解 斌，安秀紅，陳艷輝*，程存剛*，趙德英，康國棟，周江濤，李 壯，張艷珍，楊 安，李 鑫

（1 中國農(nóng)業(yè)科學院果樹研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部園藝作物種質(zhì)資源利用重點實驗室/遼寧省落葉果樹礦質(zhì)營養(yǎng)與肥料高效利用重點實驗室，遼寧興城 125100；2 河北省國家北方山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術研究中心/河北農(nóng)業(yè)大學山區(qū)研究所，河北保定 071001）

氮是植物生長發(fā)育的必需營養(yǎng)元素之一，在氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸和激素等植物大分子物質(zhì)的代謝途徑中起關鍵作用，是植物生長發(fā)育的重要調(diào)控因子[1–3]，且在植物適應逆境過程中發(fā)揮積極作用。蘋果是重要的溫帶落葉果樹之一，在其生長發(fā)育過程中對氮素有較大需求，土壤氮素虧缺會造成植物葉片黃化，葉綠素含量降低，光合能力減弱，阻礙植物的生長發(fā)育；此外，植物氮吸收量減少，會降解體內(nèi)蛋白質(zhì)以重新利用氮素，往往會導致葉片加速衰老，生物量積累降低[4]。生產(chǎn)中多因氮肥施用不當如施肥量不合理、施肥時期不科學等，造成氮肥利用率低、資源浪費及環(huán)境污染等問題[5]。因此，利用植物自身遺傳特性，挖掘其自身養(yǎng)分利用潛力，在適度減氮條件下篩選耐低氮和氮高效吸收利用的砧木對蘋果產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。研究表明，與銨態(tài)氮(NH4+)、尿素等形態(tài)相比，硝態(tài)氮(NO3–)在促進果樹營養(yǎng)生長中的作用更為顯著[6]。NO3–不易被土壤膠體吸附，移動性較高，可被植株通過根的表皮和皮層細胞從土壤中迅速吸收利用[7]。因此，根系的形態(tài)可塑性反應影響植株對氮的吸收、積累與分配[8–9]，而土壤氮素含量對根系構型也具有顯著影響。在對玉米[10]、油菜[11]、糜子[12]等的研究中發(fā)現(xiàn)，低氮處理使得植株總根長、根表面積及根體積等均顯著高于正常供氮處理，根冠比顯著升高，且不同品種或基因型對低氮的響應存在差異[13–14]。此外，依靠硝酸還原酶(NR)等的作用實現(xiàn)NO3–在植物體內(nèi)的高效轉運和利用，以供植物生長發(fā)育所需，因此，NR活性能反映植株的營養(yǎng)狀況以及NO3–同化水平[15]。砧木作為果樹的重要組成部分，為其提供根系，直接影響果樹對養(yǎng)分的吸收及對逆境的適應能力。有研究報道，柑橘不同砧木間以及嫁接接穗后樹體養(yǎng)分吸收及抗逆性均存在較大差異[16–17]。康曉育[18]比較了山定子、八棱海棠、平邑甜茶等5種蘋果喬化砧后發(fā)現(xiàn)，低氮條件下山定子的根冠比增幅較大，而平邑甜茶和八棱海棠的氮利用效率較高。近年來利用從國外引進的T337、B9、Pajam2等矮化自根砧栽培模式在各蘋果主產(chǎn)區(qū)逐步推廣，該模式相較于過去國內(nèi)常用的喬化砧、矮化中間砧栽培模式，具有矮化效果顯著、苗木整齊度高、節(jié)省勞動力、早果豐產(chǎn)性好等顯著優(yōu)勢，然而國外引進砧木在國內(nèi)的適應能力有待考究[19–20]，同時國內(nèi)自育的部分矮化砧木對低氮脅迫的響應尚不明確。植物對低氮脅迫的響應往往從植物生長發(fā)育、生理生化過程等多方面進行。適宜的多指標綜合評價方法可全面反映作物不同品種耐低氮脅迫的能力。目前，這類報道主要集中在小麥、玉米、水稻等大田作物上，有關蘋果砧木特別是矮化砧對低氮脅迫的適應性評價則少有研究[21–23]。本研究以7種蘋果砧木為材料，通過盆栽沙培試驗的方法，研究在正常供氮和低氮脅迫條件下樹體生長、根系形態(tài)及其對氮素的累積及代謝的特征，利用隸屬函數(shù)綜合評價方法比較砧木間適應能力的差異，以期為耐低氮蘋果砧木的選育及蘋果高效吸收利用氮素生理機制的研究提供理論支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試一年生蘋果砧木共7種，其中，矮化砧包括T337、Nic29、Pajam2、B9、71-3-150，半矮化砧為青砧2號(Qingzhen 2)和喬化砧為山定子(Malus baccataL. Borkh.)。2019 年秋季定植于上口徑 36 cm、下口徑32 cm、高29 cm的黑色加侖盆中，栽培基質(zhì)為洗凈的河沙(25 kg)，放置在遼寧省興城市中國農(nóng)業(yè)科學院果樹研究所溫泉試驗基地蘋果栽培示范園避雨棚內(nèi)，定期澆灌改良1/2 Hoagland營養(yǎng)液以確保植株正常生長。

