楊曉寧，孫欣光，周麗娟，吳永劍，李建偉

1.北京振東光明藥物研究院有限公司，北京 100085；2.山西振東制藥股份有限公司，山西 長(zhǎng)治 047199

山楂為薔薇科植物山里紅Bge.var.N.E.Br.或山楂Bge.的干燥成熟果實(shí)。山楂有消食健胃、行氣散瘀、化濁降脂等功效。現(xiàn)代研究表明，山楂具有保護(hù)心血管、抗氧化、抗癌抗炎、降壓、降低膽固醇等藥理作用，主要含有機(jī)酸、黃酮等活性成分。2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》僅以總有機(jī)酸作為山楂化學(xué)成分含量控制指標(biāo)，無法反映藥材的整體質(zhì)量，不能進(jìn)行合理的質(zhì)量評(píng)價(jià)和控制。山楂藥材產(chǎn)地較廣，不同氣候、土壤及栽培條件等因素對(duì)其質(zhì)量均有一定影響，因此，有必要對(duì)不同產(chǎn)地的山楂質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。

中藥在炮制過程中化學(xué)成分會(huì)發(fā)生變化，進(jìn)而導(dǎo)致炮制后功效改變。臨床多用山楂炮制品炒山楂和焦山楂消食導(dǎo)滯，其中焦山楂作用較強(qiáng)，常用于肉食積滯、瀉痢不爽。已有報(bào)道山楂在炮制過程中的化學(xué)成分變化，但多關(guān)注總有機(jī)酸含量。

本研究建立山楂中有機(jī)酸成分枸櫞酸及黃酮類成分金絲桃苷HPLC含量測(cè)定方法，并結(jié)合總有機(jī)酸含量，評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地山楂及其炮制品化學(xué)成分含量變化，以期闡明產(chǎn)地及炮制對(duì)山楂質(zhì)量的影響，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

安捷倫1260分析型高效液相色譜儀（DAD檢測(cè)器、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器，Empower Pro色譜工作站），安捷倫科技有限公司；Waters 2695分析型高效液相色譜儀（UV檢測(cè)器、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器，Empower Pro色譜工作站），Waters公司；KQ-500DB數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；0.22 μm微孔濾膜，天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

枸櫞酸對(duì)照品（批號(hào)100396-201603，含量以100.0%計(jì)）、金絲桃苷對(duì)照品（批號(hào)111521-201708，含量以95.1%計(jì)），中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇（色譜純），默克兩合股份有限公司；甲醇、乙醇、冰醋酸、磷酸（分析純），北京化工廠；水為超純水。山楂藥材與飲片經(jīng)北京振東光明藥物研究院秦文杰研究員鑒定，為薔薇科植物山里紅Bge.var.N.E.Br.的干燥成熟果實(shí)，來源信息見表1。

表1 山楂樣品來源信息

2 方法與結(jié)果

2.1 枸櫞酸含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件

采用Waters X Select HSS T3 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm），流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，100%～99%B；10～16 min，99%～94%B；16～50 min，94%～85%B），柱溫35 ℃，流速1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。色譜圖見圖1。

圖1 山楂中枸櫞酸HPLC圖

2.1.2 對(duì)照品溶液制備

取枸櫞酸對(duì)照品適量，精密稱定，置容量瓶中，加色譜甲醇制成每1 mL甲醇中含枸櫞酸0.326 8 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液制備

取山楂粉末（過5號(hào)篩）約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲提?。üβ?00 W，頻率40 kHz）20 min，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，取上清液，0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.1.4 精密度試驗(yàn)

取山楂粉末（過5號(hào)篩），按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果枸櫞酸的峰面積RSD＝0.29%，表明儀器精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取山楂粉末（過5號(hào)篩），按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12、24 h進(jìn)樣，枸櫞酸的峰面積RSD＝0.36%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取山楂粉末（過5號(hào)篩），平行6份，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，結(jié)果枸櫞酸峰面積RSD＝1.86%，表明方法重復(fù)性良好。

2.1.7 線性關(guān)系考察

取枸櫞酸對(duì)照品溶液，加甲醇稀釋至不同濃度，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)，以濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，枸櫞酸回歸方程為＝624 989－7 941.3，＝0.999 6，線性范圍為0.10～0.75 mg/mL。

