胡吉卉，段健誠，高 陽，陳姝含，張慶起，牟 華,3,4，賴曉芳,3,4，高 煥,3,4

(1.江蘇海洋大學 海洋科學與水產(chǎn)學院，江蘇省海洋生物技術(shù)重點實驗室，江蘇 連云港 222005；2.連云港贛榆佳信水產(chǎn)開發(fā)有限公司，江蘇 連云港 222100; 3.江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 連云港 222005； 4.江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護與利用平臺，江蘇 南京 210014)

蝦肝腸胞蟲(Enterocytozoonhepatopenaei)是一種具有高度傳染性的專性細胞內(nèi)寄生蟲，感染后造成蝦類生長緩慢或停滯，是影響全球蝦類養(yǎng)殖生產(chǎn)的重要病原之一[1-2]。目前普遍認為，極管是蝦肝腸胞蟲感染宿主細胞的主要細胞器，當孢子進入宿主體內(nèi)時，由于外界環(huán)境的刺激，孢子內(nèi)部壓力急劇增大，極管外翻并彈出，刺破宿主細胞膜，然后將孢原質(zhì)注射進宿主細胞內(nèi)部。孢原質(zhì)在新的細胞中增殖循環(huán)，最終產(chǎn)生新的孢子，從而實現(xiàn)孢子的繁殖和遺傳物質(zhì)的復(fù)制[3-5]。蝦肝腸胞蟲的主要靶器官為肝胰腺，而肝胰腺也是慢性亞硝態(tài)氮中毒的蝦類中病變最嚴重的器官[6]，同時蝦肝腸胞蟲的傳播也受水質(zhì)條件的影響。蝦肝腸胞蟲的傳播有兩種途徑，一種是母體宿主傳遞到子代宿主的垂直傳播，另一種是通過攝食攜帶蝦肝腸胞蟲的肝胰腺組織或養(yǎng)殖水體的水平傳播[7]。

近年來，蝦肝腸胞蟲的感染率逐年上升，給養(yǎng)殖戶造成了極大的經(jīng)濟損失，嚴重制約了我國蝦類養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。然而，目前針對蝦肝腸胞蟲的研究仍停留在定性或定量檢測階段，尚未研發(fā)出有效的治療藥物，通常是通過調(diào)節(jié)水質(zhì)、降低養(yǎng)殖密度、增強池底排污、控制飼料投喂等方式加以控制[7]。

亞硝態(tài)氮作為氮代謝的中間產(chǎn)物，是水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中主要的污染物之一[6,8]，尤其是在高密度養(yǎng)殖條件下，亞硝態(tài)氮是誘發(fā)蝦類暴發(fā)性疾病的重要因素之一[9]。目前，亞硝態(tài)氮在蝦類中的研究主要集中在其急性或慢性毒性方面[10-13]，蝦肝腸胞蟲在蝦類中的研究主要集中在其對蝦類的生長狀況的影響方面[5,14-15]。已有研究表明，亞硝態(tài)氮脅迫顯著影響甲殼動物的生理代謝、抗氧化能力和免疫功能，增加甲殼動物對病原體的易感性，抑制其生長和變態(tài)發(fā)育[6,16-19]。徐勝威等[20-21]研究表明，一定劑量的亞硝態(tài)氮和氨氮在抑制蝦肝腸胞蟲傳播的同時能促進凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)的生長。而亞硝態(tài)氮、脊尾白蝦(Exopalaemoncarinicauda)和蝦肝腸胞蟲三者之間的內(nèi)在關(guān)系鮮見報道。因此，筆者以脊尾白蝦為試驗對象，探討不同質(zhì)量濃度的亞硝態(tài)氮對脊尾白蝦感染蝦肝腸胞蟲過程中的生長情況及體內(nèi)蝦肝腸胞蟲攜帶量的影響，以期為脊尾白蝦養(yǎng)殖過程中控制蝦肝腸胞蟲的養(yǎng)殖水質(zhì)管理提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用健康脊尾白蝦和病蝦均取自江蘇省南通市如東縣養(yǎng)殖池溏，感染用病蝦用常規(guī)PCR檢測，確認蝦肝腸胞蟲陽性后，-20 ℃凍存。在實驗室進行適應(yīng)性暫養(yǎng)1周后，選取300尾體長(4.1±0.1) cm、體質(zhì)量(1.02±0.05) g、健康活潑的脊尾白蝦用于試驗。