1.2 試驗設計

試驗于2020年秋梢生長期(7月1日)開始，每種砧木選擇40株長勢基本一致的健康植株進行試驗處理，每個處理20株，單株重復。處理采用澆灌改良1/2 Hoagland營養(yǎng)液的方法進行，正常供氮處理(NN，5 mmol/L NO3–)的營養(yǎng)成分為 Ca (NO3)2·4H2O 2 mmol/L、KNO31 mmol/L；低氮脅迫處理 (LN，0.5 mmol/L NO3–)的營養(yǎng)成分為 KNO30.5 mmol/L。其他中量元素 (MgSO4·7H2O 2 mmol/L)，微量元素(EDTA-Fe 0.05 mmol/L、MnSO4·H2O 0.5 mmol/L、CuSO4·5H2O 0.0005 mmol/L、ZnSO4·7H2O 0.15 mmol/L、H3BO30.5 mmol/L、Na2MoO4·4H2O 0.005 mmol/L)，調(diào)節(jié)pH為5.9～6.5。低氮處理下，其他成分不變，缺少的Ca2+用CaCl2補足，缺少的K+用KCl補足。每隔 15 天澆透水一次 (1.5 L/盆)，持續(xù)處理60 天。常規(guī)管理，保證其他試驗條件一致。

1.3 樣品采集及測定

1.3.1 植株生長勢和生物量積累 在試驗處理前期(ti)，在供試植株中部選擇3個長勢中庸、無分枝的當年生新稍作為觀測枝，標記后使用卷尺(精確度0.1 cm)測定長度(Hi)，在處理60 天(tf)后再次測量長度(Hf)，分別計算新稍生長速率(Ah)=(Hf–Hi) /(tf–ti)，式中，Hf代表處理結束時新稍長度，Hi代表處理前新稍長度，(tf–ti)表示處理時間間隔[24]。之后，在不同供氮條件下各砧木分別選擇5株具有代表性的植株進行株解，用去離子水反復沖洗干凈后用吸水紙吸干表面水分，使用千分之一天平分別測定植株葉片、莖干及根系鮮重。

1.3.2 根系形態(tài)分析 待根系鮮重測定后，用EPSON掃描儀及WinRHIZO根系圖像分析軟件(Regent Instruments Inc.，加拿大)獲取根系形態(tài)的相關指標，如根系總表面積、總根長、根系總體積、根尖數(shù)、根系平均直徑和根系分枝數(shù)等。

1.3.3 氮含量測定 植株形態(tài)指標測定后將植株于105℃殺青30 min，80℃烘干至恒重，用萬分之一天平測定植株各器官干重用于計算根冠比，之后用不銹鋼磨樣機將樣品粉碎，過0.18 mm篩后保存?zhèn)溆?。取烘干過篩后的樣品0.3 g經(jīng)H2O2?H2SO4法消煮后，使用K9860全自動凱氏定氮儀(海能，中國)測定植株氮含量；以各器官氮含量與干重的乘積計算各器官氮累積量；以單株總干物質(zhì)量與氮總累積量的比值衡量氮利用效率[25]。

