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes)數(shù)據(jù)庫(kù)，以“highest confidence”(>0.4)作為最低相互作用閾值，并在隱藏?cái)嚅_節(jié)點(diǎn)后構(gòu)建蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)。進(jìn)一步使用Cytoscape3.8.0軟件優(yōu)化網(wǎng)絡(luò)，應(yīng)用插件CytoHubba計(jì)算各個(gè)蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)的度(degree)，根據(jù)度的大小篩選潛在靶點(diǎn)。蛋白的度值代表與其具有相互作用的其他蛋白節(jié)點(diǎn)數(shù)目，因而可根據(jù)度值大小排名判斷蛋白對(duì)整體網(wǎng)絡(luò)的影響程度，并預(yù)測(cè)出AD的關(guān)鍵基因。

1.5 miRNA-TF-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

運(yùn)用mirTarBase、Starbase和Targetscan數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)AD關(guān)鍵基因的相關(guān)miRNA。為提高預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性，因此對(duì)以上3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)分別預(yù)測(cè)的miRNA取交集，篩選出共同miRNA作為AD關(guān)鍵基因的相關(guān)miRNA。另外運(yùn)用Enrichr數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)AD關(guān)鍵基因的相關(guān)TF，并且以物種為智人以及P<0.05作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選。根據(jù)以上所獲AD關(guān)鍵基因的miRNA與轉(zhuǎn)錄因子信息后，利用Cytoscape軟件構(gòu)建AD關(guān)鍵基因的miRNA-TF-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)集信息以及DEGs篩選結(jié)果

經(jīng)仔細(xì)篩選后下載芯片編號(hào)分別為GSE48350和GSE132903的芯片原始文件。數(shù)據(jù)集GSE48350基于GPL570[HG-U133_Plus_2]Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array平臺(tái)，具有173個(gè)正常對(duì)照樣本，80個(gè)AD樣本。數(shù)據(jù)集GSE132903基于GPL10558Illumina HumanHT-12 V4.0 expression beadchip平臺(tái)，具有98個(gè)正常對(duì)照樣本，97個(gè)AD樣本。

使用R語(yǔ)言對(duì)2個(gè)原始數(shù)據(jù)集進(jìn)行處理后開始篩選DEGs，選出符合條件的DEGs共有109個(gè)，其中44個(gè)為上調(diào)基因，65個(gè)為下調(diào)基因(圖1)。

藍(lán)色節(jié)點(diǎn)代表下調(diào)差異基因，紅色節(jié)點(diǎn)代表上調(diào)差異基因，黑色節(jié)點(diǎn)代表無(wú)顯著表達(dá)差異基因；Fold Change(差異倍數(shù))表示試驗(yàn)組與對(duì)照組兩者表達(dá)量的比值，即差異表達(dá)倍數(shù)。

2.2 DEGs的DO富集分析、GO功能注釋和KEGG通路富集分析

DO富集分析結(jié)果顯示DEGs與6種疾病顯著相關(guān)，分別為躁郁癥(bipolar disorder)、AD、Tau蛋白病變(tauopathy)、情緒障礙(mood disorder)、腦部疾病(brain disease)、癲癇綜合征(epilepsy syndrome)，見表1、圖2。

圖2 DEGs的DO富集分析

GO功能富集顯示包括化學(xué)突觸傳遞(chemical synaptic transmission)、運(yùn)輸(transport)、氯離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)(chloride transmembrane transport)、大腦發(fā)育(brain development)、細(xì)胞外基質(zhì)組織(extracellular matrix organization)、離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)(ion transmembrane transport)等6項(xiàng)生物過程，質(zhì)膜(plasma membrane)、胞外區(qū)(extracellular region)、質(zhì)膜組成部分(integral component of plasma membrane)、細(xì)胞外間隙(extracellular space)、細(xì)胞連接(cell junction)、突觸小泡(synaptic vesicle)、神經(jīng)元投射(neuron projection)、突觸囊泡膜(synaptic vesicle membrane)、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix)、樹突(dendrite)、分泌顆粒(secretory granule)、突觸(synapse)、突觸后膜(postsynaptic membrane)等13項(xiàng)細(xì)胞成分以及神經(jīng)肽激素活性(neuropeptide hormone activity)和激素活性(hormone activity)等2項(xiàng)分子功能，見表1，圖3。

