王 萍，王先麗，吳 迪，白 晶，路萌萌，湯春波*

1南京醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔種植科，江蘇省口腔疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇省口腔轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)工程研究中心，江蘇 南京 210029；2江蘇省東南大學(xué)先進(jìn)金屬材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 211189

在口腔種植修復(fù)中，對(duì)于種植位點(diǎn)存在骨缺損者（尤其在上頜前牙區(qū)），可通過引導(dǎo)骨再生（guided bone regeneration，GBR）［1］后同期或延期種植的方法解決。但GBR 在頜骨及牙槽骨缺損較嚴(yán)重患者的應(yīng)用中仍存在顯著的局限性。GBR 以屏障膜為基礎(chǔ)，抑制骨缺損區(qū)成纖維細(xì)胞的優(yōu)先長(zhǎng)入，為骨組織生長(zhǎng)創(chuàng)造足夠空間。目前用于GBR 的屏障膜分為生物可降解和不可降解兩大類［2］。生物可降解屏障膜包括動(dòng)物源性成分（如膠原膜）和脂肪族聚酯［如聚乳酸（polylactic acid，PLA）］，而不可降解的屏障膜通常包括聚四氟乙烯（polytetrafluoroethylene，PTFE）膜和鈦膜［3-4］。一般認(rèn)為，用于臨床的GBR膜應(yīng)具有良好的生物相容性和適當(dāng)?shù)目山到庑裕员苊舛问中g(shù)取出。除此之外，GBR 術(shù)后骨再生失敗與手術(shù)部位的污染和感染密切相關(guān)［5-6］。細(xì)菌在創(chuàng)面或植入物表面定植引起的感染和生物膜的形成，對(duì)局部骨再生和種植的成功都是致命的打擊。臨床現(xiàn)有的大多數(shù)產(chǎn)品不能抑制細(xì)菌定植，更不能預(yù)防組織感染，可能導(dǎo)致種植失敗。雖然膠原膜在GBR 中具有優(yōu)異的性能，并被廣泛應(yīng)用，但其強(qiáng)度差，不能保持良好的成骨空間，也沒有抗菌作用［3］。

PLA 是一種生物可降解的高分子生物材料，具有良好的生物相容性，經(jīng)美國(guó)食品和藥品管理局（FDA）批準(zhǔn)作為一種生物醫(yī)用材料，已用于傷口敷料、醫(yī)用可吸收縫線、可吸收鋼板、可吸收螺釘和食品包裝等［7-11］。與天然的生物聚合物（膠原蛋白、透明質(zhì)酸等）相比，PLA沒有潛在的抗原性和免疫原性［12］。但是，PLA 的低沖擊韌性使其不適于在高機(jī)械強(qiáng)度環(huán)境下使用［13］?？傊?，PLA存在硬度差、降解率低、疏水性高、缺乏抗菌性能等局限性，限制了其作為生物醫(yī)學(xué)材料的應(yīng)用［14］。因此，開發(fā)具有抗菌性能、避免植入后嚴(yán)重感染甚至導(dǎo)致植入失敗的PLA 基復(fù)合生物材料，是提高PLA 性能的一個(gè)研究方向。

鎂（magnesium，Mg）是一種生物可降解金屬，是人體必需元素之一。鎂離子（Mg2+）在蛋白質(zhì)合成、肌肉功能、神經(jīng)和免疫調(diào)節(jié)等生化水平的代謝中也是必不可少的，而且多余的Mg2+可以從尿液中排出［15］。研究表明，Mg及其氧化物具有廣泛的抗菌譜和生物降解能力［16-17］。它還能促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和增殖，刺激內(nèi)皮細(xì)胞招募和炎癥反應(yīng)平衡［18］。近年來，Mg 及其合金作為植入物被廣泛研究，其中一些已成功應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域［17，19］。Mg 增強(qiáng)PLA復(fù)合材料可能成為潛在的醫(yī)用生物可吸收材料，改善聚合物低力學(xué)性能，同時(shí)降低了Mg 基材料快速降解釋放H2帶來的有害影響［20-22］。在耐藥菌不斷進(jìn)化的時(shí)代，采取這種非抗生素應(yīng)對(duì)微生物定植的替代策略勢(shì)在必行。