2.1.8 檢測(cè)限與定量限

將枸櫞酸對(duì)照品溶液進(jìn)一步稀釋成一定濃度，精密吸取上述對(duì)照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄信號(hào)強(qiáng)度與噪音強(qiáng)度的比值，將信號(hào)強(qiáng)度和噪音強(qiáng)度之比為3時(shí)的濃度作為檢測(cè)限，將信號(hào)強(qiáng)度與噪音強(qiáng)度之比等于10時(shí)的濃度作為定量限。枸櫞酸的檢測(cè)限為3.984μg/mL，定量限為9.960μg/mL。

2.1.9 加樣回收率試驗(yàn)

取山楂粉末（過5號(hào)篩）0.1 g，精密稱定，平行6份，取已知含量的枸櫞酸對(duì)照品溶液，按照樣品含量的100%加入樣品中，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，計(jì)算山楂中枸櫞酸的加樣回收率，結(jié)果見表2。加樣回收率為95.78%～99.61%，RSD＜2.0%，表明方法準(zhǔn)確度良好。

表2 枸櫞酸加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2 金絲桃苷含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件

采用KromasiL 100-5-C18 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動(dòng)相A為0.1%磷酸乙腈，B為水，梯度洗脫（0～12 min，11%A；12～15 min，11%～16%A；15～27 min，16%～20%A；27～35 min，20%～27%A；35～40 min，27%～60%A）；柱溫35 ℃，流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)352 nm。色譜圖見圖2。

圖2 山楂中金絲桃苷HPLC圖

2.2.2 對(duì)照品溶液制備

取金絲桃苷對(duì)照品適量，精密稱定，置具塞容量瓶中，加色譜甲醇制成每1 mL甲醇中含金絲桃苷為4.8μg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液制備

取山楂粉末（過5號(hào)篩）約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取（功率500 W，頻率40 kHz）20 min，用75%甲醇水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，取上清液，0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2.4 精密度試驗(yàn)

取山楂粉末（過5號(hào)篩）按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果金絲桃苷的峰面積RSD＝0.61%，表明儀器精密度良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取山楂粉末（過5號(hào)篩）按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12、24 h進(jìn)樣，結(jié)果金絲桃苷的峰面積RSD＝0.89%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取山楂粉末（過5號(hào)篩），平行6份，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，結(jié)果金絲桃苷的峰面積RSD＝0.90%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.7 線性關(guān)系考察

取金絲桃苷對(duì)照品溶液，加甲醇稀釋至不同濃度，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，以濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，金絲桃苷回歸方程為＝624 989－7 941.3，＝0.999 6，線性范圍為0.46～17.38 mg/mL。

2.2.8 檢測(cè)限與定量限

將金絲桃苷對(duì)照品溶液進(jìn)一步稀釋成一定濃度，精密吸取上述對(duì)照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄信號(hào)強(qiáng)度與噪音強(qiáng)度的比值，將信號(hào)強(qiáng)度和噪音強(qiáng)度之比為3時(shí)的濃度作為檢測(cè)限，將信號(hào)強(qiáng)度與噪音強(qiáng)度之比為10時(shí)的濃度作為定量限。金絲桃苷的檢測(cè)限和定量限分別為0.09μg/mL和0.04μg/mL。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取山楂粉末（過5號(hào)篩）0.5 g，精密稱定，平行6份，取已知含量的金絲桃苷對(duì)照品溶液，按照樣品含量的100%加入樣品中，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，計(jì)算山楂中金絲桃苷的加樣回收率，結(jié)果見表3。加樣回收率為95.85%～100.04%，RSD＜2.0%，表明方法準(zhǔn)確度良好。

表3 金絲桃苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.3 有機(jī)酸含量測(cè)定

取山楂粉末1 g，精密稱定，精密加水100 mL，室溫浸泡4 h，時(shí)時(shí)振搖，過濾，精密量取續(xù)濾液25 mL，加水50 mL，加酚酞指示液2滴，用氫氧化鈉滴定液（0.1 mol/L）滴定，即得。每1 mL滴定液（0.1 mol/L）相當(dāng)于6.404 mg枸櫞酸。

