盧春霞 劉長彬 萬鵬程 郭延華 陳霞 李紅敏 盧守亮

摘要： 為建立一種簡便、經(jīng)濟(jì)、無創(chuàng)的應(yīng)用于綿羊早期妊娠診斷的快速檢測技術(shù)，以綿羊妊娠相關(guān)糖蛋白7（Ovine pregnancy-associated glycoproteins-7， ovPAG7）核酸適配體為分子識別探針，建立一種間接競爭酶聯(lián)適配體（Indirect competitive enzyme-linked aptamer assay， ic-ELAA）檢測ovPAG7的新方法，并對ovPAG7包被質(zhì)量濃度、包被緩沖液、封閉條件、適配體濃度、鏈霉親和素-辣根過氧化物酶（SA- HRP ）稀釋比例等檢測條件進(jìn)行優(yōu)化，將建立的方法應(yīng)用于人工授精后28 d的中國美利奴羊血清檢測，檢測結(jié)果與妊娠相關(guān)糖蛋白-酶聯(lián)免疫吸附測定（PAG-ELISA）商業(yè)化試劑盒和B超檢測法進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，在ovPAG7包被質(zhì)量濃度為2.0 μg/ml? 、包被緩沖液為50 mmol/L 碳酸鹽緩沖液（pH 9.6）、1.0%牛血清蛋白質(zhì)封閉2 h、適配體濃度為40 nmol/L 、SA- HRP 稀釋比例為1∶ 40 000 ?（體積比）、室溫下競爭反應(yīng)時間為40 min等優(yōu)化條件下，ovPAG7在緩沖液體系和血清體系中質(zhì)量濃度的線性范圍均為0.1～ 50.0 ng/ml ?（ R2 > 0.994） ，半數(shù)抑制質(zhì)量濃度（ IC 50 ）分別為1.40 ng/ml 和2.11 ng/ml ，檢測限分別為0.11 ng/ml 和0.19 ng/ml 。ovPAG7在空白樣品中加標(biāo)回收率為96.4%～ 106.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于6.0%。妊娠診斷結(jié)果顯示，ic-ELAA法的診斷敏感性、特異性和準(zhǔn)確率分別為96.0%、83.3%和91.2%，與B超檢測結(jié)果一致性較高（Kappa值= 0.810）。

關(guān)鍵詞： 妊娠相關(guān)糖蛋白; 適配體; 早期妊娠診斷; 綿羊

中圖分類號： S826.3+5?? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A?? 文章編號： 1000-4440（2022）03-0730-09

Establishment and application of indirect competitive enzyme-linked aptamer assay? for ovPAG7 in sheeps

LU Chun-xia 1， 2 ， LIU Chang-bin 2 ， WAN Peng-cheng 2 ， GUO Yan-hua 2 ， CHEN Xia 3 ， LI Hong-min 3 ， LU Shou-liang 2

（1.School of Advanced Agriculture and Bioengineering， Yangtze Normal University， Chongqing 408100， China; 2.State Key Laboratory of Sheep Genetic Improvement and Healthy Breeding， Xinjiang Academy of Agriculture and Reclamation Science， Shihezi 832000， China; 3.Analysis and Testing Center of Xinjiang Academy of Agriculture and Reclamation Science， Shihezi 832000， China）

Abstract： The aim of the experiment was to establish a rapid and new detection technique that can be applied simply， economically and noninvasively in diagnosis of sheeps in early period of pregnancy. An indirect competitive enzyme-linked aptamer assay （ic-ELAA） was developed using ovine pregnancy-associated glycoproteins-7 （ovPAG7） nucleic acid aptamer as molecular probe for the detection of ovPAG7. Several detecting conditions including mass concentration of coated ovPAG7， coating buffer， blocking conditions， concentration of aptamer and dilution ratio of streptavidin-horseradish peroxidase （SA- HRP ） were optimized. Subsequently， the serum samples from Chinese Merino ewes 28 days after insemination were analyzed by applying the ic-ELAA method proposed. The test results were compared with ultrasound B detection method and PAG-ELISA （pregnancy associated glycoproteins-enzyme linked immunosorbent assay） kit. The results demonstrated that， the optimized conditions were 2.0 μg/ml mass concentration of coated ovPAG7， 50 mmol/L carbonate with pH 9.6 as coating buffer， blocking the wells with 1.0% bovine serum albumin for 2 h， the aptamer concentration was 40 nmol/L， the dilution ratio （in volume） of SA- HRP ?was 1∶ 40 000 ， the competitive reaction time at room temperature was 40 min. Under the optimal conditions， the linear range of mass concentration of ovPAG7 in both buffer system and serum system was 0.1- 50.0 ng/ml （ R2 >0.994）， with median inhibition concentration （ IC 50 ） of 1.40 ng/ml and 2.11 ng/ml ?respectively， and the limit of detection were 0.11 ng/ml and 0.19 ng/ml respectively. The recovery rate of ovPAG7 in blank samples was between 96.4% and 106.8%， and the relative standard deviations were all less than 6.0%. Results of pregnancy diagnosis showed that， the diagnostic sensitivity， specificity and accuracy of ic-ELAA method were 96.0%， 83.3% and 91.2% respectively， which showed high consistency with detection results by ultrasound B method （ Kappa =0.810）.

