夏壘，韓雪，董莉，夏艷秋

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203；2.西安市中醫(yī)醫(yī)院，陜西 西安 710016；3.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 200437

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）是常見的妊娠并發(fā)癥，發(fā)生率為1%～5%，目前仍有超過半數(shù)的RSA病因尚不明確。無論何種病因，母胎界面局部微環(huán)境在妊娠建立和維持中都起到重要作用。母胎界面中胎盤微血管的生成及胎盤血管網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建對妊娠維持至關(guān)重要。有學(xué)者認(rèn)為，RSA的發(fā)生與妊娠期母體子宮螺旋動(dòng)脈和胚胎絨毛血管中形成微小血栓有關(guān)，其可能導(dǎo)致子宮-胎盤循環(huán)血液灌注不良，增加妊娠丟失的風(fēng)險(xiǎn)。

補(bǔ)腎活血方是國醫(yī)大師朱南孫教授臨床治療RSA的經(jīng)驗(yàn)方，前期研究顯示，該方有助于改善患者卵巢血流動(dòng)力情況，調(diào)節(jié)炎癥因子平衡。本研究在前期研究基礎(chǔ)上觀察該方對RSA小鼠母胎界面血管生成及微小血栓的影響，進(jìn)一步探討其作用機(jī)制，以期為臨床應(yīng)用和后續(xù)研究提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雌性CBA/J小鼠40只、雄性DBA/2J小鼠15 只、雄性BALB/c 小鼠5 只，6～7 周齡，體質(zhì)量（20±2）g，上海吉輝實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（滬）2017-0012。常規(guī)飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房，溫度25～27 ℃，濕度40%～50%，12 h光照/黑暗循環(huán)，自由攝食飲水。

1.2 藥物

補(bǔ)腎活血方（黃芪20 g，黨參20 g，丹參20 g，當(dāng)歸20 g，巴戟天15 g，淫羊藿15 g，菟絲子12 g，熟地黃12 g，覆盆子12 g），由上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥制劑中心制成湯劑，每1 mL含原藥材1.46 g，置于4 ℃冰箱冷藏備用。地屈孕酮片，荷蘭Abbott Biologicals B.V.，10 mg/片，批號(hào)360591，藥片碾碎后用蒸餾水溶解，制成濃度為1 mg/mL溶液。

1.3 主要試劑與儀器

HE染色試劑盒、Trizol、一氧化氮（NO）檢測試劑盒、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為C0105M、R0016、S0021S、P0013、P0009；RT-PCR 試劑盒，日本TaKaRa公司，批號(hào)RR047A；血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）抗體、血管內(nèi)皮鈣黏蛋白（VE-cadherin）抗體、GAPDH 抗體、HRP 標(biāo)記羊抗鼠IgG、HRP 標(biāo)記羊抗兔IgG，美國Proteintech 公司，批號(hào)分別為 19003-1-AP、66804-1-lg、60004-1-lg、SA00001-1、SA00001-2；ECL發(fā)光液，美國Millipore公司，批號(hào)WBKLS0100；血栓素B2（TXB2）試劑盒、6-酮前列腺素F1α（6-Keto-PGF1α）試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號(hào)分別為H173、H204-1。HM325石蠟切片機(jī)（美國Thermo 公司），EG1150 自動(dòng)包埋機(jī)（德國Leica 公司），Axio Scope.A1 光學(xué)顯微鏡（德國Carl Zeiss公司），SCIENTZ-48高通量組織研磨器（中國寧波新芝生物科技股份有限公司），Centrifuge 5427R低溫高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司），QuantStudio3實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國ABI公司），VORTEX-6渦旋振蕩儀（上海其林貝爾），Synergy2多功能酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司），PowerPAC3000垂直電泳儀（美國Bio-Rad 公司），F(xiàn)luorChem R 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國Protein Simple公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模、分組及給藥

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將CBA/J雌鼠與DBA/2J雄鼠2∶1合籠飼養(yǎng)建立RSA模型，同時(shí)將CBA/J雌鼠與BALB/c雄鼠2∶1合籠飼養(yǎng)建立正常妊娠作為正常組，次日檢查雌鼠陰道，見陰栓者表明造模成功，若未見陰栓，則繼續(xù)合籠飼養(yǎng)。將成模小鼠隨機(jī)分為模型組、中藥組和西藥組，每組10只。鏡下見精子或陰道口見陰栓當(dāng)天記為妊娠第1日，各組于妊娠第1日開始灌胃，根據(jù)小鼠與成人體表面積換算等效劑量，中藥組灌胃補(bǔ)腎活血方（30 g/kg），西藥組灌胃地屈孕酮溶液（6.15 mg/kg），灌胃體積0.3 mL/只，正常組和模型組予等體積蒸餾水灌胃，連續(xù)13 d。