1.3.4 耐低氮能力評價

不同砧木各指標的隸屬函數(shù)值計算：

式中，μ(Xj)表示第j個指標的隸屬函數(shù)值，Xj表示第j個指標的耐低氮脅迫指數(shù)；Xmax表示第j個指標的耐低氮脅迫指數(shù)的最大值，Xmin表示第j個指標的耐低氮脅迫指數(shù)的最小值。

利用熵值法計算各指標權重系數(shù)：

式中，Wj表示第j個指標在指標中的重要程度，即權重；Pj為各品種第j個綜合指標的方差貢獻率。

式中，I表示在低氮條件下各砧木耐低氮能力的綜合評價值[26]，Xj、Wj同上。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

用Excel 2010和SAS 9.0進行數(shù)據(jù)處理分析及圖表制作。使用單因素方差分析(One-way ANOVA)比較樣本間的差異，對差異顯著者采用Duncan’s多重檢驗(P<0.05為顯著)比較，使用類平均法進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 不同供氮條件對蘋果砧木生長的影響

在正常供氮條件下，7種蘋果砧木的新梢生長速率大小依次為Nic29>T337>71-3-150>B9>山定子>Pajam2>青砧2號(圖1-A)，由此可知，Nic29的新梢長勢強于山定子、青砧2號和其余矮化砧。與正常供氮相比，低氮條件下，T337、Nic29和山定子的新稍生長均受到顯著抑制；B9、Pajam2和青砧2號的新稍生長未受顯著影響；而71-3-150的新稍生長速率增幅最大，其新稍生長速率顯著高于其余砧木。由圖1-B可知，在正常供氮條件下，7種蘋果砧木中Pajam2的平均葉面積最大，而71-3-150最小。與正常供氮相比，低氮條件下，Pajam2和山定子的葉面積顯著減小，而T337、B9、71-3-150顯著增大。

圖1 不同供氮條件下蘋果砧木新梢生長和平均葉面積的差異Fig.1 Shoot growth and leaf area of apple rootstocks under different nitrogen supply conditions

2.2 不同供氮條件對蘋果砧木物質(zhì)積累和根冠比的影響

由圖2-A可知，在正常供氮條件下，喬化砧山定子和半矮化砧青砧2號的植株總干重和根冠比顯著高于5種矮化砧；矮化砧中Pajam2的干物質(zhì)積累量最大，B9的根冠比最高。與正常供氮相比，低氮條件下，T337和B9的植株總干重顯著降低，其中T337的植株葉片、莖干和根系的干重均顯著降低(圖2-C)，根冠比亦顯著減?。黄溆嗾枘靖诒染噬仙厔?，其中B9、71-3-150和Nic29的增幅顯著，三者的根冠比分別增長為對照的1.64、2.59和1.34 倍 (圖2-B)。

圖2 不同供氮條件下蘋果砧木干重及根冠比Fig.2 Dry weight and ratio of root/shoot of apple rootstocks under different nitrogen supply conditions

2.3 不同供氮條件下蘋果砧木根系形態(tài)變化

在正常供氮條件下，喬化砧山定子的根尖數(shù)和根系分枝數(shù)均顯著高于青砧2號和5種矮化砧，T337的根系總表面積和總根長顯著高于其余矮化砧(B9、71-3-150、Nic29和Pajam2)。低氮條件下，不同蘋果砧木根系形態(tài)的變化趨勢存在顯著差異。如表1所示，與正常供氮相比，低氮條件下，71-3-150和Nic29的根系總表面積均顯著升高，此外，71-3-150的總根長、根系總體積、根尖數(shù)和根系分枝數(shù)等增幅顯著。與正常供氮相比，低氮處理使得T337、B9、Pajam2和山定子根系總表面積和總根長均顯著降低，T337的降幅最大，其根系總表面積和總根長分別降低了86.04%和88.57%。

表1 蘋果砧木根系形態(tài)及低氮處理相較于正常氮處理的比值Table 1 Root morphological characteristics and the ratio of apple rootstocks under low N supply relative to normal N supply condition