我們假設(shè)，在良好的生物相容性的前提下，Mg 含量較高的PLA 在增強(qiáng)機(jī)械性能的同時(shí)可以達(dá)到植入后的局部抗菌作用。這些作用可以極大地促進(jìn)GBR 膜的屏障功能，保持良好的生物穩(wěn)定性。本研究旨在制備一種具有抗菌性能的GBR復(fù)合膜，該復(fù)合膜結(jié)合了聚乳酸的低降解速率和Mg 持續(xù)降解所賦予的抗菌活性的優(yōu)勢(shì)，將不同比例的Mg 顆粒負(fù)載于PLA 基質(zhì)中，通過對(duì)材料表面革蘭陽性金黃色葡萄球菌（S.aureus）和革蘭陰性大腸桿菌（E.coli）的生長(zhǎng)情況來評(píng)價(jià)不同含量Mg 顆粒增強(qiáng)PLA復(fù)合膜的抗菌效果。

1 材料和方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)中使用的小鼠上皮樣成纖維細(xì)胞系（L929）和小鼠胚胎成骨前體細(xì)胞系（MC3T3-E1）以及金黃色葡萄球菌S.aureus（ATCC 25923）和大腸桿菌E.coli（ATCC 25922）來自南京醫(yī)科大學(xué)江蘇省口腔疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室樣本庫。磷酸鹽緩沖液、α-MEM 培養(yǎng)基、DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素和硫酸鏈霉素（Gibco公司，美國(guó)）；CCK-8檢測(cè)試劑盒（同仁公司，日本）；2.5%戊二醛（上海碧云天）；二氯甲烷、無水乙醇（南京國(guó)藥集團(tuán)）；LB培養(yǎng)基（北京Solarbio）；掃描電子顯微鏡（LEO 1530VP，德國(guó)）；電子萬能試驗(yàn)機(jī)（Zwick Roell Z1.0，德國(guó)）；pH 計(jì)（PHSJ-4A，上海雷磁）；酶標(biāo)儀（Bio-tek公司，美國(guó)）；超聲波清洗機(jī)（深圳潔盟）。

1.2 方法

1.2.1 樣品的制備

為制備Mg/PLA 復(fù)合膜，將數(shù)均分子量≈40，黏度=2.66 dL/g 的PLA 顆粒溶于二氯甲烷后，將溶液與10%wt、20%wt 和40%wt 的球形Mg 顆粒（平均粒徑≈27 μm）充分混合。將該懸浮液在室溫下倒入直徑為150 mm 的玻璃器皿中，直至二氯甲烷完全揮發(fā)。最后，將0.3 mm厚的圓盤狀復(fù)合膜在50 ℃下干燥24 h。在接下來的實(shí)驗(yàn)中，將從PLA 膜和3 種復(fù)合膜上切割的不同形狀樣品用環(huán)氧乙烷滅菌，切割尺寸為50 mm× 10 mm 的工字形試樣進(jìn)行拉伸試驗(yàn)。切取直徑15 mm 的圓盤樣品，用于評(píng)價(jià)其抗菌性能。

1.2.2 樣品表面形貌觀察

用掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）對(duì)噴金后不同樣品的表面形貌進(jìn)行觀察分析。

1.2.3 樣品的力學(xué)性能

為了研究不同試樣的基本力學(xué)性能，采用電子萬能試驗(yàn)機(jī)在室溫下以2 mm/min的速度和0.1 N的預(yù)負(fù)荷進(jìn)行拉伸試驗(yàn)，同時(shí)記錄應(yīng)力-應(yīng)變曲線。強(qiáng)度和應(yīng)變值是3次測(cè)量的平均值。復(fù)合膜抗拉強(qiáng)度的計(jì)算公式：δ=Fmax/A；Fmax為最大荷載值（N），A為試驗(yàn)試件的橫截面積（mm2）。計(jì)算拉伸應(yīng)變的公式：ε（%）=ΔL0/L0×100%；L0為試件的標(biāo)尺長(zhǎng)度（mm），ΔL0為L(zhǎng)0的增量（mm）。