2.2 標(biāo)本采集

小鼠末次灌胃24 h 后腹腔注射2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉，摘眼球取血，剖視子宮觀察胚胎情況并拍照；分離蛻膜組織，液氮速凍后置-80 ℃冰箱中保存。

2.3 胚胎丟失率計(jì)算

統(tǒng)計(jì)胚胎總數(shù)、流產(chǎn)胚胎數(shù)，計(jì)算胚胎丟失率。胚胎丟失率（%）＝流產(chǎn)胚胎數(shù)÷總胚胎數(shù)×100%。

2.4 HE染色

將蛻膜組織置于4%多聚甲醛中固定24 h，常規(guī)脫水，透明，包埋，切片（厚度6 μm），脫蠟，脫水，蘇木精染色8 min，流水沖洗，伊紅染色1 min，流水沖洗，脫水，透明，中性樹膠封片后，置于光鏡下觀察蛻膜組織病理形態(tài)。

2.5 RT-PCR檢測

取蛻膜組織，加入Trizol提取總RNA，微量分光光度計(jì)測定RNA 純度及濃度。將總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，擴(kuò)增程序?yàn)閮刹椒ǎ?5 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，共40個(gè)循環(huán)。以18S為內(nèi)參，2法計(jì)算mRNA 相對表達(dá)量。透明質(zhì)酸合成酶（HAS）引物由上海生工生物有限公司合成，引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

2.6 Western blot檢測

取蛻膜組織，加入RIPA裂解液，勻漿研磨機(jī)研磨，4 ℃、14 000 r/min離心20 min，取上清液，BCA法測定蛋白濃度。等量蛋白上樣，10%凝膠電泳，將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，滴加VEGF一抗（1∶1 000）、VE-cadherin一抗（1∶1 000）、GAPDH一抗（1∶5 000），4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次5 min，加入相應(yīng)二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜，ECL發(fā)光液曝光，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)成像，以GAPDH為內(nèi)參，采用AlphaView SA軟件對蛋白條帶灰度值進(jìn)行分析。

2.7 硝酸還原酶法檢測

取蛻膜組織，加入裂解液，勻漿研磨機(jī)研磨，4 ℃、14 000 r/min離心20 min，取上清液，按50μL/孔向96 孔板中加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，再分別加入Griess ReagentⅠ和Griess ReagentⅡ，酶標(biāo)儀波長540 nm處檢測各孔OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中NO含量。

2.8 ELISA檢測

將血液于室溫靜置10 min，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，吸取上層血清，按照ELISA試劑盒說明書操作，酶標(biāo)儀波長450 nm處檢測各孔OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血清TXB2和6-Keto-PGF1α含量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 補(bǔ)腎活血方對模型小鼠胚胎丟失率的影響

正常組小鼠胚胎粗大如串珠狀，胚胎發(fā)育均勻，顏色淡紅，宮腔內(nèi)無出血點(diǎn)及明顯瘀血；模型組小鼠胚胎呈竹節(jié)樣改變，胚胎發(fā)育不勻稱或體積縮小甚至無胚胎，顏色黯紅或黑褐，宮腔內(nèi)可見明顯出血點(diǎn)或瘀血；中藥組和西藥組小鼠胚胎形態(tài)明顯改善，胚胎發(fā)育較均勻。見圖1。

圖1 各組小鼠胚胎形態(tài)

與正常組比較，模型組小鼠胚胎丟失率顯著升高（＜0.001）；與模型組比較，中藥組和西藥組小鼠胚胎丟失率顯著降低（＜0.01，＜0.05）；中藥組與西藥組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）。見表2。

表2 各組小鼠胚胎丟失率比較（）

4.2 補(bǔ)腎活血方對模型小鼠蛻膜組織病理形態(tài)的影響

正常組小鼠蛻膜細(xì)胞呈卵圓形，排列整齊，胞質(zhì)豐富，核仁明顯，血管豐富，管壁完整；模型組小鼠蛻膜細(xì)胞碎裂，數(shù)量減少，胞漿水腫、空泡樣變，部分細(xì)胞核消失，血管數(shù)量減少；中藥組小鼠少數(shù)蛻膜細(xì)胞胞漿水腫、空泡樣變，血管內(nèi)皮細(xì)胞較為完整，生長良好；西藥組小鼠部分蛻膜細(xì)胞胞漿水腫、空泡樣變，血管內(nèi)皮細(xì)胞不完整。見圖2。