2.4 不同供氮條件對蘋果砧木硝酸還原酶活性的影響

由圖3-A可知，在正常供氮條件下，7種蘋果砧木的葉片硝酸還原酶(NR)活性大小依次為Nic29>Pajam2> B9、山定子>71-3-150>青砧 2 號>T337；由圖3-B可知，青砧2號的根系NR活性顯著高于其余6種砧木，而矮化砧中，T337和71-3-150的根系NR活性顯著高于B9、Nic29和Pajam2。與正常供氮相比，低氮條件下，7種蘋果砧木葉片及根系中NR活性均發(fā)生顯著改變。與正常供氮相比，低氮條件下7種砧木葉片NR活性均顯著降低，其中，Pajam2和山定子降幅較大，分別降低了67.21%和64.52%。低氮脅迫對T337和71-3-150根系NR活性的影響不明顯，卻使青砧2號的根系NR活性降低了74.60%；低氮條件下，B9、Nic29、Pajam2和山定子根系NR活性分別較正常供氮提高了3.70、5.16、2.85和5.14倍。

圖3 不同供氮條件下蘋果砧木葉片(A)及根系(B)硝酸還原酶(NR)活性Fig.3 Activities of nitrate reductase (NR) in leaves (A) and roots (B) of apple rootstocks under different nitrogen supply conditions

2.5 不同供氮條件對蘋果砧木氮吸收利用的影響

由圖4-A可知，在正常供氮條件下，青砧2號的植株總氮累積量顯著高于山定子和矮化砧。與正常供氮相比，低氮條件下7種蘋果砧木植株氮累積量均發(fā)生變化，71-3-150的植株氮累積量顯著升高，增幅為66.26%；低氮脅迫使T337、B9、Nic29、Pajam2、山定子和青砧2號的植株氮累積量降低，青砧2號的植株氮累積量降幅最大。由圖4-B可知，在正常供氮條件下，山定子的氮利用效率高于其余砧木，71-3-150和Pajam2的氮利用效率顯著高于青砧2號、T337、B9和Nic29。與正常供氮相比，低氮條件下，B9、Nic29、Pajam2和青砧2號的氮利用效率均顯著提高，青砧2號增幅最大。此外，低氮條件下，山定子和Pajam2的氮利用效率顯著高于其余5種砧木。分析圖4-C可知，與正常供氮相比，低氮條件下T337、B9和Pajam2的葉片氮累積量顯著降低，T337和Pajam2的根系氮累積量顯著降低，B9、Nic29和青砧2號的莖干氮累積量也顯著降低，而71-3-150的根系和葉片的氮累積量顯著升高。

圖4 不同供氮條件下蘋果砧木氮累積量和氮利用效率Fig.4 Nitrogen accumulation and nitrogen use efficiency in apple rootstocks under different nitrogen supply conditions

2.6 蘋果砧木耐低氮能力綜合評價

以上述各指標的相對值為變量，利用模糊隸屬函數(shù)對7種蘋果砧木的耐低氮能力進行綜合評價，結果表明，7種蘋果砧木耐低氮脅迫能力依次為71-3-150>Nic29>山定子>B9>青砧2號>Pajam2>T337(表2)。以各砧木的耐低氮綜合評價值為指標，采用類平均距離法可將7種蘋果砧木聚類為3個類群，第Ⅰ類為耐性強的砧木，包括71-3-150；第Ⅱ類為耐性較弱的砧木，包括Nic29、山定子、B9和青砧2號；第Ⅲ類為耐性最弱的砧木，包括Pajam2和T337。

