裴徐梨 胡文婷 荊贊革 焦鵬 朱麗瑞 宋立曉 嚴(yán)繼勇

摘要： 蔗糖轉(zhuǎn)化酶（ INV ）編碼基因廣泛參與植物的生長發(fā)育，在果實成熟期可影響果實品質(zhì)。本研究利用生物信息學(xué)手段對中國南瓜 INV 基因家族進行鑒定和分析。結(jié)果表明，從中國南瓜中鑒定出18個 INV 基因家族成員，其功能分為酸性轉(zhuǎn)化酶和中性/堿性轉(zhuǎn)化酶兩大類。該家族成員在11條染色體上不均勻分布，且僅有1對串聯(lián)重復(fù)基因。表達模式分析結(jié)果顯示，CmoCh06G004890.1在根中的相對表達量高于其他 INV 基因家族成員，CmoCh01G010160.1和CmoCh06G004890.1在果實中的相對表達量較高。葫蘆科作物 INV 系統(tǒng)進化分析結(jié)果表明，中國南瓜、印度南瓜和美洲南瓜的大多數(shù) INV 基因均聚為一簇，具有較近的親緣關(guān)系。本研究結(jié)果為進一步分析中國南瓜 INV 基因的生物學(xué)功能以及提高中國南瓜品質(zhì)提供了一定的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 中國南瓜; ?INV 基因; 序列特征; 進化分析

中圖分類號： S642.1?? 文獻標(biāo)識碼： A?? 文章編號： 1000-4440（2022）03-0782-08

Analysis on identification， evolution and expression of sucrose invertase gene （ INV ） in ?Cucurbita moschata

PEI Xu-li 1 ， HU Wen-ting 1 ， JING Zan-ge 1 ， JIAO Peng 1 ， ZHU Li-rui 1 ， SONG Li-xiao 2 ， YAN Ji-yong 3

（1.College of Agronomy and Life Sciences， Kunming University， Kunming 650214， China; 2.Institute of Agricultural Resources and Environment， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China; 3.Institute of Vegetable Crops， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China）

Abstract： Invertase （ INV ） encoding genes are widely involved in plant growth and development， and can affect fruit quality during ripening stage. In this study， ?INV ?gene family of ?Cucurbita moschata ?was identified and analyzed by bioinformatic methods. The results showed that， 18 members of ?INV ?gene family were identified from ?C. moschata ， and their corresponding functions were encoding acid ?INV ?and neutral/alkaline ?INV . The members of ?INV ?gene family distributed unevenly on 11 chromosomes and there only existed one pair of tandem duplicated genes. Analysis of expression pattern showed that， the relative expression level of CmoCh06G004890.1 in roots of ?C. moschata ?was higher than other members of ?INV ?gene family. The relative expression levels of CmoCh01G010160.1 and CmoCh06G004890.1 were relatively high in fruits of ?C. moschata . Results of phylogenetic analysis of ?INV ?genes in Cucurbitaceae crops showed that， Most of the ?INV ?genes from ?C.moschata ， ?C.maxima ?and ?C. pepo ?gathered into one cluster and had close genetic relationships. The results can provide theoretical basis for further analyzing of the biological functions of ?INV ?genes and improving fruit quality of ?C. moschata .

Key words： ?Cucurbita moschata ; invertase （ INV ） gene; sequence characteristics; evolutionary analysis

蔗糖轉(zhuǎn)化酶（ INV ） 是高等植物蔗糖代謝的關(guān)鍵酶類，與葡萄糖和果糖的水解有重要關(guān)系。按照 INV 亞細胞定位與最適pH的分類標(biāo)準(zhǔn)，可將其分為細胞質(zhì)轉(zhuǎn)化酶（ CIN ） 、液泡轉(zhuǎn)化酶（ VIN ） 和細胞壁轉(zhuǎn)化酶（ CWIN ） 3種類型。液泡轉(zhuǎn)化酶和細胞壁轉(zhuǎn)化酶屬于酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶，細胞質(zhì)轉(zhuǎn)化酶屬于中性或堿性蔗糖轉(zhuǎn)化酶 [1] 。

大量研究結(jié)果表明，蔗糖轉(zhuǎn)化酶在植物生長發(fā)育、果實成熟、糖分平衡及非生物脅迫等方面具有重要作用。目前，已在水稻、番茄、辣椒等作物中克隆得到蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因 [2-4] 。在甘薯中， CIN 和 VIN 是調(diào)控塊根中己糖含量的關(guān)鍵酶類 [5] 。酸性轉(zhuǎn)化酶不僅在甜瓜果實的發(fā)育中起重要作用，還控制甜瓜果實中蔗糖的含量 [6] 。植物缺失蔗糖轉(zhuǎn)化酶會造成生長缺陷，且不能完全通過外源加入的己糖來彌補 [7] 。Tang等 [8] 通過沉默GmCIF1表達，使 CWIN 通過調(diào)控蔗糖代謝等途徑來協(xié)調(diào)大豆種子的成熟。Qian等 [9] 對茶樹蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因進行分析發(fā)現(xiàn)，這些基因均參與調(diào)節(jié)茶樹生長和發(fā)育以及對各種非生物脅迫的響應(yīng)。

