段修軍 孫國波 張蕾 陸艷鳳 王麗華 田培余 劉嘉晟 楊孟廣

摘要： 為挖掘黑羽番鴨肉質風味相關候選基因，通過對黑羽番鴨胸肌、腿肌中揮發(fā)性風味物質進行測定，并通過Illumina HiSeq2500高通量測序進行轉錄組對比分析，結合參考基因組對所獲得的序列進行序列比對、基因注釋和差異表達等分析，篩選出差異表達基因并進行GO富集分析。通過熒光定量 PCR（Real-time PCR，qRT-PCR）方法檢測4個差異候選基因表達水平，驗證測序結果的可靠性。結果表明，黑羽番鴨胸肌中揮發(fā)性風味物質辛醛、2，3-辛二酮含量顯著高于腿肌，3-羥基-2-丁酮含量顯著低于腿?。?P < 0.05）。通過參考基因組比對和差異表達分析，初步獲得614個差異表達基因，171個差異基因在黑羽番鴨腿肌組織上調表達，443個差異基因在黑羽番鴨腿肌組織下調表達。結合GO分析和KEGG富集分析，最終獲得了20個候選功能基因，它們分別參與機體氨基酸形成、糖代謝以及脂肪代謝等生物過程，其中10個差異候選基因在黑羽番鴨胸肌中參與肌內脂肪代謝過程，這些基因可能通過形成肌內揮發(fā)性風味物質進而影響肌肉風味。qRT-PCR 驗證結果表明，篩選出的差異候選基因表達趨勢與轉錄組測序中表達的趨勢相似，說明測序結果可靠。在黑羽番鴨胸肌、腿肌中揮發(fā)性風味物質對比基礎上，結合RNA-Seq技術對黑羽番鴨肉質風味前體物質特異性形成機制進行綜合分析，篩選出ACOT11、APOA1、FABP3等脂肪代謝相關的差異基因可能與黑羽番鴨胸、腿肌肉質風味形成相關。

關鍵詞： 黑羽番鴨; 揮發(fā)性風味物質; 脂肪代謝; 轉錄組測序

中圖分類號： S834+.89?? 文獻標識碼： A?? 文章編號： 1000-4440（2022）03-0739-09

Identification of candidate genes related to meat flavor in black Muscovy duck based on RNA-Seq

DUAN Xiu-jun， SUN Guo-bo， ZHANG Lei， LU Yan-feng， WANG Li-hua， TIAN Pei-yu， LIU Jia-sheng， ?YANG Meng-guang

（Jiangsu Agri-animal Husbandry Vocational College， Taizhou 225300， China）

Abstract： To explore the candidate genes related to meat flavor in black Muscovy duck， volatile flavor compounds in breast and leg muscles of black Muscovy duck were determined， and transcriptome analysis was performed by Illumina HiSeq2500 high-throughput sequencing. Based on reference genome， the obtained sequences were analyzed by sequence alignment， gene annotation and differential expression analysis， and differentially expressed genes were screened out and GO enrichment analysis was performed. Moreover， to verify the sequencing results， qRT-PCR was used to detect the expression levels of four differential candidate genes. Results showed that the contents of octanal and 2，3-octanedione in breast muscle were significantly higher than those in leg muscle， and the content of 3-hydroxy-2-butanone in breast muscle was significantly lower than that in leg muscle （ P < 0.05）. Through genome comparison and differential expression analysis， 614 differentially expressed genes were preliminarily obtained， 171 differentially expressed genes were up-regulated and 443 differentially expressed genes were down-regulated in leg muscles of black Muscovy duck. By GO and KEGG enrichment analysis， 20 functional candidate genes were finally obtained. These candidate genes were involved in biological processes， such as amino acid formation， glucose metabolism and fat metabolism. Among them， ten differentially expressed candidate genes were involved in fat metabolism in breast muscle of black Muscovy duck， and these genes may affect muscle flavor by forming intramuscular volatile flavor compounds. Results of qRT-PCR verification showed that the expression trends of screened differentially expressed candidate genes were similar to those in transcriptome sequencing， indicating that the sequencing results were reliable. Based on the comparation of volatile flavor compounds in breast and leg muscles of black Muscovy duck， the specific formation mechanism of meat flavor precursors in black Muscovy duck was comprehensively analyzed， differentially expressed genes related to fat metabolism such as ACOT11， APOA1， FABP3 may be related to the formation of meat flavor in breast and leg muscles of black Muscovy duck.