3 討論

3.1 低氮脅迫對不同蘋果砧木生長的影響

氮作為植物生長發(fā)育過程中的必需營養(yǎng)元素，是蘋果器官分化、物質(zhì)代謝及果實品質(zhì)形成的重要物質(zhì)基礎。氮素虧缺條件下，樹體會快速響應，植株生長和物質(zhì)積累量等均發(fā)生顯著變化，但受影響程度存在品種特異性[15,27]。在蘋果栽培過程中，砧木作為樹體的地下部分，負責吸收和轉運土壤中的養(yǎng)分。優(yōu)良砧木不僅是保障果樹產(chǎn)量品質(zhì)的基礎，還能有效提高樹體對多種生物及非生物脅迫的適應能力。通常認為在蘋果栽培中，喬化砧樹體高大且根系發(fā)達，對土壤適應能力強，而矮化砧木樹體矮小且抗性較弱[28–29]，這與本研究結果不一致。本研究對7種蘋果砧木在低氮條件下的生長和生理生化指標進行分析，結合隸屬函數(shù)法綜合評價可知，71-3-150耐低氮脅迫能力最強，生產(chǎn)中常用的矮化砧木T337適應能力最弱，盡管在正常供氮條件下，喬化砧山定子在植株總干重、根系參數(shù)和植株氮累積量等方面明顯高于矮化砧，但其耐低氮能力弱于71-3-150、Nic29等矮化砧(表2，圖5)。程麗麗等[15]研究發(fā)現(xiàn)，低氮脅迫下光皮樺的根冠比增加，而低氮敏感型光皮樺植株生長和生物積累量等降幅大于耐受型。陳凌等[21]研究也發(fā)現(xiàn)，低氮脅迫下，耐低氮能力強的糜子品種表型性狀變化幅度較小，且更容易調(diào)節(jié)自身生理特性，適應低氮環(huán)境。本研究與上述研究結果一致，與正常供氮相比，低氮脅迫下T337、Nic29和山定子的新稍生長受到顯著抑制，Pajam2和山定子的葉片伸展減弱，植株地上部和根系干重降低，而71-3-150的新稍生長速率和地上部干重受影響較小，葉面積顯著增大，且根系中干物質(zhì)積累量增加，植株根冠比隨之升高(圖1，圖2)，表現(xiàn)出較強的低氮適應能力。韓清泉等[30]研究發(fā)現(xiàn)，低氮條件下僅耐低氮能力強的川滇柳根冠比升高，其余品種根冠比無顯著變化甚至降低，這與本研究結果一致，除71-3-150、B9和Nic29外，Pajam2、山定子和青砧2號的根冠比變化不顯著，而T337則顯著降低。

圖5 蘋果砧木的耐低氮脅迫能力聚類分析Fig.5 Cluster analysis of apple rootstocks tolerance to low N stress

表2 蘋果砧木對低氮脅迫耐受能力的模糊數(shù)學函數(shù)隸屬法評價Table 2 Evaluation of resistance to low-N stress of apple rootstocks using the method of fuzzy membership function

3.2 低氮脅迫對不同蘋果砧木根系形態(tài)的影響

根系是植物感知根際環(huán)境的器官，具有極強的可塑性以適應環(huán)境變化[25]。趙澤群等[10]在玉米的研究中發(fā)現(xiàn)，低氮條件下，玉米根干重的增加與總根長、根表面積、根體積和側根數(shù)的增加密切相關，這與本研究結果一致。本研究發(fā)現(xiàn)，低氮脅迫下71-3-150的根系干物質(zhì)積累量增加，根系總表面積、總根長、根系總體積、根尖數(shù)等根系性狀增幅顯著(表1)，表明耐低氮能力強的砧木在低氮脅迫下能夠促進根系生長，增大根系與土壤的接觸面積，有利于植株對養(yǎng)分的吸收，并將更多的同化產(chǎn)物分配至根部，提高植株根冠比，這是砧木為適應氮素虧缺條件，捕獲養(yǎng)分而產(chǎn)生的補償機制之一[31]。不同蘋果砧木根系對低氮脅迫的響應存在明顯的品種特異性，低氮處理使得T337、B9、Pajam2和山定子根系總表面積和總根長均顯著降低，耐低氮能力弱的砧木根系參數(shù)的降幅更大，而Nic29的根系總表面積、總根長、根體積和根系分枝數(shù)升高，但Nic29的根尖數(shù)減少，這可能與持續(xù)氮素虧缺過程中根基部細胞發(fā)生程序性死亡機制有關，而這一機制有待進一步研究[32]。