中國南瓜（ Cucurbita moschata ） 屬葫蘆科南瓜屬植物，其果實中富含淀粉等糖類物質(zhì)，糖類物質(zhì)含量直接影響中國南瓜果實風(fēng)味和口感。本研究以中國南瓜蔗糖轉(zhuǎn)化酶為研究對象，通過生物信息學(xué)方法，鑒定該基因家族的數(shù)目和理化性質(zhì)，同時分析 INV 蛋白質(zhì)基序結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進化和表達模式。本研究結(jié)果可為進一步分析中國南瓜 INV 基因的生物學(xué)功能以及提高中國南瓜品質(zhì)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 中國南瓜 INV 基因家族的成員鑒定

以擬南芥蔗糖轉(zhuǎn)化酶 INV 基因家族的氨基酸序列為種子序列在中國南瓜基因組數(shù)據(jù)庫（http：//cucurbitgenomics.org/organism/9） 中檢索 INV 基因（ E-vaule <10 -5 ） 。同時從Pfam網(wǎng)站（http：//pfam.xfam.org/）下載 INV 基因的隱馬爾可夫模型進行全基因組檢索。利用Pfam網(wǎng)站驗證以上2種方法獲取的候選基因是否含有該家族保守結(jié)構(gòu)域 [10] 。

1.2 中國南瓜 INV 基因家族序列特征分析

利用ProtParam tool （https：//web.expasy.org/protparam/） 對中國南瓜 INV 基因序列的相對分子質(zhì)量、氨基酸數(shù)量、等電點、穩(wěn)定性系數(shù)、親疏水性等進行分析 [11] 。對鑒定出的中國南瓜 INV 基因家族成員利用GSDS軟件分析其基因結(jié)構(gòu)。利用MEME （http：//meme-suite.org/tools/meme） 在線軟件分析 INV 蛋白的保守域和結(jié)構(gòu)元件（最大元件參數(shù)數(shù)量設(shè)置為10個，最佳寬度的元件數(shù)量設(shè)置為6～ 50個） 。使用Web CD-Search Tool （https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi） 進行保守結(jié)構(gòu)域分析。利用TBtools軟件進行圖形可視化。

1.3 中國南瓜 INV 基因家族的表達模式分析

從CuGenDB數(shù)據(jù)庫中下載中國南瓜不同組織器官（包括根、莖、葉、果實）的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。利用TBtools分析 INV 基因的表達情況，并繪制熱圖。

1.4 葫蘆科 INV 基因家族的系統(tǒng)進化分析

參照方法1.1，從印度南瓜、美洲南瓜、西瓜、黃瓜、冬瓜和葫蘆等物種中鑒定出 INV 基因家族成員，使用MEGA 6.0的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。相關(guān)參數(shù)設(shè)置為：Bootstrap method 1 000，Poisson model，Partial deletion 95，其余參數(shù)為默認(rèn)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 中國南瓜 INV 基因家族的鑒定

根據(jù)檢索結(jié)果和保守結(jié)構(gòu)域驗證結(jié)果，最終鑒定到18個南瓜 INV 基因家族成員，其中，11個為酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶成員，7個為中性或堿性蔗糖轉(zhuǎn)化酶成員。染色體定位分析發(fā)現(xiàn)，僅1對為串聯(lián)重復(fù)基因。其中，5個 INV 基因家族成員（CmoCh17G004560.1、CmoCh17G004570.1、CmoCh17G004620.1、C￣m￣o￣C￣h￣1￣7￣G￣0￣0￣6￣9￣1￣0￣.1和CmoCh17G006930.1）分布在第17號染色體上。此外，除1號、14號、15號染色體有2個成員外，其余染色體上僅有1個成員（圖1、表1） 。

2.2 中國南瓜 INV 基因家族的序列特征分析

中國南瓜 INV 基因家族的CDS序列長度為1 299～ 2 889 ?bp，氨基酸長度為432～ 962 aa。其中，基因序列最長的為CmoCh14G003190.1，最短的為CmoCh17G004570.1 （表1） 。

