楊丹，孫銀鳳，白敏，宋冰，張延英，汪永鋒，康萬榮

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省實驗動物行業(yè)技術(shù)中心，甘肅 蘭州 730000

急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）由多種原因引起，發(fā)病機制復(fù)雜。近年來，其發(fā)病率和病死率呈上升趨勢，常出現(xiàn)炎癥瀑布效應(yīng)，導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征和多器官功能障礙綜合征，其中以急性肺損傷最為常見，是導(dǎo)致患者死亡的主要原因，其病理機制主要是炎癥反應(yīng)與抗炎反應(yīng)失調(diào)，而細(xì)胞凋亡在二者之間起到調(diào)節(jié)作用。PI3K/AKT信號通路與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，是AP引發(fā)肺損傷的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。其通過調(diào)節(jié)肺泡上皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞活性，介導(dǎo)肺損傷發(fā)生發(fā)展。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，大黃牡丹湯可下調(diào)AP模型大鼠血清炎癥因子，改善胰腺組織病理變化，但對細(xì)胞凋亡的調(diào)控機制并不明確。因此，本研究從PI3K/AKT信號通路觀察大黃牡丹湯對AP模型大鼠肺組織細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)的影響，明確其在AP肺損傷早期病理反應(yīng)中的作用機制，為臨床治療AP肺損傷提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 動物

2 月齡SPF 級雄性Wistar 大鼠96 只，體質(zhì)量（200±20）g，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（甘）2020-0001。飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心SPF級屏障實驗室，溫度21～25 ℃，相對濕度40%～45%，12 h晝夜交替，動物使用許可證號SYXK（甘）2020-0009。動物操作與處理遵循甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理原則。

1.2 藥物及制備

大黃牡丹湯（大黃12 g，牡丹皮9 g，芒硝9 g，桃仁12 g，冬瓜子30 g），飲片購于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，并由該院煎藥室制備成原藥材濃度為1 g/mL煎劑。醋酸奧曲肽注射液，國藥一心制藥有限公司，批號171003，0.5 mg/mL。

1.3 主要試劑與儀器

大鼠白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，貨號分別為ml102828、ml037361、ml002859）；牛磺膽酸鈉（北京Solarbio 公司，批號1111J051）；RT-PCR試劑盒（上海翊圣生物科技有限公司，批號H4104620）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Promega公司，批號0000366052）；PI3K抗體（英國Abcam公司，批號GR3192684-9）；p-AKT、Bcl-2、Bax、Caspase-3、GAPDH抗體（美國Immunoway公司，批號分別為B0601、B4101、B5501、B8501、B1501）；HE 染色劑（武漢塞維爾生物科技有限公司，批號G1005）；二抗（武漢博士德生物工程有限公司，批號BST3C23C54）。微量注射泵（型號SN-50T6，深圳圣諾醫(yī)療設(shè)備有限公司）；高通量組織研磨器（型號SCIENTZ-48，寧波新芝生物科技股份有限公司）；高速低溫離心機（型號5910R，德國艾本德股份公司）；電子天平（型號DF110，江蘇常熟衡器工業(yè)有限公司）；超微量熒光分光光度計（型號DS-11，美國DeNovix 公司）；酶聯(lián)免疫檢測儀（型號Benchmark Plus，美國Bio-Rad 公司）；實時定量PCR 儀（型號CFX96，美國Bio-Rad 公司）；反轉(zhuǎn)錄儀（型號S1000，美國Bio-Rad公司）；電泳槽（型號JY-SPAT，美國Bio-Rad 公司）；電泳儀（型號Power PacUniversal Power Supply，美國Bio-Rad 公司）；凝膠成像分析系統(tǒng)（型號Chemi DOC XRS＋，美國Bio-Rad公司）；組織包埋機（型號YB-6LF，湖北亞光公司）；石蠟切片機（型號RM2235，德國Leica 公司）；光學(xué)顯微鏡（型號BX53F，日本Olympus 公司）；-80 ℃超低溫冰箱（型號DW-86l626，青島海爾公司）。