試驗容器為55.2 cm×41.5 cm×30.5 cm的藍色塑料箱。以配制的人工海水為試驗用水，鹽度24±1，水溫(25±1) ℃，pH 8.0±0.2，溶解氧(6.5±0.5) mg/L。亞硝態(tài)氮母液由分析純亞硝酸鈉[生工生物工程(上海)股份有限公司]配制而成。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設(shè)置及日常管理

根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，設(shè)置對照組(0.008 mg/L)和4個亞硝態(tài)氮試驗組，即3.000、6.000、9.000 mg/L和12.000 mg/L，每組2個平行，每個平行放置30尾脊尾白蝦，試驗周期為21 d。試驗期間每日按體質(zhì)量的3%投喂蝦肝腸胞蟲病蝦2次(8：00、20：00)，投喂2 h后吸污，每24 h換10%的等質(zhì)量濃度亞硝態(tài)氮的海水。每日監(jiān)測養(yǎng)殖水體亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度，并用亞硝酸鈉母液穩(wěn)定試驗所需的亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度。

1.2.2 生長指標測定

試驗期間每隔1周從每個平行組中隨機取3尾脊尾白蝦進行體長和體質(zhì)量的測定，并取肝胰腺組織于-20 ℃保存?zhèn)溆?；記錄每組的脊尾白蝦死亡數(shù)量，試驗結(jié)束后計算每組樣品的存活率。

1.2.3 樣品肝胰腺總DNA的提取

取感染蝦肝腸胞蟲的脊尾白蝦肝胰腺組織約25 mg，使用Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]提取脊尾白蝦總基因組DNA，用超微量核酸蛋白測定儀(Q5000，Quawell)測定樣品DNA濃度后于-20 ℃保存。

1.2.4 常規(guī)PCR擴增

1.3.4 福山區(qū)政府政策優(yōu)勢。福山區(qū)政府確立了以特色櫻桃產(chǎn)業(yè)帶動經(jīng)濟發(fā)展、以優(yōu)秀電商模式推動特色櫻桃產(chǎn)業(yè)的雙驅(qū)動模式，不斷提升櫻桃特色產(chǎn)業(yè)的水平，使大櫻桃的電商模式駛?cè)搿翱燔嚨馈薄Ｗ?006年以來，在面對其他大櫻桃地區(qū)的快速發(fā)展時，福山政府推動了櫻桃品牌的創(chuàng)立，大櫻桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展需要品牌意識，以實現(xiàn)利益與品牌價值的捆綁提升，在提高水果質(zhì)量的同時，也提升了品牌認證的力度，不斷地鞏固福山區(qū)大櫻桃的優(yōu)勢地位[1]。

以總基因組DNA為模板，參考劉珍等[1]設(shè)計的定量特異引物(EHP-F:5′-GTA GGG GAA CGG ATA GGG-3′，EHP-R:5′-CAA GCA TTG TCG GCA TAG-3′)進行PCR擴增。采用2×Taq Plus Master Mix Ⅱ(Dye Plus)(南京諾唯贊)的反應(yīng)體系。反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

