冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。–HD）是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡和殘疾的主要原因之一，其發(fā)病率及病死率逐年升高，嚴(yán)重威脅人類健康；其最常見的形式是心肌梗死（MI）。CHD最有效的治療措施是盡早盡快恢復(fù)缺血區(qū)域血流，減少急性心肌缺血性損傷和梗死范圍。但缺血一段時(shí)間后的血流恢復(fù)會(huì)導(dǎo)致繼發(fā)的心肌缺血再灌注損傷，許多復(fù)雜的過程參與缺血再灌注損傷，包括離子積累、線粒體膜電位破壞、活性氧（ROS）的形成、一氧化氮代謝失調(diào)、血小板聚集、免疫激活、凋亡和自噬。

自噬在缺血再灌注損傷中被顯著激活，同時(shí)也是心肌缺血再灌注損傷的主要調(diào)節(jié)過程。有研究發(fā)現(xiàn)，mTOR是自噬的重要調(diào)控分子，在不同條件下可以通過PI3K/AKT/mTOR、AMPK/mTOR/ULK1信號(hào)通路調(diào)控自噬。研究報(bào)道自噬過程對(duì)心臟發(fā)育，結(jié)構(gòu)和功能的基本形成具有重要意義，廣泛參與多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展，如心力衰竭、心肌病、缺血性心臟病和缺血再灌注損傷等。研究表明，多種藥物均可通過mTOR調(diào)控心肌細(xì)胞自噬水平，從而改善心肌I/R損傷，但具體作用機(jī)制尚不明確。

由懸掛系統(tǒng)與下層橋架的裝配關(guān)系(見圖4),為使橋架移動(dòng)時(shí)因軌道不平導(dǎo)致耳板銷軸與軸殼孔不同心度較大時(shí)仍能正常工作,耳板通過關(guān)節(jié)軸承與銷軸連接,因軸承主要承受徑向載荷,故選用向心關(guān)節(jié)軸承.

6)第一次空中三角測(cè)量預(yù)測(cè)了導(dǎo)入的控制點(diǎn)在影像上的大概位置，由此減輕了人工尋找控制點(diǎn)點(diǎn)位的負(fù)擔(dān)。這種方法還可以用來發(fā)現(xiàn)和排查野外像控點(diǎn)錯(cuò)誤。

鹽誘導(dǎo)激酶2（SIK2）是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶屬于AMPK家族成員，本課題組已有關(guān)于SIK2在腦缺血再灌注過程中對(duì)大鼠能量代謝的影響研究。有研究表明，SIK2在細(xì)胞自噬體成熟和自噬過程中發(fā)揮重要作用，但是SIK2是否通過自噬影響心肌缺血再灌注以及作用機(jī)制目前尚未明確。本研究旨在探究SIK2通過mTOR/ULK1信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞自噬對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響,從而為臨床心肌缺血再灌注損傷的治療提供一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

4～6周齡的SD雄性大鼠（體質(zhì)量200～220 g），由長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0014。本研究所有動(dòng)物均經(jīng)皖南醫(yī)學(xué)院動(dòng)物保護(hù)與倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（LLSC-2022-005）。大鼠隨機(jī)分為3組（5只/組），假手術(shù)對(duì)照組：只用絲線穿過左冠脈不結(jié)扎；缺血再灌注組：缺血30 min，灌注2 h；SIK2抑制組：術(shù)前24 h，使用博舒替尼對(duì)大鼠進(jìn)行左股靜脈給藥，給藥劑量為10 mg/kg；24 h 后進(jìn)行缺血30 min，再灌注2 h。

將大鼠心臟組織在4%多聚甲醛中浸泡24 h后進(jìn)行脫水、包埋、切片和染色。取完整心臟組織從心尖部開始分割成3等份，保證每片心臟組織的厚度為2～3 mm（均為橫斷面），放入全自動(dòng)脫水機(jī)；利用梯度乙醇和HE染液分別將心肌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核染成紅色和藍(lán)色，中性樹膠封片后，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)及形態(tài)的改變。

1.2 主要材料

SIK2抑制劑博舒替尼（Bosutinib）為碧云天公司產(chǎn)品；兔多克隆抗體抗SIK2和兔多克隆抗體GAPDH（貨號(hào)bs-6930R、bs-0755R，北京博奧森技術(shù)有限公司）；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（貨號(hào)A0208，碧云天生物技術(shù)有限公司）；兔多克隆抗體LC3B（貨號(hào)A7198，ABclonal）；兔多克隆抗體Beclin 1、p-ULK1（Ser757）、ULK1、mTOR、p-mTOR（貨號(hào)3495、14202、8054、2983、5536，CST）；兔多克隆抗 體p62（貨 號(hào)AF5384，affinity）。小動(dòng)物呼吸機(jī)（HX-101E）、小動(dòng)物心電圖機(jī)（BL-420S）（成都泰盟軟件有限公司）；超聲儀器（EPIQ7C，探頭L12-，飛利浦）。