2 實驗方法

2.1 分組及造模

96只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后按體質(zhì)量隨機取16只作為空白組，其余80只采用胰膽管逆行注射牛磺膽酸鈉制備AP大鼠模型。造模前12 h大鼠禁食不禁水，3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位固定于固定板上，充分暴露腹部。備皮消毒后，沿劍突下切開，將十二指腸從腹腔取出，充分暴露胰膽管，將新鮮配制的5%牛磺膽酸鈉溶液注入胰膽管，體積1 mL/kg，注射完成后，復(fù)納十二指腸，逐層縫合關(guān)腹。將大鼠統(tǒng)一體位放回鼠籠，保溫，禁食不禁水，密切觀察其生命體征。造模后按隨機數(shù)字表法將大鼠分為模型組、奧曲肽組和大黃牡丹湯高、中、低劑量組，每組16只。

2.2 干預(yù)

參考《中藥藥理實驗方法學(xué)》換算給藥劑量，奧曲肽組予0.01 mg/kg 奧曲肽背部皮下注射（相當(dāng)于60 kg成人每日用量6倍），注射體積1 mL/kg，大黃牡丹湯高、中、低劑量組分別予14、7、3.5 g/kg大黃牡丹湯煎劑灌胃（相當(dāng)于60 kg成人每日用量的12、6、3倍），空白組、模型組予等體積蒸餾水灌胃，分別于造模前1 h及造模后12、24 h各給藥1次，共給藥3次。

2.3 一般狀態(tài)觀察

每日觀察各組大鼠精神狀態(tài)、活動度、是否出現(xiàn)扭體反應(yīng)、大便次數(shù)及便質(zhì)改變等情況。

2.4 取材

末次給藥1 h后，每組隨機選取6只大鼠5%水合氯醛腹腔注射（0.5 mL/100 g）麻醉，心臟取血，4 ℃、3 000 r/min離心5 min，分離血清，用于生化指標(biāo)檢測。頸椎脫臼法處死大鼠，取出胰腺和肺臟，取右肺組織及部分胰腺組織放入4%多聚甲醛溶液中固定，用于HE染色。取左肺組織迅速放入-80 ℃冰箱保存，用于ELISA、RT-PCR和Western blot檢測。

2.5 生化指標(biāo)檢測

取大鼠血清，采用生化分析儀檢測血清淀粉酶（AMS）、C反應(yīng)蛋白（CRP）含量。

2.6 病理學(xué)檢測

取4%多聚甲醛溶液固定的胰腺和肺組織，石蠟包埋，切片，脫蠟，HE染色，中性樹膠封片，恒溫箱烘烤過夜，光鏡下觀察并拍照。

2.7 ELISA檢測

取左肺組織，加入組織裂解液，經(jīng)組織研磨器研磨制備勻漿，13 000 r/min離心5 min，取上清液，采用ELISA試劑盒檢測大鼠肺組織TNF-α、IL-1β、IL-6含量，具體步驟按試劑盒說明書進行。

2.8 RT-PCR檢測

采用Trizol試劑提取肺組織總RNA，紫外分光光度計檢測RNA濃度及純度。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進行擴增，以β-actin為內(nèi)參，2法計算mRNA相對表達量。引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

2.9 Western blot檢測

取0.1 g肺組織剪碎，加入600 μL組織裂解液（含2%PMSF），組織研磨器研磨，13 000 r/min離心5 min，取上清液，BCA法測定蛋白濃度。取20 μg蛋白上樣，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉后，滴加PI3K一抗（1∶2 000）、p-AKT一抗（1∶500）、Caspase-3一抗（1∶1 000）、一抗Bcl-2（1∶1 000）、Bax一抗（1∶1 000）、GAPDH一抗（1∶5 000），4 ℃孵育過夜，洗膜，加入二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h，采用化學(xué)發(fā)光法曝光、顯影，Quantity One圖像分析軟件進行掃描，Image J軟件計算蛋白相對表達量。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 大黃牡丹湯對模型大鼠一般狀況的影響

空白組大鼠精神狀態(tài)良好，二便正常，皮毛有光澤，反應(yīng)靈敏；模型組大鼠瞇眼倦臥，抖動，皮毛雜亂無光澤，二便減少；各給藥組大鼠倦臥嗜睡、皮毛雜亂、活動度減少等狀況有所改善，大黃牡丹湯高、中、低劑量組大鼠有不同程度腹瀉，其中大黃牡丹湯高劑量組最為明顯。

