韓 語(yǔ)，潘紀(jì)汶，王 昕，楊 諾，郭桂英，李 遷，曾紀(jì)鋒，鄭繼平

(1.海南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，海南 ?？?570228； 2.海南大學(xué) 理學(xué)院，海南 海口 570228；3.海南大學(xué) 網(wǎng)絡(luò)與技術(shù)中心，海南 ?？?570228； 4.海南大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，海南 海口 570228)

泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，需求量不斷增加，因而泥鰍養(yǎng)殖業(yè)的市場(chǎng)前景廣闊，在國(guó)內(nèi)和國(guó)際市場(chǎng)的銷路甚廣，經(jīng)濟(jì)效益良好[1]。近年來(lái)泥鰍病害問題日益嚴(yán)重,其中氣單胞菌屬的病原細(xì)菌危害尤其嚴(yán)重，影響了泥鰍的健康養(yǎng)殖。維氏氣單胞菌 (Aeromonasveronii) 是一種常見的弧菌科氣單胞菌屬的革蘭氏陰性短桿菌[2]，主要存在于各種水體和土壤中，不僅可感染水產(chǎn)類動(dòng)物導(dǎo)致大量死亡[3]，還可引起人類的敗血癥、腦膜炎、腸胃炎、腹腔感染、呼吸道感染等疾病[4-5]。維氏氣單胞菌是一種條件性致病菌，其感染傷口的過(guò)程主要包括：在傷口位置的附著和初始定殖；菌體合成并釋放蛋白酶, 降解宿主細(xì)胞蛋白并以此為能量來(lái)源，進(jìn)行菌株增殖；通過(guò)細(xì)菌的趨化特性，遷移至深層組織[6]，并在多種毒力因子的共同協(xié)作下造成感染部位的局部損傷。此外，毒力較強(qiáng)的病原菌會(huì)從感染部位擴(kuò)散到其他組織、器官，造成機(jī)體損傷、死亡。因此，探討泥鰍體內(nèi)維氏氣單胞菌毒力基因攜帶和耐藥特性的關(guān)系，查明其致病機(jī)制及控制維氏氣單胞菌，對(duì)泥鰍養(yǎng)殖的危害有重要的意義。

筆者自海南省和廣東省的6家泥鰍養(yǎng)殖場(chǎng)中，篩選分離得到20株分離菌，其中海南源7株、廣東源13株。經(jīng)過(guò)生理生化鑒定、gryA管家基因鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析，確定這20株均為維氏氣單胞菌，并對(duì)20株維氏氣單胞菌進(jìn)行相關(guān)的毒力基因和耐藥基因檢測(cè)以及抗生素藥物敏感性的測(cè)定，以期查明泥鰍中維氏氣單胞菌毒力基因攜帶和耐藥特性，為泥鰍養(yǎng)殖生產(chǎn)中維氏氣單胞菌的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

酵母提取物、蛋白胨(英國(guó)OXOID公司)；LB瓊脂培養(yǎng)基(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)；氨芐青霉素(Biosharp公司)；藥敏紙片(杭州天和微生物試劑有限公司)；細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒、DNA 5000 Marker和DNA 2000 Marker(南京諾唯贊生物科技有限公司)；2×F8 Fast Long PCR Master mix(北京艾德萊生物科技有限公司)；瓊脂糖凝膠(法國(guó)Biowest公司)。

1.2 樣品來(lái)源和細(xì)菌分離

46尾泥鰍分別來(lái)自于2019年海南省和廣東省的6家泥鰍養(yǎng)殖場(chǎng)。無(wú)菌采集泥鰍的鰓部、潰瘍部位、腎臟和肝臟樣品，接種于含有50 μg/mL氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)24～48 h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)狀態(tài)，挑取形態(tài)規(guī)格一致優(yōu)勢(shì)菌株劃線培養(yǎng)，獲得純培養(yǎng)菌株。

1.3 細(xì)菌形態(tài)及理化特性鑒定

取分離純化后的菌株，劃線接種于含有50 μg/mL氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)狀態(tài)，挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察其形態(tài)大小。將純化的菌株接種到生化微量管中，參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[7]及細(xì)菌生化微量鑒定管操作說(shuō)明書進(jìn)行分離菌株的生化特性的檢測(cè)。

