王 淼，趙文正，周丹銀，黃 劍，汪正威

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；3.中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園熱帶森林生態(tài)重點實驗室化學(xué)生態(tài)研究組，云南 昆明650000）

油菜是羅平縣傳統(tǒng)特色優(yōu)勢作物，常年播種面積在5.3萬hm2，是全國油菜重點生產(chǎn)縣之一[1]。羅平縣是我國重要的蜜蜂春季繁蜂基地，全國每年有20多個地區(qū)600多戶飼養(yǎng)戶到羅平繁蜂，飼養(yǎng)西方蜜蜂3.2萬群、東方蜜蜂1.96萬群[2]。

在油菜花盛花期通過對蜂群的調(diào)整，空巢脾的加入，蜜蜂采集花蜜的條件相對穩(wěn)定。在細(xì)菌不斷被帶進(jìn)或帶出蜜囊的過程中，花蜜進(jìn)入蜜囊，形成一個暫時有氧的環(huán)境，花蜜混合物被歸巢蜂吐回蜂巢后，由于細(xì)菌耗氧的作用，使蜜囊又處于一個暫時缺氧的狀態(tài)。蜜囊中的部分細(xì)菌在有氧和無氧的環(huán)境中不斷適應(yīng)，從而定殖下來，并形成這一時期蜜囊中的細(xì)菌菌系。這一過程中，花蜜中的細(xì)菌，通過蜜蜂采集花蜜后進(jìn)入蜜囊，如果細(xì)菌附著不穩(wěn)定，將被蜜蜂吐回蜂巢混入蜂蜜中，形成0 d蜂蜜中的細(xì)菌菌系。蜂蜜是高糖度溶液，對細(xì)菌將進(jìn)行耐高滲透壓篩選，數(shù)量多、耐受性強的細(xì)菌，容易存活并被分離培養(yǎng)出來，而數(shù)量少耐受性弱的細(xì)菌，不易存活，最終也難被分離培養(yǎng)出來。

本試驗通過傳統(tǒng)分離培養(yǎng)技術(shù)獲得細(xì)菌菌株，篩除相同培養(yǎng)特征的菌株并計數(shù)?；?6S rDNA基因序列，對油菜花蜜、西方蜜蜂蜜囊以及第0 d蜂蜜中的細(xì)菌進(jìn)行分離，對典型差別的菌株進(jìn)行鑒定，并與已發(fā)布在NCBI的相似菌株序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析其多樣性差異和來源，揭示其系統(tǒng)發(fā)育地位，為進(jìn)一步開發(fā)和利用這些菌種資源提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，在實際生產(chǎn)中，為蜂群飼養(yǎng)管理過程細(xì)菌的控制和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

云南羅平西方蜜蜂蜂場3個采集點LP-1、LP-2、LP-3，各采集3組樣本。油菜花花蜜（NLP）：為田間采集；西方蜜蜂蜜囊：出勤蜂(AMHSOL)和歸巢蜂(AMHSBL)的蜜囊各30只，0d蜂蜜(AMHLP)：加入空脾后第1天的貯蜜3mL/每群。培養(yǎng)基：TSB；牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基；MRS[3,4]；試劑盒：細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒：（離心柱型，TIANGE BIOTECH）。細(xì)菌16S rDNA基因序列測序PCR引物（上海生工）：27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3′;1387R：5′-GGGCGGTGTGTACAAGGC-3′；擴增片段大小1400 bp左右。

1.2 方法

常規(guī)平板純培養(yǎng)、平均值計數(shù)，利用SPSS21.0統(tǒng)計平均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差、作圖。

雙向測序（上海生工生物科技有限公司），正、反向序列經(jīng)過人工拼接、校正、修剪后生成一致序列。利用Bioedit軟件的Clustal-W算法進(jìn)行Alignment計算，計算后的結(jié)果利用Dnasp5進(jìn)行單倍型多樣度計算，挑選出相同菌株，同時通過與MEGA5.0軟件的Neighbour-Joining法（鄰接法）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 花蜜、蜜囊、0 d蜂蜜優(yōu)勢菌數(shù)量

可培養(yǎng)細(xì)菌的研究，除了菌種的鑒定外，同時對可培養(yǎng)細(xì)菌尤其是優(yōu)勢菌群的數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計，分析細(xì)菌在花蜜、蜜囊及0d蜂蜜中的變化規(guī)律。Bacillus amyloliquefaciens為解淀粉芽孢菌；Other為其它細(xì)菌。

圖1 花蜜、蜜囊和0d蜂蜜細(xì)菌數(shù)量Fig.1 Bacterial isolates num ber log(CFU/g)in nectar,honey stom ach and 0d honey.