4.2 大黃牡丹湯對模型大鼠胰腺和肺組織病理變化的影響

空白組大鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)未見異常；模型組大鼠胰腺組織可見葉間隙增寬、腺泡分離，小葉結(jié)構(gòu)欠完整，腺泡細(xì)胞充血，有炎性細(xì)胞浸潤及壞死；各給藥組大鼠胰腺組織病理變化有不同程度改善，細(xì)胞壞死、水腫及充血減少，其中大黃牡丹湯高劑量組效果最為明顯。見圖1。

圖1 各組大鼠胰腺組織形態(tài)（HE染色，×200）

空白組大鼠肺組織無明顯病理改變；模型組大鼠肺間質(zhì)擴大，毛細(xì)血管充血，肺泡腔出血，水腫范圍增加，炎癥細(xì)胞浸潤明顯；各給藥組大鼠肺組織病理變化有不同程度改善，間質(zhì)水腫和炎性細(xì)胞浸潤明顯減少，其中大黃牡丹湯高劑量組效果最為明顯。見圖2。

圖2 各組大鼠肺組織形態(tài)（HE染色，×200）

4.3 大黃牡丹湯對模型大鼠血清淀粉酶、C反應(yīng)蛋白含量的影響

與空白組比較，模型組大鼠血清AMS、CRP含量顯著增加（＜0.01）；與模型組比較，奧曲肽組和大黃牡丹湯高、中劑量組大鼠血清AMS、CRP含量顯著減少（＜0.01），大黃牡丹湯低劑量組大鼠血清CRP含量顯著減少（＜0.01）。見表2。

表2 各組大鼠血清AMS、CRP含量比較（）

4.4 大黃牡丹湯對模型大鼠肺組織腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-6含量的影響

與空白組比較，模型組大鼠肺組織TNF-α、IL-1β、IL-6含量顯著增加（＜0.01）；與模型組比較，奧曲肽組和大黃牡丹湯高、中劑量組大鼠肺組織TNF-α、IL-1β、IL-6含量顯著降低（＜0.01，＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠肺組織TNF-α、IL-1β、IL-6含量比較（，pg/mL）

4.5 大黃牡丹湯對模型大鼠肺組織PI3K、AKT、Caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA表達的影響

與空白組比較，模型組大鼠肺組織PI3K、AKT、Caspase-3、Bax mRNA 表達顯著升高，Bcl-2 mRNA表達顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01）；與模型組比較，奧曲肽組和大黃牡丹湯高、中劑量組大鼠肺組織PI3K、AKT、Caspase-3、Bax mRNA表達顯著降低，奧曲肽組和大黃牡丹湯高劑量組大鼠肺組織Bcl-2 mRNA表達顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01，＜0.05）。見表4。

表4 各組大鼠肺組織PI3K、AKT、Caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA表達比較（）

4.6 大黃牡丹湯對模型大鼠肺組織PI3K、p-AKT、Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達的影響

與空白組比較，模型組大鼠肺組織PI3K、p-AKT、Caspase-3、Bax蛋白表達顯著升高，Bcl-2蛋白表達顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠肺組織PI3K、p-AKT、Caspase-3、Bax蛋白表達顯著降低，Bcl-2蛋白表達顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01，＜0.05）。見表5、圖3。

表5 各組大鼠肺組織PI3K、p-AKT、Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達比較（）

圖3 各組大鼠肺組織PI3K、p-AKT、Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白免疫印跡

5 討論

AP屬中醫(yī)學(xué)“脾心痛”“腹痛”“脅痛”等范疇。中醫(yī)認(rèn)為，腑氣不通是引起腹痛的主要病因之一，而肺與大腸相表里，腑氣不通會影響肺的宣發(fā)肅降，進而出現(xiàn)咳嗽、氣喘、胸悶等肺部表現(xiàn)。大黃牡丹湯載于《金匱要略》，由大黃、桃仁、牡丹皮、芒硝、冬瓜子組成。方中大黃清熱解毒、瀉下逐瘀，芒硝清熱解毒、瀉下通便，桃仁、牡丹皮涼血活血兼化瘀，冬瓜子利濕排膿散結(jié)。全方具有瀉熱破瘀、散結(jié)消腫功效，用于治療熱毒結(jié)于腸、氣滯血瘀所致腹痛。臨床研究表明，大黃牡丹湯治療AP患者較西藥常規(guī)治療具有用藥安全、療效顯著、復(fù)發(fā)率低的優(yōu)勢。實驗研究表明，大黃牡丹湯可有效調(diào)降低AP模型大鼠炎癥因子水平，促進胰腺組織修復(fù)。