1.2.4 浸沒實(shí)驗(yàn)

將樣品在磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）中以1∶10的表面積/體積比浸泡24 h，用pH計(jì)記錄每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的pH值。

1.2.5 細(xì)胞培養(yǎng)與培養(yǎng)基制備

小鼠上皮樣成纖維細(xì)胞（L929）和小鼠胚胎成骨前體細(xì)胞（MC3T3-E1）在含有下述培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。細(xì)胞在37 ℃、95%相對(duì)濕度，5%CO2濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

為了研究Mg/PLA 復(fù)合膜的生物相容性，制備了以下培養(yǎng)基。完全培養(yǎng)基：α-MEM和DMEM分別添加10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、1%青霉素（100 U/mL）和硫酸鏈霉素（100 mg/mL）制備α-MEM 完全培養(yǎng)基和DMEM 完全培養(yǎng)基。條件培養(yǎng)基：按照ISO-10993 標(biāo)準(zhǔn)，用兩種完全培養(yǎng)基、浸提標(biāo)準(zhǔn)為1.25 cm2/mL，獲取樣品24 h 的浸提液。其中，α-MEM 完全培養(yǎng)基用于MC3T3-E1 細(xì)胞的培養(yǎng)，DMEM完全培養(yǎng)基用于L929細(xì)胞的培養(yǎng)。

1.2.6 細(xì)胞增殖

用MC3T3-E1和L929細(xì)胞系評(píng)價(jià)樣品的生物相容性。細(xì)胞接種24 h 后，用兩種條件培養(yǎng)基代替原培養(yǎng)基，以兩種完全培養(yǎng)基作為對(duì)照，條件培養(yǎng)1、3、5 d后測(cè)定細(xì)胞增殖。按CCK-8試劑盒要求，將細(xì)胞與CCK-8 試劑共孵育2 h，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。

1.2.7 抗菌性能評(píng)價(jià)

用革蘭陽性的S.aureus（ATCC 25923）和革蘭陰性的E.coli（ATCC 25922）評(píng)價(jià)復(fù)合膜的抗菌性能。將E.coli和S.aureus的單菌落分別置于LB液體培養(yǎng)基中，搖晃過夜（37 ℃，220 r/min），培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

為了直觀地觀察細(xì)菌細(xì)胞膜形態(tài)的變化及材料表面細(xì)菌的生長(zhǎng)情況，將E.coli和S.aureus懸液（1×104CFU/mL，1 mL/孔）接種于材料表面，37 ℃孵育24 h。PBS 洗滌3 次，用2.5%戊二醛4 ℃固定過夜，采用乙醇（30%、50%、70%、90%、100%）對(duì)微生物進(jìn)行梯度脫水后4 ℃保存，金濺射涂層后用掃描電鏡觀察。

將1 mLE.coli和S.aureus懸液（1×106CFU/mL）接種于復(fù)合膜表面，37 ℃孵育24 h。用PBS 輕輕沖洗復(fù)合膜表面3次，然后在1 mL PBS 中超聲分離黏附在膜表面的細(xì)菌（50 Hz，5 min）。將得到的菌液分別稀釋1×103、1×104倍，將稀釋后的菌液100 μL均勻涂抹于LB固體培養(yǎng)基平板上，24 h后計(jì)數(shù)。抑菌率計(jì)算如下：抑菌率（%）=（對(duì)照組CFU-實(shí)驗(yàn)組CFU）/對(duì)照組CFU×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行3 個(gè)重復(fù)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。對(duì)于兩組以上的比較，使用Tukey’s或Dunnett’s事后檢驗(yàn)的單因素方差分析（ANOVA）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Mg/PLA復(fù)合膜的表征