1.4 gyrA管家基因序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析

利用細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒提取分離菌株的基因組DNA，以其為模板，采用細(xì)菌結(jié)核分枝桿菌DNA旋轉(zhuǎn)酶A亞單位編碼基因(gyrA)管家基因引物(F:5′-ATGAGCGATCTGGCCA GAGA-3′，R:5′-CGCGCCTTGTTCACCTGATA-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。將PCR產(chǎn)物委托廣州天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。將分離菌株的gyrA管家基因測(cè)序結(jié)果與已知GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，利用MEGA X軟件進(jìn)行同源性分析，通過(guò)鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[8]。

1.5 毒力基因的檢測(cè)

以分離菌株的基因組為模板，采用PCR方法[6]檢測(cè)Ⅲ型分泌系統(tǒng)內(nèi)膜組分基因ascV、ADP-核糖基化毒素基因aexT、胞外毒力因子氣溶素基因aer、細(xì)胞興奮性腸毒素基因alt、細(xì)胞毒性腸毒素基因act、熱穩(wěn)定腸毒素基因ast、磷脂酶基因lip、彈性蛋白酶基因ela、鞭毛蛋白基因fla 9個(gè)毒力基因是否存在，引物[9-11]見表1。

1.6 耐藥基因檢測(cè)及藥物敏感性試驗(yàn)

以分離菌株的基因組為模板，采用PCR方法[11]進(jìn)行喹諾酮類耐藥基因qnrA、qnrS，四環(huán)素類耐藥基因tetA、tetC，磺胺類耐藥基因sul1，β-內(nèi)酰胺類耐藥基因tem、ctxM，酰胺醇類耐藥基因catA2，大環(huán)類酯類ermB，林可霉素類耐藥基因linA/linA′10個(gè)耐藥基因的檢測(cè)，耐藥基因檢測(cè)引物[12-15]見表2。

此外，利用紙片擴(kuò)散法測(cè)定分離菌株對(duì)14種抗生素的敏感性，根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室藥敏操作標(biāo)準(zhǔn)[16]，通過(guò)產(chǎn)生的抑菌圈直徑大小判定分離菌株對(duì)藥物的敏感性，可分為耐藥(R)、中度敏感(I)和高度敏感(S)。以大腸桿菌(Escherichiacoli)ATCC 25922作為藥敏試驗(yàn)的質(zhì)量控制菌株。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株的形態(tài)特征與生理生化測(cè)定

從46尾泥鰍樣品中分離純化獲得20株優(yōu)勢(shì)菌株，暫命名為HN-1～HN-7和GD-1～GD-13。其在LB瓊脂培養(yǎng)基上均形成圓形菌落，表面光滑濕潤(rùn)、邊緣整齊、中央隆起、灰白色、不透明；革蘭氏染色檢查均為革蘭氏陰性桿菌，菌體短小，多為單個(gè)排列，無(wú)芽孢，無(wú)莢膜。分離菌株的生理生化測(cè)定結(jié)果見表3。分離菌株具有氧化酶陽(yáng)性，能發(fā)酵葡萄糖和甘露醇，不能發(fā)酵乳糖、阿拉伯糖和肌醇，并水解水楊苷等生理生化特征，參照文獻(xiàn)[16-17]可初步判定這20株分離菌株均為維氏氣單胞菌。

2.2 gyrA管家基因序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

20株分離菌株的gyrA管家基因經(jīng)PCR擴(kuò)增后，獲得的片段均為760 bp，與預(yù)期大小一致。對(duì)20株分離菌株的gyrA管家基因序列進(jìn)行BLAST分析，構(gòu)建進(jìn)化樹(圖1)。根據(jù)測(cè)序分析結(jié)果可知，20株分離菌株在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心中與維氏氣單胞菌BVH25b [KP401464.1]和維氏氣單胞菌AVNIH1[CP047155.1]菌株的同源性達(dá)97%，且在系統(tǒng)發(fā)育樹中位于同一進(jìn)化分支。因此，結(jié)合各個(gè)菌株的表型特征、生理生化特性鑒定與gyrA管家基因序列分析，可以判定菌株 HN-1～HN-7、GD-1～GD-13均為維氏氣單胞菌。

表3 20個(gè)分離株的主要生化特征

2.3 毒力基因檢測(cè)