1.2.5 標準曲線的制備

采用1%瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)對PCR產(chǎn)物進行檢測，觀察其結(jié)果并拍照，使用SanPrep柱式膠回收試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]切膠回收。將得到的目的片段用T3載體在大腸桿菌(Escherichiacoli) DH5α中克隆，克隆的片段送生工生物工程(上海)股份有限公司測序驗證。目的產(chǎn)物的克隆經(jīng)擴大培養(yǎng)后，用質(zhì)粒提取試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]提取質(zhì)粒DNA。采用超微量核酸蛋白測定儀(Q5000，Quawell)測定所提質(zhì)粒的濃度，換算成載量為1.15×1010拷貝/μL。將質(zhì)粒標準品進行10倍梯度稀釋，共得到1.15×106～1.15×1010拷貝/μL的5個梯度，每個梯度3個平行。以循環(huán)閾值為縱坐標，質(zhì)粒標準品拷貝數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線。

1.2.6 實時熒光定量PCR的測定

參照Cham Q Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒說明書準備反應(yīng)體系，反應(yīng)體系為10 μL，包括含有SYBR熒光染料的預(yù)混液(SYBR qPCR Master Mix)5.2 μL，0.4 μL正向引物(EHP-F，10 μmol/L)，0.4 μL反向引物(EHP-R，10 μmol/L)，2 μL模板，2 μL雙蒸水。擴增反應(yīng)在實時熒光定量PCR儀(StepOne-PLUS)中進行。反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。

將不同樣品中蝦肝腸胞蟲基因的表達量所對應(yīng)的循環(huán)閾值與標準曲線相對照，即可計算出樣品的載量。

2 結(jié) 果

2.1 蝦肝腸胞蟲定量PCR標準曲線

質(zhì)粒標準模板在1.15×106～1.15×1010拷貝/μL內(nèi)有明顯擴增，每個質(zhì)量濃度的3個平行循環(huán)閾值的差異符合qPCR要求(圖1)。由圖1可見，r2為0.99656，表明標準曲線線性關(guān)系較好，可用于蝦肝腸胞蟲載量檢測。

2.2 亞硝態(tài)氮對感染蝦肝腸胞蟲的脊尾白蝦的存活率的影響

圖1 蝦肝腸胞蟲實時熒光定量PCR標準曲線Fig.1 Standard curve of E. hepatopenaei (EHP) real-time quantitative PCR

圖2 亞硝態(tài)氮對感染蝦肝腸胞蟲的脊尾白蝦存活率的影響Fig.2 The effect of nitrite nitrogen on the survival rate of ridgetail white prawn infected with EHP

2.3 亞硝態(tài)氮對感染蝦肝腸胞蟲的脊尾白蝦的體長的影響

亞硝態(tài)氮脅迫下，各質(zhì)量濃度組的體長變化基本一致，均呈現(xiàn)單調(diào)遞增的趨勢(圖3)。隨著亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度的升高，各質(zhì)量濃度組間呈現(xiàn)先升后降的趨勢，其中亞硝態(tài)氮6.000 mg/L組的脊尾白蝦體長增長最為明顯，在脅迫21 d后體長達到最大值，平均為4.9 cm，平均增量0.8 cm。在處理7 d后，9.000 mg/L和12.000 mg/L的體長增長較低質(zhì)量濃度組快，但隨著處理時間的延長，高質(zhì)量濃度組的體長增長比低質(zhì)量濃度組慢。結(jié)果表明，一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的亞硝態(tài)氮對感染蝦肝腸胞蟲的脊尾白蝦的體長增長有一定的促進作用，而質(zhì)量濃度過高則會抑制其體長增長。

圖3 亞硝態(tài)氮對感染蝦肝腸胞蟲的脊尾白蝦體長的影響Fig.3 The effect of nitrite nitrogen on the body length of ridgetail white prawn infected with EHP標有不同小寫字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標有相同小寫字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)，下同.Means with different letters are significant differences (P<0.05), and means with the same letter are not significant differences (P>0.05), et sequentia.