Rich Factor(富集因子)表示本研究中差異基因注釋在某條代謝通路上的數(shù)目與人類所有基因注釋到該通路上的數(shù)目的比值，數(shù)值越大表示富集程度越大；Rich Factor的計(jì)算來(lái)源為差異基因在DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行的KEGG通路富集分析的結(jié)果。

KEGG通路富集分析顯示主要涉及GABA能突觸(GABAergic synapse)、逆行內(nèi)源性大麻素信號(hào)(Retrograde endocannabinoid signaling)、神經(jīng)活性配體-受體相互作用(Neuroactive ligand-receptor interaction)、絲裂原活化蛋白酶(MAPK)信號(hào)通路(MAPK signaling pathway)、催產(chǎn)素信號(hào)通路(Oxytocin signaling pathway)、鈣信號(hào)通路(Calcium signaling pathway)、嗎啡成癮(Morphine addiction)、苯丙胺成癮(Amphetamine addiction)等8條信號(hào)通路，見表1，圖4。

表1 DEGs的DO富集分析、GO功能注釋和KEGG通路富集分析

圖4 DEGs的KEGG通路富集分析

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和關(guān)鍵基因篩選

通過Cytoscape 3.8.0軟件對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化處理，得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖，圖中共有68個(gè)節(jié)點(diǎn)和173條邊。根據(jù)Cytohubba插件對(duì)圖中節(jié)點(diǎn)的度進(jìn)行計(jì)算，并設(shè)置度越大的節(jié)點(diǎn)越靠近網(wǎng)絡(luò)中心且顏色越深(圖5)。選取度最高的前10個(gè)基因作為AD的關(guān)鍵基因，分別為膽囊收縮素(CCK)、FOS原癌基因(FOS)、γ-氨基丁酸A型受體亞基α1(GABRA1)、γ-氨基丁酸A型受體亞基γ2(GABRG2)、突觸素(SYP)、生長(zhǎng)抑素(SST)、神經(jīng)肽Y(NPY)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、突觸素Ⅱ(SYN2)、嗜鉻粒蛋白B(CHGB)，見表2。

圖5 DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)

表2 PPI網(wǎng)絡(luò)中的度排名前10的基因

2.4 miRNA-TF-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析

mirTarBase、Starbase和Targetscan數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)的AD關(guān)鍵基因的相關(guān)miRNA分別為103個(gè)、236個(gè)和3903個(gè)，通過構(gòu)建Venn圖篩選出共同miRNA為27個(gè)(圖6)，mRNA與miRNA的對(duì)應(yīng)關(guān)系見表3。此外，運(yùn)用Enrichr數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)得到的AD關(guān)鍵基因相關(guān)TF共有12個(gè)，TF與mRNA的對(duì)應(yīng)關(guān)系見表4。根據(jù)AD關(guān)鍵基因及其相關(guān)的miRNA與TF信息構(gòu)建miRNA-TF-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(圖7)，在網(wǎng)絡(luò)中可見FOS受多種miRNA調(diào)控，同時(shí)受作為轉(zhuǎn)錄因子的激活轉(zhuǎn)錄因子4(ATF4)、尿激酶型纖溶酶原激活因子(PLAU)和叉頭盒A1(FOXA1)調(diào)控；GABRA1受has-miR-335-5p調(diào)控，同時(shí)受多種作為轉(zhuǎn)錄因子的Spi-B轉(zhuǎn)錄因子(SPIB)、髓性鋅指1(MZF1)、GATA結(jié)合蛋白3(GATA3)、JUND原癌基因(JUND)、肝細(xì)胞核因子1B(HNF1B)、POU2級(jí)同源框2(POU2F2)、鋅指蛋白281(ZNF281)、FOXA1調(diào)控；另外除HNF1B外，其余各個(gè)TF均調(diào)控多個(gè)關(guān)鍵基因的mRNA。總之，結(jié)果表明miRNA-TF-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中mRNA與miRNA、TF之間具有一對(duì)多和多對(duì)一的對(duì)應(yīng)關(guān)系，可見它們之間可能具有較復(fù)雜的調(diào)控關(guān)系。

圖6 mirTarBase、Starbase和Targetscan數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miRNA的Venn圖

紫色三角形節(jié)點(diǎn)代表miRNA，橢圓形節(jié)點(diǎn)代表關(guān)鍵基因表達(dá)的mRNA(紅色代表上調(diào)，綠色代表下調(diào))，黃色菱形節(jié)點(diǎn)代表TF。

表3 miRNA-TF-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中mRNA與miRNA的對(duì)應(yīng)關(guān)系