通過繪制中國南瓜 INV 基因家族的內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)（圖2），發(fā)現(xiàn)該基因家族的基因結(jié)構(gòu)差異較大。CmoCh14G003190.1基因的內(nèi)含子和外顯子數(shù)均較高，分別為13和14個。7個 INV 基因（CmoCh17G004620.1、CmoCh06G004890.1、C￣m￣o￣C￣h￣1￣7￣G￣0￣0￣6￣910.1、CmoCh01G017810.1、CmoCh15G014910.1、CmoCh04G014980.1、CmoCh14G016100.1） 具有6個內(nèi)含子，而CmoCh01G010160.1和￣C￣m￣o￣C￣h￣0￣9￣G￣0￣1￣1￣190.1僅包含3～ 4個內(nèi)含子。

2.3 中國南瓜 INV 基因家族的理化性質(zhì)分析

理化性質(zhì)分析結(jié)果表明，中國南瓜 INV 基因家族蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量為48 469～ 107 835 ，等電點為5.12～ 9.29，8個 INV 基因編碼的蛋白質(zhì)具有跨膜結(jié)構(gòu)域，亞細胞定位顯示INV蛋白位于細胞壁、液泡或葉綠體，平均親水性為-0.461～ -0.071 ，均為親水性蛋白質(zhì)（表1） 。

2.4 中國南瓜 INV 基因家族的表達模式分析

分析中國南瓜 INV 基因家族成員在不同器官中的表達情況，結(jié)果顯示，18個 INV 基因在中國南瓜的根、莖尖、葉和果實中均表達（圖3） 。CmoCh01G010160.1和C￣m￣o￣C￣h￣0￣6￣G￣0￣0￣4890.1在果實中的相對表達量較高，CmoCh06G004890.1在根中的表達量均高于其他基因家族成員， CmoCh17G006930.1和CmoCh04G014980.1在葉片中的相對表達量相對較高。5個基因家族成員（CmoCh17G004560.1、C￣m￣o￣C￣h￣1￣7￣G￣0￣0￣4620.1、CmoCh17G004570.1、CmoCh05G001000.1、CmoCh15G012070.1）在不同器官中的相對表達量均較低 （圖3） 。

2.5 葫蘆科 INV 基因家族的系統(tǒng)進化樹分析

使用MEGA軟件構(gòu)建18個中國南瓜 INV 基因成員的進化樹（圖4） ，結(jié)果將 INV 基因家族按編碼物質(zhì)分為中性/堿性轉(zhuǎn)化酶和酸性轉(zhuǎn)化酶兩大類。 INV ?Ⅰ大類編碼酸性轉(zhuǎn)化酶，分為2個分支，其中1個分支的成員（CmoCh15G012070.1和CmoCh15G014910.1）編碼液泡轉(zhuǎn)化酶（ VIN ） ，另一分支中的9個成員均編碼細胞壁轉(zhuǎn)化酶（ CWIN） ?。 INV ?Ⅱ大類編碼中性/堿性轉(zhuǎn)化酶，均為細胞質(zhì)轉(zhuǎn)化酶（ CIN） ?，其中CmoCh18G009420.1和CmoCh04G014980.1、CmoCh14G016100.1和CmoCh12G010220.1分別位于1個單獨的分支。

為明確葫蘆科植物之間 INV 基因家族成員的親緣關(guān)系，將鑒定到的中國南瓜的18個、印度南瓜 （ Cucurbita maxima ） 的22個、美洲南瓜（ Cucurbita pepo ）的19個、西瓜（ Citrullus lanatus ）的12個、甜瓜（ Cucumis melo ） 的12個、黃瓜（ Cucumis sativus ） 的13個、冬瓜（ Benincasa hispida ） 的11個、葫蘆（ Lagenaria siceraria ） 的12個 INV 基因家族成員進行系統(tǒng)進化樹構(gòu)建，結(jié)果（圖5）表明，胡蘆科 INV 基因家族在進化樹中分為2支。分支Ⅰ編碼酸性轉(zhuǎn)化酶，分支Ⅱ編碼中性/堿性轉(zhuǎn)化酶。中國南瓜、印度南瓜和美洲南瓜的大多數(shù) INV 基因均聚為一簇，黃瓜與甜瓜的 INV 基因在進化樹中也較常聚為一類，如CsaV33G015320.1和MELO3C006727T1，具有較近的親緣關(guān)系。西瓜與葫蘆的部分基因如Cla97C05G099220.1和Lsi045014210.1等，都具有非常高的同源性。利用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，也表現(xiàn)出類似的結(jié)果。