2.4 亞硝態(tài)氮對感染蝦肝腸胞蟲的脊尾白蝦的體質(zhì)量的影響

亞硝態(tài)氮脅迫下，各質(zhì)量濃度組的體質(zhì)量隨時間延長均呈增加的趨勢。隨著亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度的升高，各質(zhì)量濃度組間呈現(xiàn)先升后降的趨勢，其中亞硝態(tài)氮6.000 mg/L組的脊尾白蝦體質(zhì)量增長最為明顯，在脅迫21 d后，蝦的體質(zhì)量達到最大值，質(zhì)量增加率為35.33%(表1)。處理7 d后，9.000 mg/L和12.000 mg/L的體質(zhì)量增長比低質(zhì)量濃度組快，但隨著處理時間的延長，高質(zhì)量濃度組的增長比低質(zhì)量濃度組慢。結(jié)果表明，亞硝態(tài)氮在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對感染蝦肝腸胞蟲的脊尾白蝦的體質(zhì)量增長有促進作用，質(zhì)量濃度過高則會抑制其體質(zhì)量增長。

表1 亞硝態(tài)氮對感染蝦肝腸胞蟲的脊尾白蝦體質(zhì)量的影響

2.5 亞硝態(tài)氮對感染蝦肝腸胞蟲的脊尾白蝦的蝦肝腸胞蟲載量的影響

肝胰腺組織中蝦肝腸胞蟲的載量見圖4。各質(zhì)量濃度組的蝦肝腸胞蟲載量隨時間延長的變化趨勢基本一致，呈現(xiàn)單調(diào)遞增的趨勢。處理21 d后，各亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度組間蝦肝腸胞蟲載量隨亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度的升高呈現(xiàn)先降后升的趨勢，其中亞硝態(tài)氮6.000 mg/L組的蝦肝腸胞蟲載量達到最低值，為4.4×103拷貝/mg。處理7 d后，9.000 mg/L和12.000 mg/L的載量增長比低質(zhì)量濃度組慢，但隨著處理時間的延長，高質(zhì)量濃度組的載量增長比低質(zhì)量濃度組快。結(jié)果表明，一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的亞硝態(tài)氮會抑制蝦肝腸胞蟲的增殖，從而促進感染蝦肝腸胞蟲的脊尾白蝦的生長。

圖4 亞硝態(tài)氮對脊尾白蝦感染蝦肝腸胞蟲載量的影響Fig.4 The effect of nitrite nitrogen on the EHP carrying amount of ridgetail white prawn

3 討 論

3.1 亞硝態(tài)氮對感染蝦肝腸胞蟲的脊尾白蝦的存活及生長情況的影響

亞硝態(tài)氮是蝦類集約化養(yǎng)殖過程中最常見的毒性污染物之一，主要來源于蝦類代謝廢物、死亡個體及殘余餌料的分解作用[8]。通常認為亞硝態(tài)氮在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對水產(chǎn)動物無毒害作用[22]，隨著養(yǎng)殖周期的延長，亞硝態(tài)氮的積累量增多，通常在養(yǎng)殖水體中的亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度超過0.1 mg/L時，會引起蝦類免疫功能下降及組織器官損傷，誘發(fā)多種疾病[11,23]。研究表明：亞硝態(tài)氮脅迫后紅螯螯蝦(Cheraxquadricarinatus)的免疫酶活性顯著降低，肝胰腺和鰓形態(tài)學結(jié)構(gòu)受損[24]；亞硝態(tài)氮與氨氮脅迫可能會抑制日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)肝胰腺血紅蛋白的合成及血糖調(diào)節(jié)[25]；高濃度亞硝態(tài)氮會破壞日本沼蝦的肝胰腺結(jié)構(gòu)，影響其體內(nèi)酶的催化作用和細胞膜的穩(wěn)定性[26]；在高密度養(yǎng)殖后期，池塘中亞硝酸氮的質(zhì)量濃度高達20 mg/L[24]，造成蝦類的大量死亡[25]。一般認為，Cl-的濃度越高，競爭吸收進入蝦體內(nèi)的NO2-就越少，因此海水蝦類對亞硝態(tài)氮的耐受能力要普遍高于淡水蝦類[6,27-28]。為使脅迫效應(yīng)更加顯著，筆者選定了較高的亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度，試驗過程中發(fā)現(xiàn)，隨著亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度的升高，感染蝦肝腸胞蟲的脊尾白蝦的存活率呈現(xiàn)先升后降的趨勢，其中6.000 mg/L組的存活率最高，這與徐勝威等[21]的研究結(jié)果攜帶蝦肝腸胞蟲的凡納濱對蝦隨亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度升高存活率呈先升后降的趨勢一致。本試驗中，當亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度達到12.000 mg/L時，脊尾白蝦的死亡率急劇增加，分析可能是由于較高質(zhì)量濃度的亞硝態(tài)氮脅迫，毒性作用增強，導致脊尾白蝦的耐受性和免疫力降低，從而引起其大量死亡。