2.4 樣品測(cè)定

2.4.1 不同產(chǎn)地凈山楂樣品含量測(cè)定

不同產(chǎn)地山楂樣品測(cè)定結(jié)果見表4。不同產(chǎn)地凈山楂藥材中有機(jī)酸含量為5.34%～13.05%，均符合2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》（一部）“山楂”項(xiàng)下相關(guān)要求（有機(jī)酸不得少于5.0%）。枸櫞酸含量為3.41%～9.47%，金絲桃苷含量為83.03～224.74 μg/g。

表4 不同產(chǎn)地山楂含量測(cè)定結(jié)果

2.4.2 山楂不同炮制品含量測(cè)定

山楂不同炮制品炒山楂和焦山楂樣品測(cè)定結(jié)果見表5。炒山楂中有機(jī)酸含量為5.29%～9.82%，均符合2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》（一部）“山楂”項(xiàng)下相關(guān)要求（有機(jī)酸不得少于4.0%）。炒山楂中枸櫞酸含量為2.42%～7.50%，金絲桃苷含量為57.32～137.60 μg/g。焦山楂中有機(jī)酸含量為4.05%～8.91%，均符合2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》（一部）“山楂”項(xiàng)下相關(guān)要求（有機(jī)酸不得少于4.0%）。焦山楂中枸櫞酸含量為1.10%～5.33%，金絲桃苷含量為7.46～103.20 μg/g。

表5 山楂不同炮制品含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

本研究建立枸櫞酸和金絲桃苷含量測(cè)定方法時(shí)，由于枸櫞酸與金絲桃苷的化合物極性和HPLC色譜保留行為存在較大差異，故分別建立2種化合物的HPLC含量測(cè)定方法。同時(shí)，本研究系統(tǒng)考察了不同提取方法，以及提取溶劑和提取時(shí)間等參數(shù)對(duì)枸櫞酸和金絲桃苷提取效率的影響，最終確定山楂藥材枸櫞酸含量測(cè)定的最優(yōu)提取方法為50%甲醇溶液超聲提取20 min，金絲桃苷含量測(cè)定的最優(yōu)提取方法為75%甲醇溶液超聲提取20 min。

本研究建立了枸櫞酸和金絲桃苷的含量測(cè)定方法，結(jié)合藥典法測(cè)定有機(jī)酸含量，并對(duì)不同產(chǎn)地山楂藥材及不同炮制品進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。研究結(jié)果表明，不同產(chǎn)地的山楂藥材化學(xué)成分存在差異，其中山西和山東產(chǎn)地的山楂中枸櫞酸、金絲桃苷和總有機(jī)酸高于其他產(chǎn)地，表明這2個(gè)產(chǎn)地的藥材質(zhì)量較好。不同產(chǎn)地枸櫞酸含量規(guī)律與總有機(jī)酸含量相同，枸櫞酸含量占山楂藥材總有機(jī)酸含量的70%左右，是含量較高的有機(jī)酸，而金絲桃苷是山楂中的主要黃酮類成分。因此，可以將枸櫞酸和金絲桃苷作為質(zhì)控指標(biāo)進(jìn)行山楂藥材的質(zhì)量控制。

山楂炮制后化學(xué)成分會(huì)發(fā)生變化，本研究同時(shí)以有機(jī)酸、枸櫞酸和金絲桃苷含量為指標(biāo)評(píng)價(jià)山楂炮制品炒山楂和焦山楂中化學(xué)成分的變化。結(jié)果表明二者的有機(jī)酸低于原山楂藥材，說明炮制過程中有機(jī)酸含量降低，與以往研究結(jié)果一致。枸櫞酸作為主要的有機(jī)酸，在炮制過程中含量也降低。有機(jī)酸在炮制過程中含量下降，可減弱對(duì)胃的刺激，增強(qiáng)消食作用。山楂主要功效成分金絲桃苷在炮制品中含量降低，可能由于炮制加熱過程使黃酮類成分發(fā)生降解。山楂藥材炮制過程發(fā)生的化學(xué)成分的變化，是否會(huì)引起其藥效的不同目前仍不明確，需要進(jìn)行深入研究以闡明其藥效與炮制的關(guān)系。

本研究建立的枸櫞酸、金絲桃苷HPLC含量測(cè)定方法簡(jiǎn)便、結(jié)果可靠，可以作為質(zhì)控方法進(jìn)行山楂藥材及其炮制品的質(zhì)量評(píng)價(jià)，并為山楂質(zhì)量控制及臨床應(yīng)用提供依據(jù)。