本研究制備了負(fù)載不同含量Mg顆粒的Mg/PLA復(fù)合膜。SEM 觀察顯示復(fù)合膜的表面形貌與PLA膜相似，相對(duì)較為平坦，但復(fù)合膜表面粗糙度較大（圖1）。在10 000 倍的放大倍數(shù)下，復(fù)合膜粗糙表面更明顯（圖1）。與PLA 膜相比，復(fù)合膜的表面粗糙度增加，應(yīng)該與球形Mg顆粒的加入有關(guān)。

圖1 PLA膜和Mg/PLA復(fù)合膜的SEM圖像（標(biāo)尺1 μm）Figure 1 SEM images of PLA membrane and Mg/PLA composite membranes(scale 1 μm)

膜的拉伸應(yīng)力-應(yīng)變曲線如圖2所示。隨著復(fù)合膜中Mg含量的增加，復(fù)合膜機(jī)械強(qiáng)度呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)。10%wt Mg/PLA 復(fù)合膜的抗拉強(qiáng)度顯著提高，而負(fù)載40%wt Mg顆粒者機(jī)械強(qiáng)度降低。

圖2 PLA膜與Mg/PLA復(fù)合膜的典型應(yīng)力-應(yīng)變曲線Figure 2 Typical stress-strain curves of PLA membrane and Mg/PLA composite membranes

將PLA 膜和3 種復(fù)合膜樣品浸泡在PBS 溶液中進(jìn)行浸沒試驗(yàn)，檢測(cè)24 h 內(nèi)PBS 溶液pH 值的變化。如圖3 所示，PLA 的pH 值基本穩(wěn)定在7.35～7.40，而復(fù)合膜組pH 值均呈現(xiàn)緩慢的升高狀態(tài)，10%wt Mg/PLA 和20%wt Mg/PLA 組pH 變化相似，40%wt Mg/PLA 組pH 升高相對(duì)明顯，最高時(shí)達(dá)7.65±0.01。

圖3 PLA膜與Mg/PLA復(fù)合膜在PBS中隨時(shí)間的pH值變化Figure 3 pH values of PLA membrane and Mg/PLA composite membranes immersed in PBS at different times

2.2 生物相容性和抗菌性能

用CCK-8 試劑盒評(píng)價(jià)復(fù)合膜降解產(chǎn)物對(duì)MC3T3-E1 和L929 細(xì)胞的生物相容性?？紤]到Mg的初始降解不利于細(xì)胞黏附，我們使用24 h 的材料浸提液進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，與空白對(duì)照相比，無論是PLA 降解產(chǎn)物還是復(fù)合膜降解產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖均沒有毒性作用（圖4）。綜上所述，PLA 和Mg/PLA 復(fù)合膜的降解產(chǎn)物具有良好的生物相容性。

圖4 CCK-8檢測(cè)24 h材料浸提液中MC3T3-E1(A)、L929(B)的增殖情況（n=3）Figure 4 The proliferation of MC3T3-E1（A）and L929（B）in 24 h membrane extract was determined by CCK-8（n=3）

SEM 顯示，細(xì)菌與膜材料共培養(yǎng)24 h 后，復(fù)合膜組細(xì)菌黏附減少。隨著Mg 顆粒負(fù)載增加，復(fù)合膜組S.aureus黏附減少，20%wt Mg/PLA 和40%wt Mg/PLA復(fù)合膜組黏附細(xì)菌見胞膜膨脹，細(xì)菌變形。同時(shí)，復(fù)合膜組E.coli鞭毛減少，細(xì)菌活性降低，20%wt Mg/PLA和40%wt Mg/PLA復(fù)合膜組E.coli表面出現(xiàn)了明顯的變形、收縮甚至溶解現(xiàn)象（圖5）。結(jié)果表明，pH值和離子濃度的升高會(huì)引起細(xì)菌胞膜腫脹、變形甚至破裂，抑制細(xì)菌生長(zhǎng)增殖，甚至導(dǎo)致細(xì)菌死亡。同時(shí)復(fù)合膜的抑菌效果可能也與材料表面不利于細(xì)菌的附著有關(guān)。