本發(fā)明公開了一種利用鉬尾礦代替黏土制備普通硅酸鹽水泥熟料的方法，它涉及建筑材料制備技術(shù)領(lǐng)域。將原料石灰石、鉬尾礦和調(diào)整劑以質(zhì)量百分比分別為70%～85%、5%～20%、0%～10%進(jìn)行混合,待攪拌均勻后，將混合料進(jìn)行粉磨制成生料,將生料輸送至干法回轉(zhuǎn)窯系統(tǒng)中煅燒，煅燒結(jié)束后冷卻后形成普通硅酸鹽水泥熟料。利用鉬尾礦工業(yè)固體廢棄物生產(chǎn)普通硅酸鹽水泥熟料，其不僅可以代替黏土，保護(hù)耕地，消耗了對(duì)社會(huì)環(huán)境有害的工業(yè)廢棄物，為工業(yè)廢料的綠色處理提供了一種途徑。鉬尾礦是選鉬、選鐵后剩下的固體物理，選鉬選鐵過程中已經(jīng)進(jìn)行磨礦，因此磨粉成本有所降低。

1.3 建立心肌缺血再灌大鼠模型

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組之間比較采用獨(dú)立樣本檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 構(gòu)建SIK2減少組心肌缺血再灌注模型

造模前24 h，經(jīng)腹腔麻醉后將大鼠固定在鼠板上。左側(cè)股靜脈處剪開，分離出左股靜脈，隨后注射器緩慢注射博舒替尼10 mg/kg（2～3 min），注射完畢后按壓5 min，縫合，消毒繃帶包扎，24 h后開始建立心肌缺血再灌注模型。

1.5 超聲檢測(cè)心功能

取之前存于-80 ℃冰箱的心肌組織，切取左心室組織，剪碎，加入裂解液，研磨后冰上靜置30 min，離心后取上清液即為總蛋白含量，進(jìn)行分裝。分裝后的樣本與5×上樣緩沖液混勻后95 ℃變性7～10 min，進(jìn)行上樣、凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加一抗（SIK2、LC3B、Beclin 1、p62、p-ULK1（Ser757）、ULK1、mTOR、p-mTOR，稀釋比例均為1∶1000），4 ℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜3次，10 min/次，加入二抗，稀釋倍數(shù)為1∶10 000，孵育1 h，TBST洗膜3次，加入ECL化學(xué)發(fā)光底物，化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)蛋白表達(dá)。以GAPDH為內(nèi)參，采用Image J軟件對(duì)圖像中條帶的灰度值進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.6 HE染色觀察心臟病理學(xué)改變

相對(duì)凝血功能障礙和嚴(yán)重酸中毒，體溫的盡早恢復(fù)顯得更為重要。因?yàn)檎５捏w溫是維持有效的凝血及代謝酶聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵，只有中心體溫超過35 ℃才可能出現(xiàn)正常的凝血功能[10]。研究表明，中度低體溫(32～34 ℃)每減少1 ℃能夠直接影響血小板凝血功能及減少10%凝血因子活性[16-17]。本研究結(jié)果顯示，研究組患者的術(shù)后體溫恢復(fù)時(shí)間、休克糾正時(shí)間、乳酸清除時(shí)間、PT恢復(fù)時(shí)間和住院時(shí)間均少于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示，術(shù)前ISS相近的嚴(yán)重腹部創(chuàng)傷患者接受DCS手術(shù)有利于術(shù)后患者病情恢復(fù)，DCS理念對(duì)高原嚴(yán)重腹部創(chuàng)傷的救治具有重要意義[11]。

1.7 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)

將大鼠麻醉，使用超聲多普勒血流儀檢測(cè)左心室功能，至少檢測(cè)3個(gè)連續(xù)、完整的心動(dòng)周期，指標(biāo)為大鼠左心射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左室短軸縮短率（FS）、舒張末期室間隔厚度（IVSDd）、舒張末期左室后壁厚度（LVPWDd）。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