圖2 各組小鼠蛻膜組織形態(tài)（HE染色，×200）

正常組小鼠迷路滋養(yǎng)層細(xì)胞呈網(wǎng)狀排列，細(xì)胞核清晰，胞質(zhì)豐富，母血竇豐富，組織結(jié)構(gòu)清晰；模型組小鼠迷路滋養(yǎng)層細(xì)胞增生肥大，細(xì)胞核和胞質(zhì)界限模糊，胞漿廣泛空泡化，部分細(xì)胞變性、壞死、結(jié)構(gòu)不清晰；中藥組小鼠迷路滋養(yǎng)層細(xì)胞呈網(wǎng)狀排列，細(xì)胞核清晰，胞質(zhì)豐富，母血竇較為豐富，整體結(jié)構(gòu)完整；西藥組小鼠迷路滋養(yǎng)層細(xì)胞呈網(wǎng)狀排列，部分細(xì)胞核染色加深，形態(tài)不規(guī)則，胞漿呈空泡樣改變，部分區(qū)域結(jié)構(gòu)不清晰。見圖3。

圖3 各組小鼠迷路組織形態(tài)（HE染色，×200）

4.3 補(bǔ)腎活血方對模型小鼠蛻膜組織透明質(zhì)酸合成酶mRNA表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組小鼠蛻膜組織HAS-1、HAS-2、HAS-3 mRNA 表達(dá)均顯著降低（＜0.05，＜0.001，＜0.01）；與模型組比較，中藥組和西藥組小鼠蛻膜組織HAS-1、HAS-2、HAS-3 mRNA表達(dá)均顯著升高（＜0.05，＜0.01，＜0.001）。見表3。

表3 各組小鼠蛻膜組織HAS-1、HAS-2、HAS-3 mRNA表達(dá)比較（）

4.4 補(bǔ)腎活血方對模型小鼠蛻膜組織血管內(nèi)皮生長因子、血管內(nèi)皮鈣黏蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組小鼠蛻膜組織VEGF、VE-cadherin表達(dá)顯著降低（＜0.05，＜0.01）；與模型組比較，中藥組和西藥組小鼠蛻膜組織VEGF、VE-cadherin表達(dá)顯著升高（＜0.01，＜0.001），且西藥組顯著高于中藥組（＜0.05，＜0.01）。見圖4。

圖4 各組小鼠蛻膜組織VEGF、VE-cadherin蛋白表達(dá)比較（，每組10只）

4.5 補(bǔ)腎活血方對模型小鼠蛻膜組織一氧化氮含量的影響

與正常組比較，模型組小鼠蛻膜組織NO含量顯著減少（＜0.01）；與模型組比較，中藥組和西藥組小鼠蛻膜組織NO含量顯著增加（＜0.01，＜0.05）。見表4。

表4 各組小鼠蛻膜組織NO含量比較（，mol/L）

4.6 補(bǔ)腎活血方對模型小鼠血清血栓素B2、6-酮前列腺素F1α含量的影響

與正常組比較，模型組小鼠血清6-Keto-PGF1α含量顯著減少（＜0.001）；與模型組比較，中藥組和西藥組小鼠血清6-Keto-PGF1α 含量顯著增加（＜0.001）。各組小鼠血清TXB2含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）。見表5。

表5 各組小鼠血清TXB2、6-Keto-PGF1α含量比較（，ng/L）

5 討論

RSA屬中醫(yī)學(xué)“滑胎”范疇，該病具有連續(xù)性、自然性和應(yīng)期而下的特點(diǎn)。朱氏婦科認(rèn)為，本病病機(jī)多為腎虛與血瘀共存，腎虛為本，血瘀為標(biāo)，治以補(bǔ)腎固胎、活血化瘀為主。據(jù)此，朱氏婦科第三代傳承人國醫(yī)大師朱南孫教授秉朱氏婦科“究奇經(jīng)，養(yǎng)氣血，毓麟之本”學(xué)術(shù)思想，創(chuàng)立補(bǔ)腎活血方，方中以巴戟天、淫羊藿為君藥補(bǔ)腎填精；黃芪、黨參、當(dāng)歸、丹參為臣藥補(bǔ)氣活血；熟地黃為佐藥滋養(yǎng)腎精；菟絲子、覆盆子為使藥平補(bǔ)肝腎。諸藥共奏補(bǔ)腎活血、祛瘀安胎之功。

