夏 偉，李 華，冷敦鵬，張 浩，王友娟，李勤芳，劉思喜（青島中仁動(dòng)物藥品有限公司 266329）

雞新城疫是由新城疫病毒（Newcastlediseasevirus，NDV）引起的一種急性敗血性傳染病，俗稱亞洲雞瘟，主要侵害雞和火雞[1]。雞群感染新城疫病毒后，常出現(xiàn)體溫升高、呼吸困難、下痢、綠便、呼吸道和消化道發(fā)生出血性炎癥，可引起較高的死亡率[2]。目前新城疫仍是困擾我國養(yǎng)雞業(yè)的重要疫病之一，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列為法定報(bào)告的動(dòng)物疫病，我國農(nóng)業(yè)部將其列為一類動(dòng)物疫病。

新城疫病毒（NDV）屬副黏病毒科，禽腮腺炎病毒屬，禽副黏病毒。新城疫病毒基因組由一條單股RNA組成，含有6種病毒特異性結(jié)構(gòu)蛋白（L、NP、P、HN、M、F）和2種非結(jié)構(gòu)蛋白V和蛋白W[3]。新城疫病毒主要存在于病雞喉氣管、肺臟、脾臟及體液、分泌物和排泄物中，宿主范圍廣泛，給養(yǎng)禽業(yè)和公共衛(wèi)生安全帶來了較大的隱患。

目前對(duì)于新城疫病毒檢測方法主要包括：雞胚接種、血凝和血凝抑制試驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散、免疫熒光技術(shù)等，但RT-PCR檢測方式具有敏感性高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。

山東省膠州某大型肉雞養(yǎng)殖集團(tuán)飼養(yǎng)的肉雞在18日齡出現(xiàn)食欲不振，采食量降低，體溫升高至42℃～43℃，呼吸不暢，出現(xiàn)雞冠發(fā)紫，排綠色稀糞等癥狀。剖檢癥狀為鼻腔和氣管內(nèi)有黏液；全身漿膜和黏膜出血；氣管和喉頭充血、出血；肺臟、胰腺出血；腎臟腫大出血；尤其是腺胃乳頭與肌胃、食道交界處出血更加明顯，初步確認(rèn)感染新城疫病毒。在臨床癥狀基礎(chǔ)上進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)，對(duì)病毒進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

病毒RNA快速抽提試劑盒、一步法RT-PCR擴(kuò)增試劑盒、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker（100-2000bp）均購自上海生工生物工程有限公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)及合成

以F蛋白基因序列為模板，運(yùn)用PrimerPremier5.0和DNAMAN進(jìn)行引物設(shè)計(jì)篩選，由深圳華大基因科技有限公司進(jìn)行特異性引物合成。上游引物為GAAGGCGCACTTACTACAC，下游引物為TCCCAAGCCATAATAAGGT，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段為496bp。

1.3 病原RNA提取

將采集的10份雞喉氣管組織樣品研磨后，按照1∶5的比例加入生理鹽水混合，反復(fù)凍融3次，3000r/min離心10min，取上清后備用。采用病毒RNA快速抽提試劑盒進(jìn)行病毒RNA的提取。

1.4 RT-PCR反應(yīng)條件

PCR反應(yīng)體系25.0μL：

10×OneStepRT-PCRBuffer2.5μL、上、下游引物各1μL、AMVRT0.25μL、TaqDNApolymerase0.25μL、RNaseInhibitor0.25μL、模板1.0μL、RNase-freeddH2O18.75μL。

最佳擴(kuò)增程序：

45℃反 應(yīng)30min；95.0℃預(yù) 變 性5min；94.0℃1min，58.5℃1min，72.0℃1min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72.0℃延伸10min。

1.5 電泳

反應(yīng)結(jié)束后，取5μLPCR產(chǎn)物，用1%的瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 剖檢臨床癥狀

2.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測

用新城疫病毒特異性引物進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，10份樣品均在250～500bp，接近500bp處出現(xiàn)明亮的單一條帶（如圖1）。

圖1 臨床剖檢圖

圖2 RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3 治療措施

結(jié)合臨床癥狀及RT-PCR檢測結(jié)果，判斷肉雞感染雞新城疫病毒。肉雞在18日齡正處于免疫力最為薄弱的階段，極易出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。對(duì)癥治療，選用卡巴匹林鈣、金銀花、黃芪多糖等進(jìn)行飲水治療，起到清熱解表、提高免疫力的作用。常規(guī)飲水方面：添加電解多維等，目的在于對(duì)脫水的控制、對(duì)體內(nèi)鈉的調(diào)節(jié)、減少應(yīng)激；同時(shí)鑒于可能發(fā)生繼發(fā)感染的情況，還應(yīng)結(jié)合使用抗菌藥物，例如，氨芐西林、硫酸黏菌素等。每日兩次，連用3～5d。

2.4 治療效果評(píng)價(jià)

在用藥1d后觀察死亡率，結(jié)果表明：在用藥第2d后，死亡率明顯下降；待第4d后，死亡率得到了控制；在第5d時(shí)，未見死亡數(shù)。從雞的癥狀上來看，呼吸困難的癥狀都已消失，治療獲得了較好的效果。

3 討論

隨著我國家禽業(yè)的規(guī)模化集約化發(fā)展，雞群混合感染和二次感染現(xiàn)象日益增多。目前新城疫是影響家禽業(yè)持續(xù)發(fā)展的主要疾病之一，引起了人們的高度重視[4]。鑒于新城疫對(duì)我國禽業(yè)的危害，急需建立一種特異性好、靈敏度高，可以快速、準(zhǔn)確地檢測NDV的診斷方法，提高我國禽業(yè)關(guān)于病毒的檢測水平。

雞新城疫是一種致死率較高的禽類傳染病，所以在養(yǎng)殖過程中還是要以預(yù)防為主，及時(shí)做好養(yǎng)殖場的清理、消毒工作；做好疾病的檢疫和接種工作。有研究表示黃芪、大青葉、金銀花、板藍(lán)根、百花蛇舌草、魚腥草、野菊花等幾類中藥在抑制雞新城疫病的療效上有所區(qū)別，其中金銀花具有較顯著的抗病毒效果[5]。在疾病發(fā)生早期發(fā)現(xiàn)，早利用中西醫(yī)結(jié)合的方式給予治療，在很大程度上還是可能治愈的，極大地降低雞新城疫引發(fā)的經(jīng)濟(jì)損失，這對(duì)于提升養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)收益，促進(jìn)我國禽類產(chǎn)業(yè)的發(fā)展有巨大作用。