表4 miRNA-TF-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中TF與mRNA的對(duì)應(yīng)關(guān)系

3 討論

盡管由于AD對(duì)個(gè)人和社會(huì)的巨大影響使其受到全世界廣泛關(guān)注，但目前仍無(wú)有效根治AD的方法。美國(guó)食品藥品管理局目前已批準(zhǔn)了用于治療AD的藥物，但遺憾的是此類藥物均以神經(jīng)遞質(zhì)為基礎(chǔ)制成，僅可緩解AD患者部分癥狀而無(wú)法修復(fù)AD患者已受損的神經(jīng)元[5]，因此有必要充分了解AD的發(fā)病機(jī)制進(jìn)而為本病的治療提供新的理論依據(jù)。此前有關(guān)AD的生物信息學(xué)研究大多受到方法單一、樣本較小等限制，本研究基于多重生物信息學(xué)的整體思路，從多角度、多層面展開對(duì)AD的生物信息學(xué)研究。首先，本研究運(yùn)用GEO、mirTarBase、Starbase以及Targetscan等多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)展開對(duì)AD關(guān)鍵基因、miRNA、轉(zhuǎn)錄因子以及信號(hào)通路等信息的探索，并且在AD研究中首次進(jìn)行DO富集分析，充實(shí)了研究?jī)?nèi)容并增強(qiáng)了創(chuàng)新性。其次，本研究的樣本量相對(duì)較大，總體樣本數(shù)量為448，并且本研究運(yùn)用R語(yǔ)言中的多種數(shù)據(jù)包對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行了嚴(yán)格的背景校準(zhǔn)、歸一化、消除批次效應(yīng)等處理，保證了研究結(jié)果的可靠性?？傊狙芯肯Ｍ诙嘀厣镄畔W(xué)思路為AD發(fā)生的分子機(jī)制以及臨床治療提供新的研究線索。

本研究共篩選出109個(gè)DEGs，其中44個(gè)為上調(diào)基因，65個(gè)為下調(diào)基因。根據(jù)DO富集分析顯示，DEGs主要富集在躁郁癥、AD、Tau蛋白病變等疾病，可見DEGs不僅與神經(jīng)系統(tǒng)疾病關(guān)系密切，更與AD高度相關(guān)，此可反映出獲得的DEGs以及DO分析結(jié)果的可靠性。GO功能富集中有關(guān)BP與CC的結(jié)果主要涉及突觸傳遞、離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)以及細(xì)胞外基質(zhì)等方面，MF則主要涉及神經(jīng)肽等激素活性方面。突觸作為神經(jīng)元與靶細(xì)胞之間傳遞信號(hào)的關(guān)鍵部位，當(dāng)神經(jīng)沖動(dòng)傳導(dǎo)時(shí)，神經(jīng)遞質(zhì)將由突觸小泡移至突觸前膜進(jìn)行釋放并進(jìn)一步與突觸后膜上受體結(jié)合，從而完成一次信號(hào)傳導(dǎo)。若突觸功能受損，則會(huì)造成神經(jīng)沖動(dòng)傳導(dǎo)受阻，進(jìn)而誘發(fā)AD認(rèn)知功能損害[5]，并且已有研究[6]表明AD早期記憶喪失的主要原因是突觸功能障礙而并非神經(jīng)元喪失。AD的病理變化之一是淀粉樣前體蛋白(APP)的不規(guī)則蛋白水解，這是導(dǎo)致淀粉樣斑塊、神經(jīng)纖維纏結(jié)以及神經(jīng)元丟失的重要步驟，而AD 中的淀粉樣蛋白可修飾眾多離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)并形成異質(zhì)離子通道，此將加重離子的滲透性并嚴(yán)重?fù)p害生物膜，進(jìn)而促進(jìn)AD進(jìn)展[7]。細(xì)胞外基質(zhì)是由細(xì)胞分泌的各種大分子組成的結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)，有學(xué)者通過分析總結(jié)出在AD中細(xì)胞外基質(zhì)作用強(qiáng)大，不僅參與Aβ斑塊的形成和降解過程，還參與炎癥反應(yīng)以減輕AD中的神經(jīng)炎癥損傷，同時(shí)也可抵抗氧化應(yīng)激以減輕神經(jīng)損傷[8]。MF方面，NPY是一種36個(gè)氨基酸的肽，有研究[9]發(fā)現(xiàn)NPY 可通過抗凋亡、抗炎以及促吞噬作用來(lái)有效減緩AD病情進(jìn)展。除神經(jīng)肽激素外，有報(bào)道[10]指出腦胰島素抵抗也會(huì)通過促進(jìn)氧化應(yīng)激、刺激Aβ產(chǎn)生以及加重Tau蛋白磷酸化并造成AD病情惡化。

