楊海涵，唐華僑，吳學淵，胥世洪，房春林通信作者

(1.成都乾坤動物藥業(yè)股份有限公司，四川 成都 611130；2.四川農業(yè)大學，四川 成都 611130；3.成都農業(yè)科技職業(yè)學院，四川 成都 611130)

0 引言

馬齒莧在《中國獸藥典》二部中收載[1]，具有清熱解毒，涼血止痢的功效?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，馬齒莧具有抗菌、抗病毒和提高免疫能力的作用，在獸醫(yī)臨床上也得到了廣泛應用。研究發(fā)現(xiàn)多糖是馬齒莧的主要成分。因此，制定了以多糖為提取指標的馬齒莧水提物制備方案，為馬齒莧制劑的進一步研發(fā)提供了參考[2-7]。

1 試驗儀器與材料

UV-1800-PC型紫外-可見光分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；3000B型旋轉蒸發(fā)儀，上海越眾儀器設備有限公司；CPA225D電子天平，賽多利斯(北京)有限公司。

馬齒莧，產地四川，成都吉安康藥業(yè)有限公司，批號20200501，符合《中國獸藥典》2020年版二部有關項的規(guī)定；D-無水葡萄糖對照品，中國食品藥品檢定研究院，含量以100%計，批號110833-200904；其他試劑為分析純。

2 試驗方法與結果

2.1 多糖含量測定方法

參照《獸藥質量標準》中黃芪多糖的含量測定方法并結合文獻報道擬定[8-12]，進行含量測定方法驗證：精密度試驗結果為RSD為0.86%<2%，重復性試驗結果為RSD 0.77%<2%，回收率試驗結果為平均回收率100.35%，RSD 1.16%<2%，穩(wěn)定性試驗結果為顯色后的樣品在2.5 h內吸光度變化不大，RSD<2%，用于馬齒莧多糖的含量測定。

2.1.1 標準曲線繪制

精密稱取干燥至恒重的無水葡萄糖0.4 g，置100 mL量瓶加水溶解并稀釋至刻度，混勻作為標準儲備溶液，精密量取標準儲備溶液用水稀釋至含葡萄糖80 μg/mL、40 μg/mL、20 μg/mL、10 μg/mL、5 μg/mL、2.5 μg/mL標準溶液，精密量取各溶液2 mL，分別置于10 mL量瓶中，各加入2%苯酚溶液0.5 mL、硫酸5 mL、水浴中加熱15 min，放冷，加水稀釋至刻度，用紫外分光光度法于490 nm波長處分別測定吸收度。以吸收度對對照品濃度進行線性回歸作圖，得標準曲線方程為Y=0.0165X+0.0132，R2=0.999，線性范圍為2.5～80 μg/mL。

2.1.2 樣品含量測定

精密量取樣品溶液(相當于原生藥0.05 g/mL)5 mL，置于100 mL量瓶中，加入30%的硫酸鋅溶液2 mL，于水浴中加熱5 min后，振搖下立即加入亞鐵氰化鉀試液2 mL，冷卻后加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，備用。按照2.1.1的方法測定吸光度，并用標準曲線計算樣品溶液的多糖含量。

2.2 馬齒莧的提取

2.2.1 單因素試驗

通過預試驗并參考文獻[13-15]，確定采用水煎煮提取方法對馬齒莧提取工藝進行研究，分別對料液比(g=mL)、煎煮時間、煎煮次數、水的pH值等進行單因素考察。

2.2.2 正交試驗優(yōu)化馬齒莧提取工藝

根據單因素試驗結果，選擇L9(43)正交表的試驗設計對馬齒莧的提取工藝進行優(yōu)化研究，在單因素試驗“煎者次數”研究中，發(fā)現(xiàn)第2次煎煮得到的提取液中多糖含量僅為第1次的6.0%，同時為降低能耗，直接確定煎者次數為1次。

3.2.2.1 因素與水平

因素與水平設計如表1所示。

表1 因素與水平表

3.2.2.2 正交試驗結果與分析

采用L9(43)正交表試驗設計，按已定的檢測方法，檢測各提取液中馬齒莧多糖的含量，并對結果進行分析。試驗結果與分析見表2、表3。

表2 正交試驗結果統(tǒng)計表

表3 方差分析表

正交試驗結果表明，影響多糖提取率的因素順序為：煎煮時間(B)>料液比(A)>水的pH值(C)；其中煎煮時間對提取率影響最大為主要因素，料液比和水的pH值對提取率有一定影響，為次要因數，但方差分析結果顯示3個因素對馬齒莧多糖提取率的影響均不顯著(F<19)。因此最佳提取工藝為A3B2C3，即取馬齒莧藥材1 kg，加水20 kg(pH 6.5)，煎煮2 h，過濾，濃縮即得。

2.2.2.3 驗證試驗

為驗證正交試驗結果的準確性和合理可行，用正交試驗結果對馬齒莧提取進行了重復試驗。試驗結果得到3次驗證試驗結果基本一致，馬齒莧多糖平均含量為59.60 mg/g藥材，均高于正交試驗中的多糖含量數據，表明篩選的提取工藝合理可行，具有很好的重現(xiàn)性和可操作性，如表4所示。

表4 驗證試驗結果 單位：mg/g

2.2.2.4 濃縮工藝考察

取“驗證試驗”項下樣品，分別于減壓(溫度60℃～70℃，真空度0.07～0.09 MPa)濃縮至密度為1.3～1.4 g/mL(40℃)的浸膏，多糖含量與濃縮前比較變化不明顯，如表5所示。

表5 濃縮工藝考察

3 結論

通過單因素試驗和正交試驗得出馬齒莧的最佳水提取工藝為，取馬齒莧藥材1 kg，加20 kg水(pH 6.5)，煎煮2 h，濾過，濃縮即得。60℃～70℃，真空度0.07～0.09 MPa條件下濃縮至密度為1.3～1.4 g/mL(40℃)的凝膠狀浸膏對馬齒莧多糖含量無影響。文獻資料中提出用酶分解法、用微波輔助或直接用微波提取法進行提取[11，16-17]，但目前市場上對中藥的提取主要還是煎煮、浸提、回流等方法，對設備的要求不高，且成本較低，更容易應用于生產實際中，符合獸藥市場的需求。