Key words： black Muscovy duck; volatile flavor compounds; fat metabolism; transcriptome sequencing

番鴨（ Cairna moschata ）發(fā)源于南美洲和中美洲的熱帶，因其鴨嘴的基部和眼圈周圍具有黑色或紅色的肉瘤被稱為瘤頭鴨，又因其鴨肉瘦肉含量高，肉質鮮香，具有野禽風味的特點被稱為麝香鴨 [1] 。番鴨按照羽色可以分為白羽、黑羽和花羽3種類群，其中黑羽番鴨因羽色和肉質特異性深受消費者喜愛，但是其體型較小，生長速度較慢 [2-3] 。為進一步提高黑羽番鴨的生產性能，江蘇農牧科技職業(yè)學院自2000年開始，利用法國番鴨和福建黑羽番鴨進行選育，構建了羽色、脛、爪全黑的優(yōu)質黑羽番鴨類群，其具有生長速度快、體型適中、脂肪含量低、肉質鮮美等優(yōu)點 [4-5] 。

孫國波等 [3] 對公、母黑羽番鴨不同階段胸、腿肌肉質進行對比分析，結果表明黑羽番鴨膽固醇含量較低，氨基酸豐富且含量高，公母鴨胸、腿肌營養(yǎng)成分存在一定差異性。王錦鋒等 [6] 研究結果表明，黑羽番鴨胸肌的水分比腿肌高，腿肌粗蛋白質含量比胸肌高。吉文林等 [7] 對黑羽番鴨屠宰性能和肉質的研究結果表明，黑羽番鴨公鴨胸、腿肌的剪切力顯著高于母鴨，公鴨肌肉中（胸、腿?。﹑H 值顯著高于母鴨（胸、腿?。Ａ种t等 [8] 對不同羽色（黑羽、白羽以及黑白花羽）的公母番鴨進行屠宰性能測定對比分析，發(fā)現(xiàn)雄性黑羽番鴨的屠宰性能較好。錢建中等 [4] 研究結果表明，黑羽番鴨脂肪含量低于北京鴨、櫻桃谷鴨，且黑羽番鴨公鴨胸肌剪切力和腿肌失水率顯著高于母鴨。上述關于黑羽番鴨肉用性能的相關研究僅局限于個體肉質分析水平，對于黑羽番鴨胸、腿肌肉質性狀的形成機制仍不清楚。

鴨肉的風味主要由鴨肉中的揮發(fā)性風味物質，即鴨肉中能產生揮發(fā)性肉香味的化合物成分，經加熱后形成的特殊風味，是消費者對鴨肉食品產生的一系列生理反應和感官評定，是影響鴨肉食用口感的一個重要因素 [3，9] 。從基因組宏觀層面對黑羽番鴨肉質性狀的調控機制進行深度挖掘，可以挖掘黑羽番鴨肉質風味形成的關鍵基因。本研究以黑羽番鴨為研究對象，通過對黑羽番鴨胸肌、腿肌中揮發(fā)性風味物質進行測定，結合RNA-Seq轉錄組測序，對黑羽番鴨肉質風味前體物質特異性沉積機制進行系統(tǒng)、全面的綜合分析，為培育優(yōu)質肉用黑羽番鴨提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用的黑羽番鴨由江蘇農牧科技職業(yè)學院培育，選擇具有相同遺傳背景、同批孵化、同批出雛的黑羽番鴨，所用個體均在同一環(huán)境下飼養(yǎng)至300日齡。

1.2 樣品采集

在黑羽番鴨大群體中隨機抽樣6只（公鴨3只，母鴨3只），按照國家實驗動物處理行為準則進行屠宰，分別采取同一部位的胸肌、腿肌組織樣本。將同一樣本分為2組：一組迅速放入-80 ℃ 冰柜中速凍，以供測定分析揮發(fā)性風味物質含量;另一組放入-80 ℃ 冰箱保存，以供進行轉錄組測序。