KEGG通路富集結(jié)果顯示DEGs主要富集在GABA能突觸、逆行內(nèi)源性大麻素信號(hào)、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、絲裂原活化蛋白酶(MAPK)信號(hào)通路、催產(chǎn)素信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路以及藥物成癮通路。GABA是人體大腦中最重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有抑制大腦興奮性神經(jīng)元的作用。有研究[11]證明在AD中GABA可通過與Aβ肽的前體APP相互調(diào)節(jié)而影響Aβ在腦內(nèi)沉積，并進(jìn)一步影響人體認(rèn)知功能。有關(guān)機(jī)制研究[12]表明在AD中通過調(diào)節(jié)內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)，可保護(hù)神經(jīng)元免受淀粉樣蛋白β?lián)p害，并減少Tau蛋白的磷酸化以及Aβ誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激等。另外，神經(jīng)活性配體與細(xì)胞內(nèi)受體相互作用同樣與AD關(guān)系密切，其可影響神經(jīng)元的學(xué)習(xí)與記憶能力、突觸功能以及神經(jīng)可塑性等方面[13]。MAPK信號(hào)通路作為重要的胰島素信號(hào)通路，有研究[14]表明在AD中通過調(diào)控MAPK信號(hào)通路可減少Aβ沉積，以及改善Tau蛋白過度磷酸化、神經(jīng)炎癥和自噬水平影響AD發(fā)生、發(fā)展。催產(chǎn)素是一種含有9個(gè)氨基酸的小肽，對(duì)許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有神經(jīng)保護(hù)作用，有學(xué)者[15]發(fā)現(xiàn)可通過調(diào)節(jié)催產(chǎn)素信號(hào)通路以減輕神經(jīng)毒性來(lái)改善AD。鈣信號(hào)通路的正常調(diào)控對(duì)于穩(wěn)定神經(jīng)元結(jié)構(gòu)與功能至關(guān)重要，同時(shí)其參與AD的病理過程[16]，對(duì)于探索AD的發(fā)病機(jī)制具有重要啟示。此外，有研究指出對(duì)于嗎啡等精神類藥物的濫用會(huì)引起神經(jīng)毒性和神經(jīng)炎癥，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)變性[17]，這對(duì)預(yù)防AD提供了重要參考。