3.3 低氮脅迫對不同蘋果砧木氮吸收利用的影響

關于植物氮高效吸收利用的研究主要集中在耐低氮性和氮效率兩方面，前者關注植物在低氮條件下保持正常生長的能力，而后者是指在特定供氮條件下作物氮吸收利用狀況[33]。根系吸收的氮素必須經(jīng)同化后才能被植物利用，因此，氮代謝是植物生長發(fā)育過程中最重要的生理生化過程之一。硝酸還原酶(NR)作為一種誘導酶，是氮代謝過程中的關鍵酶，同時也是氮吸收的重要限制因子。正常供氮條件下，青砧2號的根系NR活性顯著高于其他砧木(圖3)，有利于根系和植株的氮累積(圖4)。李強等[34]研究發(fā)現(xiàn)，低氮脅迫下，不同氮效率的玉米葉片中NR活性均大幅下降，氮高效品種降幅小于氮低效品種，這與本研究結果一致，低氮脅迫使得不同蘋果砧木葉片NR顯著降低，Pajam2的降幅最大(圖3-A)。Nic29、Pajam2 和 T337 均為 M9 (英國東茂林實驗站收集和育成)中篩選到的優(yōu)系，Pajam2和T337對低氮脅迫適應能力均低于71-3-150、B9等其他矮化砧，而Nic29表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢。秦永梅等[35]研究發(fā)現(xiàn)，氮肥用量的增加可提高玉米葉片NR活性，但高水平的NO3–卻使得根系NR降低，即葉片和根系表現(xiàn)出相反的變化趨勢，這可能與植物體內(nèi)氮的轉運分配有關。彭玲等[1]在對不同穩(wěn)定性供氮條件下T337的NR活性研究后發(fā)現(xiàn)，由于根系和葉片的所處環(huán)境不同，二者NR活性變化趨勢存在差異。本研究也獲得相似結果，低氮條件下B9、Nic29、Pajam2和山定子葉片NR活性降低，根系中NR活性顯著提升。

NO3–被植物體吸收后，既可以在根系中同化利用，也可以轉移到根系液泡中儲存起來，被吸收的NO3–還可以通過木質(zhì)部運往植物的地上部分[11]。發(fā)達的根系是氮高效吸收利用的基礎，正常供氮條件下，山定子和青砧2號的植株氮累積量明顯高于矮化砧；此外，多數(shù)研究認為，低氮條件下植株總氮累積量與植株根系形態(tài)密切相關[36–37]，這與本研究結果一致。低氮脅迫使T337、B9、Pajam2和青砧2號等蘋果砧木根系發(fā)育受阻，植株及各器官的氮累積量亦呈降低趨勢，而71-3-150的根系干物質(zhì)量和根系參數(shù)均顯著提高，植株及各器官的氮累積量增加。但鐘思榮等[38]研究發(fā)現(xiàn)，低氮條件下，煙草根系體積增大，但莖葉氮累積量減小，表明氮累積量不僅依賴于根系，也與植物自身的氮素吸收能力有關。這與本研究結果一致，低氮條件下，Nic29的根系總表面積和總體積高于正常供氮，根系中氮累積量未有明顯變化，但葉片和莖干中氮累積量卻呈降低趨勢。除了氮吸收能力，秦璐等[25]研究發(fā)現(xiàn)，低氮脅迫會使油菜的氮利用效率顯著增加，這與蘋果砧木的變化規(guī)律一致，這是植物為適應低氮環(huán)境而產(chǎn)生的重要生理應答機制之一。

4 結論

在正常供氮條件下，喬化砧木山定子和半矮化砧青砧2號在植株生長、根系發(fā)育和養(yǎng)分吸收利用等方面均強于矮化砧；低氮條件下，各砧木均發(fā)生顯著變化且變化趨勢存在差異?；诟髦笜说哪偷偷笖?shù)，利用隸屬函數(shù)法和聚類分析可將砧木分為3種耐性類型：第Ⅰ類為耐性強的砧木(71-3-150)；第Ⅱ類為耐性較弱的砧木(Nic29、山定子、B9和青砧2號)；第Ⅲ類為耐性最弱的砧木(Pajam2和T337)。低氮條件下，蘋果砧木通過提高氮利用效率適應養(yǎng)分虧缺，其中，耐性強的砧木植株生長受抑制程度較小，并通過調(diào)節(jié)自身生理特性，增加根系中的物質(zhì)和養(yǎng)分積累，提高植株根冠比，以適應低氮環(huán)境。