1.3 試驗方法

1.3.1 揮發(fā)性風味物質測定 參考王衛(wèi)等 [10] 方法，利用氣-質聯(lián)用儀（Trace DSQ GC-MS）進行黑羽番鴨胸肌、腿肌中揮發(fā)性風味物質測定，并獲得各成分相對含量。

1.3.2 RNA提取及轉錄組測序 通過Trizol法提取各肌肉樣本組織總RNA，經RNA質檢后進行轉錄組測序 [11] 。

1.3.3 測序數(shù)據處理及分析 結合測序獲得的數(shù)據，對比參考基因組，獲得黑羽番鴨胸、腿肌肉組織樣本的特異轉錄組序列信息，完成基因組定位分析。在上述比對結果的基礎上，使用htseq-count（v0.6.0）軟件 [12] 統(tǒng)計每個轉錄本的表達水平，而后對所有基因進行對比分析，選取FDR（False discovery rate，錯誤發(fā)現(xiàn)率）小于0.05且差異倍數(shù)（FC）大于等于2的基因作為候選差異基因。最后通過GO（Gene ontology，基因本體）進行差異基因功能注釋分析，以及KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes， 京都基因與基因組百科全書）進行通路富集分析 [13] 。

1.3.4 qRT-PCR檢測 隨機抽取方法1.3.2中差異表達基因4個，以反轉錄得到的黑羽番鴨胸、腿肌肉組織（樣本號1～ 6）的cDNA為模板進行qRT-PCR（表1）檢測，檢驗上述基因在黑羽番鴨胸、腿肌肉組織的表達規(guī)律與測序分析結果是否一致。

1.4 數(shù)據分析

qRT-PCR結果分析采用 2 -△△ Ct? 方法，SPASS 20.0軟件對試驗所有數(shù)據進行 t 檢驗，以 P<? 0.05視為差異顯著， P<? 0.01視為差異極顯著 [14] 。

2 結果與分析

2.1 黑羽番鴨胸肌、腿肌中揮發(fā)性風味物質含量

對黑羽番鴨胸肌、腿肌中的揮發(fā)性風味物質進行分離鑒定，通過NIST數(shù)據庫進行檢索，而后結合參考文獻[15]，篩選出可能與黑羽番鴨肉質風味相關的7種揮發(fā)性風味物質。由表2可知，黑羽番鴨胸肌中辛醛、2，3-辛二酮含量顯著高于腿肌，3-羥基-2-丁酮含量顯著低于腿肌，而正戊醇、甲基庚烯酮、壬醛以及正庚醇在胸、腿肌中含量無顯著差異。

2.2 黑羽番鴨胸肌、腿肌轉錄組測序分析

共構建300日齡公、母黑羽番鴨的胸肌、腿肌各3個組織樣品的轉錄組文庫，對測序初始文庫進行質量控制篩選，去除帶接頭、無法確定堿基信息以及低質量的測序數(shù)據（reads），獲得的篩選數(shù)據結果如表3所示。300日齡公、母黑羽番鴨的胸肌、腿肌12個樣品測序后獲得39 527 132～ 54 977 176 條初始數(shù)據，而后經去除接頭以及低質量數(shù)據篩選，獲得37 824 878～ 52 542 526 條有效數(shù)據。過濾后有效數(shù)據占原始數(shù)據的比例大于94%，表明本試驗構建的黑羽番鴨胸肌、腿肌12個樣品文庫質量較好。另外，過濾后有效數(shù)據中準確率在99.9%以上的堿基總數(shù)占93%以上，進一步說明本試驗測序結果質量較好。綜上所述，本試驗構建的公、母黑羽番鴨的胸肌、腿肌12個組織轉錄組文庫質量較好，可用于后續(xù)差異基因功能分析，保證了研究結果的可靠性。