根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)相關(guān)信息進(jìn)行篩選AD關(guān)鍵基因，并進(jìn)一步預(yù)測(cè)與其相關(guān)的miRNA與TF，根據(jù)所得結(jié)果構(gòu)建AD關(guān)鍵基因的miRNA-TF-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中可見FOS受多種miRNA調(diào)控，F(xiàn)OS基因又稱為c-FOS，其表達(dá)產(chǎn)物參與形成的激活蛋白-1(AP-1)在促進(jìn)突觸可塑性和長(zhǎng)時(shí)記憶方面作用明顯[18]。國(guó)外學(xué)者[19]通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在12個(gè)月大的AD小鼠腹側(cè)海馬中發(fā)現(xiàn)miR-181 的水平顯著增高而c-FOS的水平均顯著降低，并進(jìn)一步通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明了miR-181的過表達(dá)可顯著降低c-FOS的表達(dá)，由此充分證明了miR-181 可調(diào)節(jié)c-Fos的表達(dá)情況。本研究初步發(fā)現(xiàn)FOS 與miR-181以及ATF之間可能具有一定調(diào)控關(guān)系，但AD患者FOS表達(dá)量為上調(diào)的結(jié)果與上述動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果相反。然而又有研究[20]發(fā)現(xiàn)右美托咪定可通過降低c-Fos蛋白水平而抑制核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NLRP3)基因表達(dá)以及其炎性體活化，進(jìn)而減輕AD的神經(jīng)炎癥。因此，未來(lái)仍需進(jìn)行深入研究以探索FOS基因及其相關(guān)分子在AD中的調(diào)控機(jī)制。網(wǎng)絡(luò)中可見miR-335-5p與眾多關(guān)鍵基因相連接，本研究發(fā)現(xiàn)AD患者腦組織中miR-335-5p分子的表達(dá)顯著下調(diào)而Aβ蛋白水平顯著上調(diào)，在進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)miR-335-5p的過表達(dá)可顯著降低Aβ蛋白水平并抑制了AD腦細(xì)胞凋亡，而抑制miR-335-5p則獲得了相反的結(jié)果。此外，miR-335-5p的過表達(dá)顯著提高了AD模型小鼠的認(rèn)知能力[21]。調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提示miR-335-5p與FOS、GFAP、GABRA1、SYP、NPY基因以及除轉(zhuǎn)錄因子干擾素調(diào)節(jié)因子8(IRF8)外的所有轉(zhuǎn)錄因子都具有聯(lián)系。GFAP可作為星形膠質(zhì)細(xì)胞增生的標(biāo)志物，其表達(dá)水平與Aβ的生成存在顯著正相關(guān)性，并且與AD惡化程度密切相關(guān)[22]。GABRA1對(duì)大腦結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生顯著影響，其可以抑制大腦中的神經(jīng)傳遞，若其表達(dá)出現(xiàn)異常，則可能引起AD患者興奮性與抑制性神經(jīng)傳遞兩者間的失衡[23]。SYP是一種可用于反映突觸可塑性和突觸傳遞的蛋白質(zhì)，相關(guān)基礎(chǔ)研究[24]表明SYP表達(dá)下調(diào)可能引起AD大鼠模型的突觸可塑性喪失并減少突觸傳遞，從而導(dǎo)致神經(jīng)功能退化。另外NPY可通過抗凋亡、抗炎以及促吞噬作用減緩AD病情進(jìn)展[9]。本研究結(jié)果表明miR-335-5p可能充當(dāng)以上多個(gè)基因的橋梁，從多種途徑對(duì)AD的發(fā)生、發(fā)展產(chǎn)生影響。另外，調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的轉(zhuǎn)錄因子ATF4、IRF8及FOXA1與AD關(guān)系較為密切。ATF4屬于激活轉(zhuǎn)錄因子家族，具有調(diào)節(jié)Aβ生成、Tau蛋白磷酸化和細(xì)胞凋亡的作用。目前有研究[25]表明ATF4蛋白在AD小鼠模型腦中明顯上調(diào)，但ATF4與AD病理變化的具體因果關(guān)系仍需進(jìn)一步研究。IRF8具有保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)功能的作用，有報(bào)道[26]指出在AD中IRF8可促進(jìn)炎性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素1β(IL-1β)等物質(zhì)表達(dá)而引起小膠質(zhì)細(xì)胞激活與神經(jīng)炎癥。FOXA1 可促進(jìn)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞衍生神經(jīng)元，然而又有研究者[27]根據(jù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)通過抑制FOXA1可減輕麻醉劑七氟醚對(duì)AD大鼠造成的認(rèn)知功能損傷，可見FOXA1在AD中的作用機(jī)制尚未明確。通過以上分析，可見AD關(guān)鍵基因的miRNA-TF-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的生物分子信息極為復(fù)雜，后續(xù)應(yīng)展開更加深入的研究以探索AD潛在機(jī)制。

綜上所述，本研究基于多重生物信息學(xué)對(duì)AD相關(guān)機(jī)制進(jìn)行探索，DO富集分析初步驗(yàn)證了DEGs的可靠性，KEGG通路富集結(jié)果表明AD的內(nèi)在機(jī)制與GABA能突觸、逆行內(nèi)源性大麻素信號(hào)以及神經(jīng)活性配體-受體相互作用等多條信號(hào)通路密切相關(guān)。在AD關(guān)鍵基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中可見mRNA與miRNA、TF三者之間具有復(fù)雜的調(diào)控關(guān)系，miR-335-5p可能充當(dāng)FOS、GFAP、GABRA1等多個(gè)基因的橋梁，通過調(diào)控以上基因的表達(dá)以影響AD發(fā)生、發(fā)展，因此miR-335-5p值得在未來(lái)進(jìn)一步重點(diǎn)研究。此外本研究對(duì)網(wǎng)絡(luò)中屬于miRNA、基因及TF 3種層面的分子物質(zhì)，如miR-181、FOS、GFAP、ATF4、IRF8等也進(jìn)行了分析，并從不同角度對(duì)AD的內(nèi)在機(jī)制進(jìn)行了探討，為日后明確AD機(jī)制以及研發(fā)藥物提供一定借鑒。然而，本課題組后續(xù)仍應(yīng)通過結(jié)合臨床樣本、細(xì)胞以及動(dòng)物模型等相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證，以期更加準(zhǔn)確、深入地證實(shí)AD的相關(guān)分子機(jī)制。