3.2 亞硝態(tài)氮對感染蝦肝腸胞蟲的脊尾白蝦的蝦肝腸胞蟲載量的影響

近年來，蝦肝腸胞蟲已成為制約蝦類養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的主要病害之一，造成了巨大的經(jīng)濟損失[29]。劉珍[30]發(fā)現(xiàn)，人工投喂冰凍和鮮活病蝦的肝胰腺組織均能使健康的凡納濱對蝦感染蝦肝腸胞蟲，說明蝦肝腸胞蟲具有抵御低溫的能力，這為生產(chǎn)上蝦肝腸胞蟲的預(yù)防和治療增加了困難。蝦類的肝胰腺為蝦肝腸胞蟲提供了最適宜的寄生條件，因此蝦肝腸胞蟲主要感染蝦類的肝胰腺[31]，而蝦肝腸胞蟲本身沒有合成腺苷三磷酸的能力，完全依賴于截取宿主的腺苷三磷酸來獲取營養(yǎng)，從而影響肝胰腺和腸道的正常消化吸收功能，阻礙宿主的正常生長和肌肉蛋白的積累[5,32-33]。程東遠[5]研究發(fā)現(xiàn)，宿主腺苷三磷酸的含量與蝦肝腸胞蟲的載量顯著負相關(guān)，劉珍等[1]通過實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，當對蝦肝胰腺中EHP SSU rDNA的相對拷貝數(shù)在103拷貝/ng數(shù)量級或蝦肝腸胞蟲載量指數(shù)在3以上時，蝦肝腸胞蟲已處于較高的風險水平，且蝦類的體長、體質(zhì)量等生長指標與蝦肝腸胞蟲的載量顯著負相關(guān)。本試驗中，亞硝態(tài)氮6.000 mg/L組的蝦肝腸胞蟲載量最低，為4.4×103拷貝/mg，推測是因為亞硝態(tài)氮通過呼吸作用進入蝦體內(nèi)，引起組織缺氧，攝食減少，損傷肝胰腺及腸道，導致機體合成腺苷三磷酸的能力下降，蝦肝腸胞蟲不能獲取足夠的能量，生長發(fā)育受到抑制，因此蝦類攜帶蝦肝腸胞蟲的量減少[34]。本試驗結(jié)果表明，亞硝態(tài)氮6.000 mg/L組抑制蝦肝腸胞蟲增殖的效果是最好的。

4 結(jié) 論

綜上所述，在一定質(zhì)量濃度內(nèi)(<6.000 mg/L)，亞硝態(tài)氮可抑制蝦肝腸胞蟲的生長繁殖，從而促進感染蝦肝腸胞蟲的脊尾白蝦的生長，而較高質(zhì)量濃度(6.000～12.000 mg/L)的亞硝態(tài)氮對感染蝦肝腸胞蟲的脊尾白蝦的生長不利，高質(zhì)量濃度(≥12.000 mg/L)的亞硝態(tài)氮會引起感染蝦肝腸胞的脊尾白蝦死亡。