Key words： pregnancy associated glycoprotein; aptamer; early pregnancy diagnosis; sheep

近些年，中國養(yǎng)羊業(yè)發(fā)展迅速，截至2017年，中國綿羊存欄量1.640 79× 108只，山羊存欄量1.382 38× 108只，羊肉總產(chǎn)量4.711× 106 t [1] ，養(yǎng)殖模式也由傳統(tǒng)的農(nóng)戶分散飼養(yǎng)向規(guī)?；彤a(chǎn)業(yè)化轉(zhuǎn)型。眾所周知，在規(guī)模化養(yǎng)殖中，提高繁殖效率是提高養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。若能在配種后對母羊準(zhǔn)確及時地進(jìn)行早期妊娠診斷，盡早區(qū)分已孕和未孕母羊，及時地對未孕母羊采取復(fù)配措施，不僅有利于減少空胎率和空胎時間、提高母羊的繁殖效率，也有助于進(jìn)行分群飼養(yǎng)管理，降低飼養(yǎng)成本。

目前，B超檢測法是母羊妊娠診斷最常用的方法 [2-3] 。但此法有一定缺陷：（1）一般配種后45～ 60 d才能探測出比較準(zhǔn)確的結(jié)果，無法實現(xiàn)早期妊娠診斷;（2）需要專業(yè)的儀器操作人員，無法在基層推廣應(yīng)用;（3）效率低，孕檢時需要組織3～ 4個勞動力固定羊，耗時費(fèi)力。由于B超妊娠診斷法不易在基層推廣應(yīng)用，造成基層羊場在配種后基本不實施孕檢，致使母羊空懷時間延長，繁殖率降低，增加了非繁殖期飼養(yǎng)管理時間及飼養(yǎng)成本。因此，急需開發(fā)一種與規(guī)?；a(chǎn)業(yè)化養(yǎng)殖技術(shù)相匹配的早孕快速檢測技術(shù)，以滿足母羊早期孕檢需要，促進(jìn)人工輸精、胚胎移植等繁殖技術(shù)的協(xié)同發(fā)展，提高母羊繁殖效率。

妊娠相關(guān)糖蛋白（Pregnancy-associated glycoproteins， PAGs）是偶蹄動物胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞合成和分泌的一類糖蛋白，屬于天冬氨酸蛋白酶家族 [4] 。迄今，研究者們已用RT-PCR技術(shù)從綿羊胎盤組織中篩選出11個綿羊 PAG（ovPAG）cDNA轉(zhuǎn)錄本 [5-7] 。ovPAG在綿羊整個妊娠期的表達(dá)和分泌呈現(xiàn)時空特異性，例如ovPAG1、ovPAG5、ovPAG7、ovPAG10、ovPAG11在妊娠16～ 17 d開始表達(dá)，而ovPAG3、ovPAG6、ovPAG8、ovPAG9則在妊娠中后期表達(dá) [7-8] 。PAG對維持妊娠發(fā)揮了一定作用，綿羊從妊娠后第3周直到產(chǎn)羔時在母體外周血中均可檢測到ovPAG，其濃度在妊娠第60 d達(dá)到第1個高峰，隨后持續(xù)下降，在妊娠90 d再次升高直到分娩 [9] 。所以ovPAG可作為生物標(biāo)志物用于母羊早期妊娠診斷 [10-11] 。但國內(nèi)關(guān)于ovPAG的研究報道較少，也無針對ovPAG的商業(yè)化檢測試劑盒，雖然有使用牛PAG-酶聯(lián)免疫吸附劑測定（ELISA）檢測ovPAG的報道 [10，12-13] ，但檢測結(jié)果存在分歧，且牛PAG-ELISA試劑盒售價過高，限制了其在國內(nèi)大規(guī)模推廣應(yīng)用。

基于此，本研究以前期篩選的ovPAG7核酸適配體作為分子識別探針，代替抗體建立一種間接競爭酶聯(lián)適配體（Indirect competitive enzyme-linked aptamer assay， ic-ELAA）檢測血清中ovPAG7的分析方法，旨在實現(xiàn)綿羊配種后約4周即可進(jìn)行早期妊娠診斷，降低檢測成本，滿足基層牧場養(yǎng)殖生產(chǎn)需要。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

ovPAG7、bPAG9、bPAG4重組蛋白質(zhì)由本團(tuán)隊前期通過真核表達(dá)系統(tǒng)制備 [13-14] 。牛血清白蛋白（Bovine serum albumin， BSA）、TMB（3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺）顯色試劑盒、鏈霉親和素-辣根過氧化物酶（SA- HRP ， 500 U/ml ）、Tween-20、胎牛血清、96-well酶標(biāo)板等購自生工生物工程（上海）股份有限公司，孕酮（P4）購自北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司，NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4、CaCl2、MgCl2·6H2O 等常規(guī)分析純試劑購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（上海），PAG-ELISA試劑盒購自北京愛德士元亨生物科技有限公司。

ovbPAG7適配體由本團(tuán)隊前期篩選獲得 [15] ，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成和純化。生物素化適配體 （bio-apt）序列為5′-T￣T￣G￣A￣A￣G￣T￣G￣A￣C￣A￣T￣C￣A￣T￣C￣A￣T￣T￣C￣A￣G￣C￣G￣T￣A￣G￣G￣G￣T￣T￣T￣G￣G￣C￣A￣C￣T￣G￣G￣G￣C￣C￣T￣G￣G￣C￣A￣T￣A￣G￣C￣AGGT-biotin-3′。