2.3 黑羽番鴨腿肌與胸肌差異基因篩選及功能分析

通過FPKM值 [9] 計算轉錄組測序所捕獲的基因參考表達值，以黑羽番鴨腿肌組織為對照，黑羽番鴨胸肌組織為試驗組，計算所捕獲基因的差異倍數(shù)（Fold change值）。為聚焦關鍵基因，篩選黑羽番鴨腿肌對比黑羽番鴨胸肌基因表達差異值|log2 ??Fold change |≥1（ P < 0.05）的差異基因作為黑羽番鴨胸肌、腿肌組織的候選差異基因，而后根據差異基因的 Fold change 對數(shù)值以及統(tǒng)計學顯著程度繪制候選差異基因的火山圖（圖1），以標示黑羽番鴨胸肌、腿肌組織差異基因的分布情況。最終篩選出614個差異基因，其中171個差異基因上調表達（黑羽番鴨腿肌對比黑羽番鴨胸肌），443個差異基因下調表達（黑羽番鴨腿肌對比黑羽番鴨胸?。?/p>

2.4 黑羽番鴨腿肌與胸肌差異基因GO功能富集分析

為探究黑羽番鴨腿肌與黑羽番鴨胸肌差異基因的功能，結合GO數(shù)據庫對上述篩選獲得的614個顯著差異表達基因（|log2 ??Fold change |≥1（ P < 0.05）進行基因功能富集分類，差異基因分別富集至分子功能（Molecular function，MF）、細胞組分（Cellular component，CC）以及生物過程（Biological process，BP）3個方面。為進一步聚焦614個顯著差異基因在黑羽番鴨胸、腿肌肉組織風味物質形成中的作用，篩選在上述3類分組中前10的功能亞類（圖2）。在MF功能中，黑羽番鴨胸、腿肌肉組織的差異表達基因在無機分子實體跨膜轉運蛋白活性（Inorganic molecular entity transmembrane transporter activity）與底物特異性通道活性（Substrate-specific channel activity）中所占比例最大，分別聚集到33和24個差異表達基因。在BP功能中，細胞通訊的調控（Regulation of cell communication）與信號調節(jié)（Regulation of signaling）富集到的差異基因數(shù)目最多，各有60個差異基因。在CC功能中，差異基因在質膜組成成分（Integral component of plasma membrane）中所占的比例最高（46個差異基因），信號調節(jié)（Regulation of signaling）次之（36個差異基因）。

2.5 黑羽番鴨腿肌與胸肌差異基因KEGG通路注釋

為深入解析差異基因在黑羽番鴨胸肌、腿肌風味物質形成中的作用，通過KEGG信號通路數(shù)據庫對上述篩選獲得的614個顯著差異表達基因進行通路注釋，共富集到109條差異表達的信號通路。以差異表達基因在此Pathway全部基因中所占的比例（GeneRatio）和 p 值進行篩選。GeneRatio越大，表示富集的程度越大; p 值越接近于0，表示富集越顯著。由此篩選出富集最顯著的10條差異信號通路（圖3），包括焦點黏連（Focal adhesion）信號通路、PI3K-Akt（PI3K-Akt signaling pathway）信號通路以及Hippo（Hippo signaling pathway）信號通路等。

2.6 黑羽番鴨風味物質相關的差異表達基因篩選

結合上述測序結果、差異基因篩選及功能分析，獲得多個與風味物質形成有關的基因存在顯著差異，表4列舉出黑羽番鴨胸肌、腿肌轉錄組中與風味物質相關的差異表達前20個基因（TOP20）及其功能描述。根據GO分析以及KEGG功能注釋，其中基因LOC101793529、LOC101794721、NIM1K和SHMT1與氨基酸形成有關，基因 GPI 、 LDHB ?、PFKFB3、 PKM 參與糖代謝生物過程，剩余大部分差異基因與機體脂肪、脂肪酸代謝相關，例如基因ACOT11、ACSBG1、FABP3、ELOVL6和LOC101790670等。

為了進一步研究這些差異基因之間的互作關系，使用STRING（v.11.5）數(shù)據庫構建蛋白質互作網絡分析圖。在黑羽番鴨胸肌、腿肌組織風味物質相關差異基因TOP20中，共鑒定出15種已知編碼蛋白質，其中13種蛋白質被發(fā)現(xiàn)參與2組蛋白質相互作用（圖4）。