對花蜜、出勤蜂、歸巢蜂和0 d蜂蜜樣品中解淀粉芽孢菌和其它細(xì)菌數(shù)量作圖，縱坐標(biāo)為細(xì)菌數(shù)量對數(shù)（如圖1所示）?；劢獾矸垩挎呔鷶?shù)量為（230±18）～（268±8）CFU/g，其它細(xì)菌數(shù)量為（4±2）～（7±3）CFU/g；出勤蜂蜜囊解淀粉芽孢菌數(shù)量為（5.2×105±1.5×104）～（5.7×105±1.0×105）CFU/g；其它細(xì)菌數(shù)量為（280±40）～（333±23）CFU/g；歸巢蜂蜜囊解淀粉芽孢菌數(shù)量為1.1×105±1.3×104 CFU/g～1.5×105±2.2×104 CFU/g；其它細(xì)菌數(shù)量為（180±30）～（230±17）CFU/g；0 d未成熟蜂蜜解淀粉芽孢菌數(shù)量為（153±10）～（170±9）CFU/g，其它細(xì)菌數(shù)量為（10±3）～（14±5）CFU/g；3個采樣點細(xì)菌數(shù)量變化基本一致，各樣品占優(yōu)勢的細(xì)菌為解淀粉芽孢菌，其它細(xì)菌種類與數(shù)量較少。尤其花蜜和0 d未成熟蜂蜜中細(xì)菌的數(shù)量和種類極少。

2.2 花蜜、蜜囊和0 d蜂蜜細(xì)菌相似菌株信息

試驗所分離鑒定的菌株在GenBank比對后，其相似度不低于99%，相似菌株、登錄號、相似區(qū)間、相似序列長度見表1。

表1 花蜜、蜜囊和0 d蜂蜜細(xì)菌類型及相似菌株Table 1 Most closely related type strain from the nectar,honey stom ach and 0d honey

所采集西方蜜蜂樣品中，B.amyloliquefaciens在出勤蜂、歸巢蜂蜜囊、花蜜和0 d未成熟蜜中都存在；Sphingomonas aurantiaca在西方蜜蜂歸巢蜂和花蜜中存在；出勤蜂蜜囊細(xì)菌有：Brevundimonas vesicularis、Pseudomonas fluorescens、Acinetobacter lwoffii、Paracoccus siganidrum、Sphingobium yanoikuyae、Agrobacterium tumefaciens和Sphingomonas mucosissima；花蜜中存在Bacillus acidiceler；0d未成熟蜜中有Acetobacteraceae bacterium和Bacillus aryabhattai；歸巢蜂蜜囊有Pseudomonas baetica。

2.3 花蜜、蜜囊和0 d蜂蜜細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹

基于16S rDNA部分基因序列長度為1013 bp，與Genbank選擇14株相似細(xì)菌的序列，另選1株外群細(xì)菌序列，共計38條。樹枝的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基于bootstrap值1 000構(gòu)建，如圖2分支點所示，9個簇都有不低于73的自舉值，刻度標(biāo)尺表示20%的進(jìn)化差異。如圖2所示，9個簇包括：

α-變形菌綱的Ⅰ紅螺菌目、Ⅱ柄桿菌目、Ⅲ根瘤菌目、Ⅳ紅細(xì)菌目、Ⅴ鞘脂單胞菌目；γ-變形菌綱有Ⅵ不動桿菌屬、Ⅶ莫拉菌科,Ⅷ假單胞菌目；Ⅸ芽孢桿菌屬的4個種或亞種。

圖2 花蜜、蜜囊和0 d蜂蜜細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論與討論

本試驗篩選出西方蜜蜂蜜囊細(xì)菌、花蜜和0 d蜂蜜細(xì)菌菌株23株，解淀粉芽孢菌數(shù)量變規(guī)律：出勤蜂蜜囊＞歸巢蜂蜜囊＞花蜜＞蜂蜜；所采集的西方蜜蜂樣品中解淀粉芽孢桿菌在所有樣本中都存在。作為好氧、產(chǎn)芽孢的解淀粉芽孢桿菌存在于環(huán)境中[5]，能夠產(chǎn)生淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶，降解許多化學(xué)成分如油脂、蛋白質(zhì)和淀粉[6]，是功能性食品或藥物的添加劑，可作為飼料添加劑刺激蜜蜂的免疫應(yīng)答[7,8]，能表現(xiàn)出很強的抗菌活性[9]，其產(chǎn)生的抗菌化合物環(huán)狀脂肽和伊枯草菌素是一種較好的生物防治制劑[10]，能抑制Paenibacillus larvae，在飼養(yǎng)管理方面可進(jìn)行新型飼料添加劑的開發(fā)利用，增強對蜂病的防御能力[11-12]。

前人研究了覆盆子花期西方蜜蜂蜜囊細(xì)菌結(jié)果分屬乳酸桿菌屬和雙歧桿菌屬。本試驗是在油菜花期進(jìn)行，未分離到這兩個屬的細(xì)菌，表明細(xì)菌種類與地理差異、不同蜜源植物類型、蜜蜂種類和生命階段等因素相關(guān)[13]。歸巢蜂蜜囊的Sphingomonas sp.與花蜜中的菌一致表明西方蜜蜂采集大蜜源的生物學(xué)特性。Sphingomonas sp.和Brevundimonas sp.能降低許多殘留于環(huán)境中的油污、農(nóng)藥等化合物，其存在表明環(huán)境有污染物[14-15]，這是在長期的轉(zhuǎn)地飼養(yǎng)過程中，受到運輸過程污染，從而形成獨特的土著細(xì)菌。