圖5 SEM觀察材料表面金黃色葡萄球菌和大腸桿菌生長(zhǎng)情況（×5 000，比例尺1 μm）Figure 5 SEM images of S.aureus and E.coli incubated on membranes（×5 000，scale 1 μm）

Mg 顆粒的添加量與膜的抗菌效果有顯著的相關(guān)性。菌落計(jì)數(shù)的結(jié)果顯示，PLA 的菌落數(shù)最高，隨著Mg 顆粒負(fù)載量的增加，菌落數(shù)逐漸下降。圖6 為直接接觸材料表面的菌落計(jì)數(shù)結(jié)果。與PLA 相比，10%wt Mg/PLA、20%wt Mg/PLA 和40%wt Mg/PLA 對(duì)S.aureus的抑菌率分別為（40.83±7.54）%、（67.63±10.21）%和（82.73±2.68）%。對(duì)E.coli的抑菌率分別為（42.07±4.05）%、（80.63±1.34）%和（91.58±4.44）%，其中20%wt Mg/PLA、40% wt Mg/PLA 的抑菌率顯著高于10%wt Mg/PLA 復(fù)合膜組。這可能是Mg 顆粒降解所釋放出的Mg2+與所創(chuàng)造的堿性環(huán)境綜合作用的結(jié)果。

圖6 金黃色葡萄球菌和大腸桿菌菌落的LB平板計(jì)數(shù)照片（A）及相應(yīng)樣品對(duì)金黃色葡萄球菌（B）和大腸桿菌（C）的抑菌率的定量分析Figure 6 LB plate counting photos of S.aureus and E.coli colonies（A）and quantitative analysis of bacteriostasis rate of corresponding samples against S.aureus（B）and E.coli（C）

3 討論

目前已有關(guān)于Mg 增強(qiáng)聚合物作為骨移植材料的制備方法、力學(xué)性能和生物相容性等方面的研究［20-23］。但是以往研究中較低的Mg添加量（≤10%wt）往往不足以實(shí)現(xiàn)良好的抗菌性［24］。本研究在PLA中負(fù)載較高含量的Mg，制備具有抗菌功能的復(fù)合膜。本研究表明，Mg的添加量在一定范圍內(nèi)有利于提高PLA膜的機(jī)械強(qiáng)度，而較高的Mg含量（40%wt）減弱了這種增強(qiáng)效果（圖2）。從Cifuentes等［21］的研究可以看出，Mg/PLA 復(fù)合材料填料強(qiáng)化系數(shù)隨Mg含量的增加而減小，Mg顆粒有效地促進(jìn)了PLA分子的熱降解。當(dāng)填料對(duì)熱降解的影響大于其增強(qiáng)效果時(shí)，其在PLA基質(zhì)內(nèi)的機(jī)械性能下降。本研究也與這一結(jié)果相吻合，說明一定范圍內(nèi)Mg 增強(qiáng)PLA是可行的。已經(jīng)證實(shí)，Mg增加了聚合物塑性流動(dòng)的阻力，略微降低PLA 的結(jié)晶度，在一定程度上調(diào)控PLA 劣化降解的時(shí)間［25］。Mg 顆粒的載入無疑對(duì)復(fù)合材料的力學(xué)性能有一定的調(diào)節(jié)作用。