大鼠禁食10 h后，腹腔注射25%烏拉坦（4～5 mL/kg）麻醉，待大鼠完全麻醉后將大鼠固定于恒溫鼠板上，記錄正常心電圖，消毒并備皮，剪開頸部正中皮膚，暴露頸部氣管，進(jìn)行氣管插管，連接小型動(dòng)物呼吸機(jī)進(jìn)行機(jī)械通氣。自左側(cè)3～4肋間開胸，輕壓右側(cè)胸廓暴露心臟，迅速穿線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支(假手術(shù)組大鼠只穿線不結(jié)扎)，將心臟送回胸腔內(nèi)，快速擠出胸腔內(nèi)空氣隨后立即關(guān)閉胸腔。觀察心電圖變化，以ST段抬高或下降0.2 mV為造模成功標(biāo)志，缺血30 min后開胸，松解結(jié)扎線使血流再灌，縫合胸部皮膚，再灌注2 h 后取心臟，-80 ℃凍存或4%多聚甲醛浸泡。

2 結(jié)果

2.1 模型的構(gòu)建及評(píng)價(jià)

缺血再灌注組與正常組大鼠相比，大鼠心電圖ST段顯著抬高，T波與QRS波逐漸融合，表示心梗模型成功（圖1）。

近年來，各醫(yī)學(xué)院校相繼開展機(jī)能實(shí)驗(yàn)學(xué)整合。機(jī)能實(shí)驗(yàn)學(xué)課程的開展，是醫(yī)學(xué)院校實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革的必然要求。該課程除了教師和學(xué)生兩大主體的參與，也離不開實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員。隨著學(xué)科建設(shè)不斷深入，機(jī)能實(shí)驗(yàn)課程內(nèi)容變得更加充實(shí)和復(fù)雜，對(duì)參與者提出了更高要求。實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員的工作水平從一定程度上反映了機(jī)能實(shí)驗(yàn)中心的教學(xué)水平、科研水平和管理水平。但是，目前實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員的工作素養(yǎng)與實(shí)際工作缺乏有機(jī)結(jié)合，工作現(xiàn)狀亟待改善。

2.2 SIK2與大鼠心肌缺血再灌注的相關(guān)性

如今已是西藏大學(xué)理學(xué)院教授、鐘揚(yáng)的學(xué)生拉瓊發(fā)現(xiàn)，病后稍有恢復(fù)的鐘老師開始變本加厲地工作，一天排滿了各種事。他的衣袋里總是裝著很多小紙片，上面密密麻麻寫滿各種待辦事項(xiàng)，每做完一項(xiàng)就用筆劃掉。

與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組SIK2蛋白表達(dá)增多（＜0.01，圖2A）?？梢源_定心臟組織缺血再灌注后SIK2表達(dá)增多。

對(duì)正常大鼠博舒替尼左股靜脈注射，劑量分別為5 mg/kg、10 mg/kg，24 h后直接取其心臟，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10 mg/kg劑量時(shí)大鼠心臟組織SIK含量被明顯抑制（＜0.01，圖2B）。根據(jù)結(jié)果決定使用10 mg/kg的劑量來作為實(shí)驗(yàn)劑量。

2.3 各組大鼠心臟組織病理學(xué)改變

與假手術(shù)組相比，缺血再灌注組大鼠LVEF、FS值顯著降低（＜0.001），與缺血再灌注組相比，SIK2抑制劑組大鼠LVEF、FS升高（＜0.01），LVPWDd、IVSDd值3組無明顯差別（＞0.05，表1、圖4）。

2.4 超聲觀察各組大鼠心功能的改變

假手術(shù)組心肌纖維成分無腫脹紊亂，心肌間質(zhì)無炎癥細(xì)胞浸潤。缺血再灌注組，心肌細(xì)胞水腫，部分心肌細(xì)胞出現(xiàn)核溶解、核碎裂，心肌纖維中間出現(xiàn)空洞，壞死心肌細(xì)胞周圍可見大量急性炎癥細(xì)胞浸潤。SIK2抑制劑組顯示心肌組織細(xì)胞病理變化減輕（圖3）。

2.5 各組大鼠中自噬蛋白的表達(dá)情況

與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組大鼠Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-I蛋白表達(dá)增多（＜0.01），p62 蛋白表達(dá)降低（＜0.001）；與缺血在再灌注組相比，SIK2抑制劑組大鼠Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-I蛋白表達(dá)降低（＜0.05），p62蛋白表達(dá)增高（＜0.01，圖5）。

2.6 SIK2通過mTOR/ULK1信號(hào)通路調(diào)控自噬

與假手術(shù)組相比，缺血再灌組大鼠p-mTOR蛋白表達(dá)顯著降低（＜0.0001），p-ULK1（Ser757）蛋白表達(dá)增高（＜0.01）；與缺血再灌注組相比，SIK2抑制劑組大鼠p-mTOR蛋白表達(dá)增高（＜0.01），p-ULK1（Ser757）蛋白表達(dá)降低（＜0.05）；3組mTOR、ULK1蛋白表達(dá)無明顯差別（＞0.05，圖6）。