3 討 論

INV 基因是參與植物體形態(tài)建成和生長發(fā)育的關(guān)鍵蔗糖代謝酶編碼基因，是碳水化合物代謝的關(guān)鍵構(gòu)成部分。 INV 基因家族在不同植物中擁有不同的成員數(shù)量，目前在擬南芥、葡萄和水稻中均已鑒定到8個，草莓中鑒定到9個，楊樹中鑒定到16個。本研究通過生物信息學(xué)方法共鑒定到18個南瓜 INV 基因，其中7個為蔗糖中性/堿性轉(zhuǎn)化酶成員，11個為酸性轉(zhuǎn)化酶成員。

基因的理化性質(zhì)研究對基因功能研究具有重要作用。苗小榮等 [12] 研究發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛的中性/堿性轉(zhuǎn)化酶（DoNI2） 的等電點為6.38，疏水性的平均值為-0.232，預(yù)測為親水性蛋白質(zhì)，預(yù)測亞細胞定位在線粒體上。陽江華等 [13] 在橡膠中進行 INV 亞細胞定位預(yù)測，結(jié)果表明，堿性轉(zhuǎn)化酶（HbNIN8） 定位在葉綠體上。本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果相似，鑒定到的7個南瓜中性/堿性轉(zhuǎn)化酶和11個酸性轉(zhuǎn)化酶的平均等電點分別為6.16和7.43，平均疏水性分別為-0.191和-0.316，均為親水性蛋白質(zhì)。亞細胞定位預(yù)測結(jié)果顯示，酸性轉(zhuǎn)化酶定位于細胞壁和液泡上，中性/堿性轉(zhuǎn)化酶定位于葉綠體上，但精確定位還需要進一步驗證。

前人在分析棉花 INV 成員的系統(tǒng)進化關(guān)系時將棉花 INV 基因家族分為中性/堿性轉(zhuǎn)化酶和酸性轉(zhuǎn)化酶2個大亞族，其中第1個大亞族又可分為2個小亞族 [14] 。王海波等 [15] 將鑒定到的16個小桐子 INV 基因家族成員聚類為兩大家族3個亞家族。同樣，本研究通過進化樹分析將中國南瓜18個 INV 基因分為兩大類，即中性/堿性轉(zhuǎn)化酶編碼基因和酸性轉(zhuǎn)化酶編碼基因。進一步對葫蘆科 INV 基因家族成員的進化分析發(fā)現(xiàn)，美洲南瓜、印度南瓜和中國南瓜的 INV 基因家族成員同源性最高，葫蘆和西瓜的 INV 基因家族成員同源性較高。此外，吳曉慧等 [16] 研究發(fā)現(xiàn)木薯轉(zhuǎn)化酶相關(guān)基因家族的保守性較高，帥良等 [17] 研究發(fā)現(xiàn)龍眼中3個中性轉(zhuǎn)化酶的氨基酸序列高度保守，且都有2個催化殘基。本研究通過對中國南瓜 INV 基因家族的序列和結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，各 INV 基因成員的保守度高，這一點與前人的結(jié)論基本符合。

蔗糖轉(zhuǎn)化酶可通過不可逆降解葡萄糖和果糖而影響果實糖分積累，進而影響果品質(zhì)量 [18] 。同為葫蘆科植物的甜瓜嫁接后，發(fā)育階段的功能性葉片中酸性轉(zhuǎn)化酶和中性/堿性蔗糖轉(zhuǎn)化酶的活性增加，后期蔗糖磷酸合成酶和水蘇糖合成酶活性提高，從而顯著促進葉片中糖類物質(zhì)向果實的轉(zhuǎn)移 [19] 。中性/堿性蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性在大多數(shù)蔗糖貯藏型植物的未成熟果實中較高，隨著果實成熟其活性逐漸降低 [20] 。前人研究發(fā)現(xiàn)，甜橙和甜瓜在果實成熟過程中酸性轉(zhuǎn)化酶含量逐漸降低，蔗糖含量逐漸增加 [21-22] 。郭利軍等 [23] 在研究中發(fā)現(xiàn)，在芒果不同發(fā)育階段，中性/堿性轉(zhuǎn)化酶的表達量差異較大，開花后10～ 40 d，果肉中表達量為0.028 9 。當(dāng)果實完全成熟時，果肉中中性/堿性轉(zhuǎn)化酶表達水平降低，只有0.000 7 。本研究發(fā)現(xiàn)多個 INV 基因在果實中的表達量較低，推測這些基因在中國南瓜果實成熟過程中具有重要的作用。

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（責(zé)任編輯：陳海霞）

收稿日期：2021-08-07

基金項目：昆明學(xué)院引進人才科研項目 （YJL19009）;云南省教育廳科學(xué)研究基金項目 （2021Y717、2021Y721）

作者簡介：裴徐梨（1990-），女，云南個舊人，博士，講師，研究方向為蔬菜分子生物學(xué)。（E-mail）xuliP1990@163.com

通訊作者：宋立曉，（E-mail）56785633@qq.com