2.7 黑羽番鴨腿肌與胸肌差異表達基因熒光定量驗證

為驗證黑羽番鴨胸、腿肌轉錄組差異基因測序結果，分別選擇表4中黑羽番鴨腿肌高表達基因LOC101790670、PFKFB3和胸肌高表達基因LOC101792626、FABP3以 GADPH 為內參基因進行qRT-PCR 驗證。qRT-PCR結果（圖5）顯示：上述4個差異基因在黑羽番鴨胸肌和腿肌組織中的上、下調表達規(guī)律與本試驗通過黑羽番鴨胸肌和腿肌組織轉錄組測序獲得的上、下調表達規(guī)律一致，證實本試驗轉錄組測序獲得的結果較為準確，所篩選出的差異基因可信，可用于后續(xù)的功能驗證分析。

3 討 論

黑羽番鴨生長速度快、體型適中，其鴨肉中瘦肉含量高、肉質鮮美，又因其具有獨特的野禽風味而深受廣大消費者喜愛 [1-2] 。本課題組前期研究結果表明，黑羽番鴨腿肌中膽固醇含量以及肌苷酸含量均低于胸肌 [3] 。而有關畜禽肉中風味物質研究結果表明，膽固醇、肌苷酸和揮發(fā)性風味物質等是形成其肉質風味的主要來源 [15] ?；谇捌谘芯拷Y果，本研究進一步對黑羽番鴨胸肌、腿肌中的揮發(fā)性風味物質進行對比分析，并結合RNA-Seq技術挖掘黑羽番鴨肉質風味的調控基因，為進一步培育優(yōu)質肉用黑羽番鴨以及探究肉質風味調控機制提供參考。

禽肉中醛類、醇類及酮類含量不同可能是造成禽肉風味有差異的原因 [16] 。本試驗對黑羽番鴨胸肌、腿肌中揮發(fā)性風味物質進行分離鑒定，篩選出可能與黑羽番鴨肉質風味相關的7種揮發(fā)性風味物質，其中辛醛、2，3-辛二酮含量在黑羽番鴨胸肌中顯著高于腿肌，3-羥基-2-丁酮含量顯著低于腿?。?P < 0.05），而正戊醇、甲基庚烯酮、壬醛以及正庚醇在胸肌和腿肌中含量無顯著差異。辛醛由油酸氧化而形成，具有堅果香、杏仁香味，對肉香味的貢獻較大，在黑羽番鴨胸肌中含量（1.13 μg/kg ）顯著高于腿?。?.04 μg/kg ）。2，3-辛二酮是脂質氧化的另一重要產物，在含量低時有果香、奶香味，黑羽番鴨胸肌中含量（6.88 μg/kg ）顯著高于腿?。?.25 μg/kg ），說明胸肌中酮類物質含量較高，酮類物質又可結合脂質產生焦糖味 [17] ，從而有益于胸肌肉質的風味提升。3-羥基-2-丁酮是某些風味物質形成過程中的中間產物，具有甜香、奶香和油膩脂肪香味，黑羽番鴨胸肌中含量（1.06 μg/kg ）顯著低于腿?。?2.36 μg/kg ），但是由于其香味閾值高，需要在高含量下才能產生嗅覺反應 [15] ，因此對黑羽番鴨肉質風味的整體貢獻不高。黑羽番鴨胸肌與腿肌揮發(fā)性風味物質對比后，篩選出辛醛、2，3-辛二酮以及3-羥基-2-丁酮這3類含量存在顯著差異的物質，這可能與黑羽番鴨胸肌與腿肌肉質風味區(qū)別相關。