肺損傷是AP最常見的早期并發(fā)癥，全身炎癥反應(yīng)是其主要發(fā)病原因。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，大黃牡丹湯減輕炎癥反應(yīng)與調(diào)控Toll樣受體4表達有關(guān)。Toll樣受體4與內(nèi)毒素、脂多糖結(jié)合后可激活NF-κB信號通路，誘導(dǎo)TNF-α、IL-1β、IL-6 等釋放，參與炎癥反應(yīng)。IL-6可促進中性粒細(xì)胞活化和聚集，誘導(dǎo)急性炎癥反應(yīng)，引起肺水腫；TNF-α可以刺激細(xì)胞分泌IL-1β等炎癥介質(zhì)，進一步加重炎癥反應(yīng)；IL-1β可增加細(xì)胞對TNF-α 的敏感性，并刺激細(xì)胞釋放TNF-α等細(xì)胞因子。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠肺組織TNF-α、IL-1β、IL-6含量較空白組顯著增加，提示AP從局部炎癥反應(yīng)逐步轉(zhuǎn)變?yōu)槿硌装Y反應(yīng)，進而損害其他臟器，這可能是導(dǎo)致AP患者出現(xiàn)多器官功能障礙綜合征的主要原因之一。各給藥組大鼠肺組織TNF-α、IL-1β、IL-6含量較模型組減少，胰腺組織和肺組織病理損傷有不同改善，表明大黃牡丹湯能有效減少模型大鼠炎癥反應(yīng)，減輕胰腺、肺組織病理損傷。

細(xì)胞凋亡在AP發(fā)病過程中扮演重要角色，主要發(fā)生于胰腺腺泡細(xì)胞和胰外器官，如肺臟、肝臟等。凋亡是細(xì)胞為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定發(fā)生的程序性死亡，大黃牡丹湯能使酶原物質(zhì)從腺泡內(nèi)轉(zhuǎn)移到腺泡外，促進胰腺腺泡細(xì)胞凋亡，減輕AP所致炎癥反應(yīng)。目前肺損傷的細(xì)胞凋亡機制存在2種不同觀點：一種認(rèn)為促進中性粒細(xì)胞凋亡會降低肺損傷嚴(yán)重程度，即減輕炎癥反應(yīng)；另一種認(rèn)為減少肺組織毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞凋亡可減輕肺損傷。激活PI3K/AKT信號通路可啟動其下游抑凋亡因子Bcl-2及促凋亡因子Bax，Caspases家族主要參與炎癥反應(yīng)及誘導(dǎo)凋亡，激活Caspase-3可提高細(xì)胞凋亡率，并導(dǎo)致Caspases家族其他蛋白酶級聯(lián)釋放。研究發(fā)現(xiàn)，肺損傷大鼠PI3K/AKT信號通路高表達，中藥干預(yù)可通過提高Bcl-2表達、降低Caspase-3和Bax表達，減少細(xì)胞凋亡，進而減輕肺損傷。本實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠肺組織PI3K、Caspase-3、Bax mRNA和蛋白表達顯著升高，Bcl-2 mRNA 和蛋白表達顯著降低，AKT mRNA和p-AKT蛋白表達顯著升高，提示PI3K/AKT信號通路與AP肺損傷關(guān)系密切。各給藥組大鼠肺組織PI3K、Caspase-3、Bax mRNA和蛋白表達不同程度降低，Bcl-2 mRNA 和蛋白表達不同程度升高，AKT mRNA和p-AKT蛋白表達不同程度降低，表明抑制PI3K/AKT信號通路能減少肺組織血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，從而減輕急性肺損傷病理變化。大黃牡丹湯主要成分大黃素、丹皮酚可抑制PI3K/AKT 信號通路，減少細(xì)胞凋亡，這可能是大黃牡丹湯治療AP肺損傷的機制之一。

綜上所述，大黃牡丹湯對AP模型大鼠肺組織損傷具有保護作用，可能與調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路，減少肺組織細(xì)胞凋亡，減輕炎癥反應(yīng)有關(guān)。本實驗可為大黃牡丹湯治療AP 繼發(fā)肺損傷提供實驗依據(jù)和臨床思路。