2.7 TEM觀察各組大鼠心肌細(xì)胞自噬情況

假手術(shù)組心肌纖維排列整齊，心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核及線粒體形態(tài)和數(shù)量正常；與假手術(shù)組相比，缺血再灌注組可見心肌肌纖維溶解、斷裂甚至壞死，有明顯腫脹，線粒體嵴突紊亂及空泡化嚴(yán)重，而且可見自噬小泡，有較多自噬體形成。與缺血在再灌注組相比，SIK2抑制劑組大鼠心肌細(xì)胞腫脹、空泡化減輕，壞死灶減輕，而且自噬體形成較少（圖7）。

3 討論

近年來，越來越多的研究表明自噬廣泛參與心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展，因此調(diào)控自噬成為減輕心肌缺血再灌注損傷的一個(gè)潛在治療靶點(diǎn)。自噬是心肌缺血再灌注損傷的重要分子機(jī)制，參與自噬的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子和通路的調(diào)控非常復(fù)雜。AMPK-mTORUlk1 通路是調(diào)節(jié)自噬的重要信號(hào)通路，AMPK在缺血再灌注過程中被激活。AMPK激活可導(dǎo)致mTOR失活和ULK1（Ser757）激活，從而促進(jìn)自噬。SIK2是AMPK亞家族成員之一，已有研究表明SIK2在缺血性疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用，然而其影響缺血性疾病進(jìn)展的具體機(jī)制仍然是未知的。所以本研究探究在心肌缺血再灌注損傷過程中，SIK2是否通過調(diào)控細(xì)胞自噬，影響心肌組織的損傷。

本研究通過注射博舒替尼調(diào)控SIK2表達(dá)水平，建立大鼠心梗模型，繼而觀察下游靶基因的表達(dá)水平變化趨勢(shì)以及心臟損傷的情況，檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白來判斷SIK2與自噬之間的機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大鼠心肌缺血再灌注后，心肌細(xì)胞發(fā)生損傷，LVEF、FS 值下降，LC3-Ⅱ/LC3-I、Beclin-1蛋白表達(dá)增多，p62蛋白表達(dá)減少，心肌組織SIK2蛋白表達(dá)水平增加；上述結(jié)果說明缺血再灌注可以誘發(fā)心肌細(xì)胞發(fā)生過度自噬，從而加重大鼠心肌缺血再灌注損傷，表現(xiàn)為病理損傷加重，心臟射血分?jǐn)?shù)降低。為了探究大鼠心肌缺血再灌注過程中自噬水平增加是否和SIK2有關(guān)，使用SIK2的抑制劑來驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)與模型組相比SIK2抑制劑組心肌細(xì)胞損傷減輕，LVEF、FS值升高，LC3-Ⅱ/LC3-I、Beclin-1蛋白表達(dá)減少，p62蛋白表達(dá)增多，結(jié)果說明心肌缺血再灌注損傷過程中SIK2的表達(dá)上調(diào)可以促進(jìn)自噬，使用SIK2抑制劑可抑制心肌異常自噬減輕心肌缺血再灌注損傷。此前大量研究表明，心肌缺血再灌注會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量ROS，從而引發(fā)自噬，然而自噬引起的結(jié)局有所區(qū)別，有的研究認(rèn)為促進(jìn)自噬可加重?fù)p傷［，有的研究認(rèn)為促進(jìn)自噬可以減輕損傷。雖然許多研究中存在一些相悖的結(jié)果，但是大家的共同認(rèn)識(shí)是，自噬的短期和中度激活可能會(huì)通過降解功能失調(diào)或受損的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器來促進(jìn)細(xì)胞存活，從而產(chǎn)生有益的影響，而自噬的持續(xù)升高可能會(huì)促進(jìn)細(xì)胞死亡。為了進(jìn)一步探究SIK2是通過何種機(jī)制調(diào)控自噬水平，研究中檢測(cè)了mTOR-Ulk1相關(guān)通路蛋白，結(jié)果表明，大鼠心肌缺血再灌注后心肌組織SIK2、p-ULK1（Ser757）蛋白表達(dá)增多，p-mTOR蛋白表達(dá)減少；而在SIK2抑制劑組SIK2、p-ULK1（Ser757）蛋白表達(dá)減少，p-mTOR蛋白表達(dá)增多。這些結(jié)果提示我們?cè)谛募∪毖俟嘧p傷過程中，SIK2通過調(diào)控mTOR-ULK1來影響自噬水平。

綜上所述，在大鼠心肌再灌注損傷發(fā)生過程中，抑制SIK2可以下調(diào)mTOR-Ulk1 信號(hào)通路，抑制細(xì)胞過度自噬，改善大鼠心功能，減少心肌細(xì)胞損傷，對(duì)心肌缺血再灌損傷起到良好的保護(hù)作用。