正常妊娠的維持有賴于母胎界面及胎盤植入部位的豐富血供，胎盤血管網(wǎng)絡(luò)充分發(fā)育使母胎間營養(yǎng)物質(zhì)等交換順利進(jìn)行，胚胎得以生長發(fā)育。透明質(zhì)酸（HA）是一種位于血管內(nèi)皮細(xì)胞外的大分子多糖，可直接影響血管生成，通常表達(dá)于絨毛細(xì)胞外基質(zhì)和血管壁，能夠維持胎盤形態(tài)及子宮胎盤血液循環(huán)。正常早孕階段胎盤組織HA含量明顯高于RSA組，高濃度和完整狀態(tài)的HA在維持正常妊娠中具有重要作用。HAS是一類高效的雙功能糖基轉(zhuǎn)移酶，催化尿苷-5'-二磷酸-葡糖醛酸和尿苷-5'-二磷酸-乙酰氨基葡萄糖聚合為HA長鏈，可控制細(xì)胞遷移，修復(fù)磷狀上皮細(xì)胞，在排卵期、胚胎形成及機(jī)體發(fā)育過程中均有所表達(dá)，可在一定程度上起到補(bǔ)償組織細(xì)胞、維持器官功能的作用。HA的正常聚合可以增加胎盤中VEGF表達(dá)，從而在胚胎發(fā)育過程中調(diào)控母胎界面血管生成。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠VEGF基因缺失會(huì)導(dǎo)致胚胎血管發(fā)育缺陷而致胚胎死亡，VEGF過表達(dá)會(huì)使母胎界面血管腔異常增大，導(dǎo)致胚胎數(shù)量減少和胚胎丟失率增加。NO作為VEGF的效應(yīng)因子和誘導(dǎo)因子，在構(gòu)建母胎界面血管生成渠道中擔(dān)任重要角色，適量NO的產(chǎn)生是胎盤血管調(diào)節(jié)機(jī)制完善的體現(xiàn)。NO含量減少與HA降解直接相關(guān)，NO缺乏導(dǎo)致妊娠小鼠子宮動(dòng)脈直徑縮小，子宮血流量減少。VE-cadherin是鈣黏素家族的重要成員，主要功能是維持血管內(nèi)皮細(xì)胞相互連接、血管完整性和血管新生，缺乏VE-cadherin會(huì)影響VEGF介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞存活和血管生成，導(dǎo)致胚胎死亡。本實(shí)驗(yàn)中VE-cadherin蛋白在模型組小鼠蛻膜組織中低表達(dá)，中藥組和西藥組表達(dá)升高，且西藥組異常高表達(dá)，這可能與西藥組高表達(dá)VEGF有關(guān)。研究表明，VEGF可以上調(diào)VE-cadherin表達(dá)及磷酸化，但VE-cadherin過表達(dá)容易引起細(xì)胞間黏附加強(qiáng)，具有抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移、浸潤作用，滋養(yǎng)層細(xì)胞浸潤不足會(huì)造成自然流產(chǎn)。因此，西藥組VE-cadherin高表達(dá)可能不利于新生血管生成。而補(bǔ)腎活血方對于新生血管內(nèi)皮細(xì)胞間的連接具有保護(hù)作用，能維持血管內(nèi)皮屏障功能。TXB2、6-Keto-PGF1α互為拮抗作用，在管壁緊張度、血小板激活和血流機(jī)制中起相反調(diào)節(jié)作用，6-Keto-PGF1α/TXB2 比例降低會(huì)導(dǎo)致血栓風(fēng)險(xiǎn)增加。本實(shí)驗(yàn)中除模型組小鼠血清6-Keto-PGF1α 含量顯著減少外，正常組、中藥組和西藥組小鼠血清TXB2、6-Keto-PGF1α含量無明星差異，提示中藥和西藥可增加小鼠外周血6-Keto-PGF1α含量以降低血栓風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，補(bǔ)腎活血方可顯著降低RSA小鼠胚胎丟失率，增加血清6-Keto-PGF1α含量及蛻膜組織NO含量，上調(diào)VEGF、VE-cadherin、HAS 表達(dá)，改善RSA導(dǎo)致的血管生成障礙及血栓形成，實(shí)現(xiàn)母胎界面血管重塑，調(diào)節(jié)母胎界面血管微環(huán)境，減少不良妊娠結(jié)局。