細(xì)胞生物相容性的結(jié)果顯示，PLA膜與Mg/PLA復(fù)合膜均有良好的生物相容性，對(duì)MC3T3-E1 和L929細(xì)胞的增殖沒有不利影響。這一結(jié)果說明，本研究范圍內(nèi)的鎂添加量并未形成真正的“高鎂”環(huán)境，打破了以往較高含量Mg 顆粒加入會(huì)造成“高鎂”環(huán)境抑制細(xì)胞生長(zhǎng)［22］的猜想。對(duì)于抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果，無論是掃描電鏡下觀察還是菌落計(jì)數(shù)均表現(xiàn)出明顯的抑菌作用（圖5、6）。一般來說，材料的抗菌作用機(jī)制主要為以下兩個(gè)方面：①細(xì)菌胞膜通透性的變化，是逸出的抗菌金屬離子與細(xì)菌外膜相互作用造成的；②細(xì)菌與抗菌材料產(chǎn)生的自由基的相互作用［26-28］。在本研究中，Mg顆粒降解產(chǎn)生的氫氧根離子可以提高局部pH 值，有望在一定程度上抵消PLA持續(xù)降解晚期產(chǎn)生的酸性產(chǎn)物。在體外降解實(shí)驗(yàn)中，復(fù)合膜組的pH 值均有所升高（圖3），最終形成了更有利于抗菌的堿性環(huán)境。本研究的抑菌機(jī)制可能是抑菌金屬離子的釋放和堿性微環(huán)境對(duì)細(xì)菌外膜的影響，導(dǎo)致外膜上形成膨脹和變形。這些結(jié)構(gòu)形態(tài)的改變引起膜通透性的改變，導(dǎo)致脂多糖分子和膜蛋白的不斷釋放，最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡［26］。這一推測(cè)也與復(fù)合膜表面細(xì)菌的微觀形態(tài)相一致（圖5）。根據(jù)SEM 下觀察到的細(xì)菌黏附形態(tài)的變化，我們推測(cè)細(xì)菌對(duì)材料表面的黏附隨著Mg 的添加量的增加而減少。結(jié)果表明，細(xì)菌對(duì)Mg/PLA 復(fù)合膜的初始親和力較低，這可能與Mg 顆粒的部分降解導(dǎo)致的H2釋放有關(guān)。

細(xì)菌在生物材料表面的初始黏附是生物膜形成的關(guān)鍵階段。研究表明，生物膜中細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥性是浮游細(xì)菌的10～1 000 倍［29］。通過有效阻斷抗生素的進(jìn)入，生物膜的形成對(duì)宿主的防御和抗生素治療變得更加耐藥，從而促進(jìn)耐藥細(xì)菌的發(fā)展［30-31］。本研究的結(jié)果表明，復(fù)合膜對(duì)細(xì)菌的抑制作用隨著Mg 負(fù)載增加而升高，包括一定的殺菌效果和抑制細(xì)菌生長(zhǎng)和繁殖的作用。

本研究將Mg/PLA 復(fù)合膜作為GBR 膜對(duì)其力學(xué)性能進(jìn)行了改良，并對(duì)其抗菌性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。本研究重點(diǎn)研究了Mg 增強(qiáng)PLA 的抗菌性能，然而仍有一些局限性。首先，由于體內(nèi)降解環(huán)境的復(fù)雜性，涉及酶促反應(yīng)、炎癥反應(yīng)等，其降解特性與體外不盡相同。除此之外，作為GBR 屏障膜的替代生物材料，評(píng)估這種復(fù)合膜的成骨效果是下一步研究的重點(diǎn)。

本研究將抗菌的金屬M(fèi)g 顆粒負(fù)載到生物惰性PLA 基體中，制備了具有抗菌性的功能復(fù)合膜。20%wt Mg/PLA和40%wt Mg/PLA復(fù)合膜的表面粗糙度、抗菌性均顯著高于PLA，其中，40%wt Mg/PLA的Mg 含量最高，抗菌性也優(yōu)于其他復(fù)合膜組，但過量的Mg 添加降低了復(fù)合膜的力學(xué)性能。在24 h的降解實(shí)驗(yàn)中，復(fù)合膜組降解溶液的pH 不同程度地升高，但均處于生理范圍。綜上所述，20%wt 的Mg 負(fù)載量為Mg/PLA復(fù)合材料作為GBR屏障膜使用提供參考。