進一步對黑羽番鴨胸肌、腿肌進行轉錄組對比分析，篩選出614個差異基因，其中上調差異表達基因171個，下調差異表達基因443個。結合GO基因功能分析以及KEGG富集分析，篩選出黑羽番鴨胸肌、腿肌轉錄組中與風味物質相關的TOP20顯著性差異基因。TOP20顯著性差異基因參與機體脂肪代謝相關的差異基因占絕大多數(shù)：與胸肌相比，黑羽番鴨腿肌中大多數(shù)基因ACOT11、ACSBG1、APOA1、APOD、ELOVL6、FABP3和 SCD 等均呈現(xiàn)下調表達，少數(shù)基因 CRAT 、LOC101790670和LOC101792317等呈上調表達。酰基輔酶A硫酯酶11（ACOT11）作為?；o酶A硫酯酶（ ACOT ）家族成員之一，是一類催化脂肪?；o酶A水解形成游離脂肪酸和輔酶A的酶，在脂類的合成與分解過程中發(fā)揮著巨大的作用，能減少能量消耗同時保存體內熱量 [18] 。ACOT11基因能促進小鼠體內游離脂肪酸濃度升高 [19] ，將該基因敲除后，小鼠脂肪酸氧化效率增加，脂質沉積減少 [20] ，可以抵抗飲食導致的肥胖以及肝臟脂肪變性 [21] 。脂肪酸結合蛋白3（Fatty acid-binding protein 3，F(xiàn)ABP3）作為脂肪酸結合蛋白家族中的重要成員，可以通過長鏈脂肪酸的攝取、轉運等調節(jié)體內脂肪和葡萄糖代謝過程，從而影響肌內脂肪沉積 [22-23] 。相關研究結果表明，F(xiàn)ABP3的表達水平與30～ 90日齡的哈薩克綿羊肌肉組織中的脂肪含量呈顯著正相關 [24] ，與拜城油雞肌肉組織中的脂肪含量相關 [25] ，與6周齡北京鴨的腹脂率呈顯著負相關關系 [26] ;在前體脂肪細胞中過表達可以有效促進脂肪合成 [27-28] 。

上調表達基因表達的蛋白質中，GPI（Glucose phosphate isomerase， 葡萄糖-6-磷酸異構酶）是一種多功能蛋白酶， 主要參與糖酵解和糖異生這2個生物過程，能夠催化葡萄糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸之間的可逆反應 [29] ，目前研究多集中于醫(yī)學方面，GPI與非球型血紅細胞貧血癥、類風濕關節(jié)炎等疾病密切相關 [30-31] 。PFKFB3（6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2，6-biphosphatase 3，6-磷酸果糖2-激酶/果糖-2，6-二磷酸酶3）參與生物體糖酵解反應，調節(jié)糖代謝通路和能量代謝過程 [32] ，研究證實，PFKFB3與腫瘤、血管鈣化、糖尿病等疾病的發(fā)生相關 [33-36] 。其余上調表達基因如LOC101790670、LOC101792317等，從GO功能注釋中可發(fā)現(xiàn)與脂肪代謝相關。但是，上述這些基因尚未有與肉質風味相關的研究報道。

肉質風味形成的主要原因之一是肌肉組織中含有大量的脂質，其風味的差異與肌內脂肪有著一定的關系。肌內脂肪作為風味物質的主要前體之一，在體內合成與分解的過程中形成大量的揮發(fā)性化合物，如酮類、醇類、酸類等，是揮發(fā)性風味物質的主要來源 [24] 。本試驗發(fā)現(xiàn)黑羽番鴨胸肌中揮發(fā)性風味物質較腿肌中高，且通過轉錄組篩選獲得大量參與機體脂肪代謝相關的差異基因。通過蛋白質網絡互作圖分析發(fā)現(xiàn)，這些差異基因的表達蛋白ACSBG1、APOA1、APOD、ELOVL6、FABP3、SCD和CRAT呈現(xiàn)出清晰的互作效應，這些基因可能共同作用于黑羽番鴨胸肌和腿肌的脂肪沉積過程，從而影響黑羽番鴨肉質風味，其具體的調控機制有待結合黑羽番鴨胸肌和腿肌的脂肪含量及各類脂肪酸比例進行深入研究。

4 結 論

本研究在黑羽番鴨胸肌、腿肌中揮發(fā)性風味物質對比基礎上，結合RNA-Seq技術對黑羽番鴨肉質風味前體物質特異性沉積機制進行了系統(tǒng)、全面的綜合分析，篩選出的ACOT11、APOA1、FABP3等脂肪代謝相關差異基因可能與黑羽番鴨肉質風味形成相關。本研究結果為深入探討黑羽番鴨肉質風味形成機理以及優(yōu)質肉用黑羽番鴨的選育提供了參考依據。

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（責任編輯：張震林）

收稿日期：2021-09-02

基金項目：泰州市科技支撐項目（TN201915）;江蘇省農業(yè)重大新品種創(chuàng)制項目（PZCZ201737）

作者簡介：段修軍（1972-），男，湖南南縣人，碩士，教授，研究方向為動物遺傳育種與繁殖。（E-mail）sgb1981@126.com