海南源和廣東源分離菌株中aer和fla基因的檢測(cè)率均為100%；ela和act基因在海南源分離菌株中檢測(cè)率達(dá)100%，而廣東源分離菌株中檢測(cè)率均為92.31%；aexT基因在海南源和廣東源的分離菌株中均有較高檢測(cè)率，檢測(cè)率達(dá)到85.71%和61.54%；ascV基因存在于14.29%的海南源分離菌株，以及53.85%的廣東源分離菌株中；alt和lip基因分別存在于71.43%和85.71%的海南源分離菌株中，均存在于46.15%的廣東源分離菌株中；ast基因在海南源和廣東源分離菌株中未被檢測(cè)到(表4)。

2.4 藥物敏感性與耐藥基因檢測(cè)

20株分離菌株的耐藥基因檢測(cè)結(jié)果(表5)表明：分離菌株中喹諾酮類藥物耐藥基因 qnrA、qnrS以及磺胺類藥物耐藥基因sul1陽(yáng)性率均為100%；同時(shí)，四環(huán)素類藥物耐藥基因tetA陽(yáng)性檢出率為95%，其中海南源(100%)分離菌株的檢出率高于廣東源(92.31%)，而四環(huán)素類藥物耐藥基因tetC陽(yáng)性檢出率為20%，其中海南源(42.86%)的檢出率比廣東源(7.69%)高；此外，β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥基因tem陽(yáng)性檢出率為45.00%，海南源檢出率(75.43%)比廣東源(30.77%)高，而β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥基因ctxM陽(yáng)性檢出率為5.00%，海南源檢出率(0%)比廣東源(7.69%)低；而酰胺醇類藥物耐藥基因catA2、大環(huán)類酯類ermB、林可霉素類藥物耐藥基因linA/linA′在所有分離菌株中均未檢測(cè)到。

圖1 通過(guò)鄰居連接法構(gòu)建基于gyrA基因的20個(gè)分離菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 The phylogenetic tree of 20 isolated strains based on gyrA gene by the neighbor connection method

表4 泥鰍源維氏氣單胞菌的毒力基因結(jié)果

表5 泥鰍源維氏氣單胞菌的耐藥基因結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果(表6)表明：20株分離菌株對(duì)磺胺類抗生素甲氧芐啶、喹諾酮類抗生素萘啶酸和諾氟沙星、林可霉素類抗生素林可霉素、四環(huán)素類抗生素四環(huán)素、大環(huán)類酯類抗生素紅霉素和β-內(nèi)酰胺類抗生素氨芐西林具有較高的耐藥性，耐藥率均為100%；同樣，這些分離菌株對(duì)亞胺培南(85%)的耐藥率較高，海南源菌株耐藥率比廣東源菌株高；相反，20株維氏氣單胞菌菌株對(duì)氨曲南(100%)、氨芐西林舒巴坦(100%)以及頭孢噻吩(80%)、頭孢噻肟(80%)、慶大霉素(90%)和氯霉素(55%)均具有敏感性，其中海南源菌株敏感率比廣東源菌株高。

表6 泥鰍源維氏氣單胞菌的藥敏結(jié)果 %

3 討 論

3.1 維氏氣單胞菌的鑒定分析

根據(jù)文獻(xiàn)[17]進(jìn)行細(xì)菌生理生化特性鑒定和分子遺傳學(xué)鑒定，但存在耗時(shí)長(zhǎng)、工作量大、敏感度低、技術(shù)及經(jīng)驗(yàn)要求高等缺點(diǎn)。20株分離菌的葡萄糖、甘露醇和氧化酶活性等生理生化反應(yīng)均為陽(yáng)性，生化特性與維氏氣單胞菌一致。基于前期的經(jīng)驗(yàn)，采用16S rRNA難以進(jìn)行種間區(qū)分，常規(guī)采用gyrA和rpoD基因，發(fā)現(xiàn)gyrA基因特異性更為明顯[18]，單一采用gyrA基因可以達(dá)到結(jié)合兩種基因的同等鑒定效果。因此，筆者采用生理生化特性檢測(cè)和gyrA管家基因序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建進(jìn)行細(xì)菌分類鑒定，彼此相互印證，從而可初步判斷20株分離菌株均為維氏氣單胞菌。

3.2 維氏氣單胞菌毒力基因檢測(cè)分析

根據(jù)已有的研究結(jié)果，維氏氣單胞菌可引起大刺鰍(Mastacembelusarmatus)、中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)、尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)、鰻鱺(Anguillajaponica)、西伯利亞鱘(Acipenserbaerii)等水產(chǎn)動(dòng)物發(fā)病[4,19-21]，可見維氏氣單胞菌致病具有多宿主性。目前普遍認(rèn)為，維氏氣單胞菌的致病性與其攜帶的多種毒力因子相關(guān)。本次試驗(yàn)中，20株維氏氣單胞菌均檢測(cè)到氣溶素基因aer，氣溶素具有溶血性、細(xì)胞毒性、腸毒性等特點(diǎn)，還可破壞宿主細(xì)胞膜的通透性，引起多種內(nèi)臟與體表廣泛性出血，是維氏氣單胞菌主要毒力因子之一[2]。本次試驗(yàn)中，所有分離的維氏氣單胞菌中未檢測(cè)出ast基因，ascV基因檢出率較低，而另外7種毒力基因檢出率均超過(guò)50%，鞭毛基因fla檢出率高達(dá)100%，且不論海南或廣東地區(qū)的維氏氣單胞菌中彈性蛋白酶基因ela和細(xì)胞毒性腸毒素基因act的攜帶率均偏高。這些毒力基因的存在可能會(huì)大大增強(qiáng)維氏氣單胞菌的致病性，在溫度、缺氧、水質(zhì)惡化等環(huán)境壓力下，誘發(fā)疾病發(fā)生，對(duì)泥鰍養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重危害。

3.3 維氏氣單胞菌耐藥特性分析

由于水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物受外界環(huán)境以及所用的抗菌藥物種類和頻率不同，所以維氏氣單胞菌不同分離株對(duì)藥物的敏感性也有差異。林煜等[19]通過(guò)檢測(cè)維氏氣單胞菌的耐藥基因發(fā)現(xiàn)，其存在磺胺類耐藥基因，且對(duì)環(huán)丙沙星、氟苯尼考、頭孢哌酮等藥物敏感，對(duì)四環(huán)素、磺胺異惡唑、苯唑西林藥物耐藥。潘吉脈等[22]發(fā)現(xiàn)，維氏氣單胞菌對(duì)頭孢他啶、慶大霉素、紅霉素等8種藥物高度敏感，對(duì)氟苯尼考、恩諾沙星、多黏菌素B等12種藥物耐藥。方振華等[23]報(bào)道，維氏氣單胞菌對(duì)多數(shù)抗菌藥較為敏感，對(duì)羅紅霉素、妥布霉素、新霉素中度敏感，僅對(duì)少數(shù)抗菌藥物如氨芐西林和青霉素耐藥。本試驗(yàn)結(jié)果表明：20株維氏氣單胞菌中四環(huán)素類藥物耐藥基因tetA、喹諾酮類藥物耐藥基因qnrA、qnrS以及磺胺類藥物耐藥基因sul1檢出率較高，其中qnrA、qnrS和sul1耐藥基因檢出率高達(dá)100%；而酰胺醇類藥物耐藥基因catA2、大環(huán)類酯類耐藥基因ermB、林可霉素類藥物耐藥基因linA/linA′在維氏氣單胞菌中均未檢測(cè)到。此外，20株維氏氣單胞菌對(duì)其他β-內(nèi)酰胺類抗生素中的頭孢菌素類和氨基糖苷類的敏感率較高，而對(duì)碳青霉烯類抗生素、磺胺類抗生素、喹諾酮類抗生素、β-內(nèi)酰胺類抗生素中的青霉素類、林可霉素類、四環(huán)素類和大環(huán)類酯類耐藥率較高。本次試驗(yàn)中，抗生素藥物敏感性檢測(cè)結(jié)果與耐藥基因檢測(cè)結(jié)果基本一致。

4 結(jié) 論

本次采集的20株海南源和廣東源泥鰍維氏氣單胞菌中毒力基因和耐藥基因檢出率均較高，對(duì)氨芐西林、紅霉素和四環(huán)素等抗生素具有較高耐藥性。本研究結(jié)果對(duì)泥鰍維氏氣單胞菌感染的防控具有參考意義。