1.2 儀器與設(shè)備

Thermo Scientific TM ?Varioskan Flash全波長掃描式多功能讀數(shù)儀（美國賽默飛世爾科技公司），Tringa Linear Vet便攜式獸用B超儀（意大利百勝集團(tuán)荷蘭公司 ），5MX 96孔板混勻儀（美國賽洛捷克公司），SK-1快速混勻器（江蘇正基儀器有限公司），424R臺式冷凍離心機(jī)（德國艾本德股份公司），Milli-Q Reference超純水系統(tǒng)。

1.3 方法

1.3.1 間接競爭酶聯(lián)適配體檢測 ovPAG7 間接競爭酶聯(lián)適配體檢測ovPAG7的原理如圖1所示，包被于酶標(biāo)板上的固相ovPAG7與樣品中ovPAG7競爭結(jié)合生物素化適配體，通過生物素-鏈霉親和素作用，與加入的SA- HRP 特異性結(jié)合。 HRP 催化TMB顯色，樣品中ovPAG7濃度與反應(yīng)溶液顏色深度、吸光度成反比，通過顯色反應(yīng)和測定450 nm處的吸光度實現(xiàn)對靶標(biāo)的定性或定量檢測。

具體操作參考本團(tuán)隊前期研究結(jié)果 [16] 和相關(guān)文獻(xiàn)中的方法 [17] 并稍作修改：將ovPAG7用合適的包被液稀釋至一定濃度，每孔加入200 μl ovPAG7溶液，4 ℃包被過夜，用200 μl PBST緩沖液（10 mmol/L ?PBS， pH 7.4， 0.05% Tween-20）洗滌3～ 5次，拍干。加入200 μl一定濃度的BSA封閉液，室溫封閉若干小時，用PBST洗滌、拍干。加入100 μl ovPAG7或待測樣品以及100 μl 生物素化適配體，室溫孵育，用PBST洗滌、拍干。加入200 μl SA- HRP 溶液，室溫孵育10 min，用PBST洗滌、拍干。加入100 μl TMB底物顯色液，反應(yīng)10 min。加入100 μl 終止液終止反應(yīng)，采用全波長掃描式多功能讀數(shù)儀測定 450 nm 處的吸光度。

1.3.2 檢測條件優(yōu)化 采用方陣滴定法確定ovPAG7包被濃度（0.5～ 8.0 μg/ml? ）和生物素適配體濃度（5～60 nmol/L ）。采用單因素試驗優(yōu)化包被溶液[10 mmol/L ?PBS， pH 7.4;50 mmol/L 碳酸鹽緩沖液（CB），pH 9.6;10 mmol/L ?Tris-HCl， pH 8.0]、BSA封閉液含量（0.1%～ 2.0%）和封閉時間（1～ 8 h）、SA- HRP 稀釋比例（1∶ 10 000～ 1∶ 100 000 ， ?v/v ）、競爭結(jié)合時間（10～ 120 min）。反應(yīng)體系選用ovPAG7適配體篩選緩沖液（BB）： 8 g NaCl， 0.2 g KCl， 1.15 g Na2 HPO4 ， 0.2 g KH2 PO4 ， 0.1 g CaCl2 ， 0.1 g MgCl2 ·6H2 O ， pH 7.4。每個試驗重復(fù)3次。除包被溫度條件為-4 ℃ 外，其余試驗均在室溫下操作。

1.3.3 檢測性能評價 競爭抑制曲線：在優(yōu)化條件下，分別用BB緩沖液和陰性血清將ovPAG7稀釋成0 ng/ml 、0.01 ng/ml 、0.05 ng/ml 、0.10 ng/ml 、0.50 ng/ml 、1.00 ng/ml 、5.00 ng/ml 、10.00 ng/ml 、50.00 ng/ml 、100.00 ng/ml 、500.00 ng/ml 、1 000.00 ?ng/ml 的工作標(biāo)準(zhǔn)溶液，同時設(shè)置空白對照，采用方法1.3.1進(jìn)行檢測，每個試驗重復(fù)5次。以ovPAG7各質(zhì)量濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，各質(zhì)量濃度對應(yīng)的 Ai? （各質(zhì)量濃度ovPAG7對應(yīng)的450 nm下的吸光度）/ A0?; （ovPAG7質(zhì)量濃度為0時450 nm處的吸光度）為縱坐標(biāo)，繪制競爭抑制曲線，求線性方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍，根據(jù)公式（1）計算抑制率和半數(shù)抑制質(zhì)量濃度（ IC 50 ，即 Ai? ?/ A 0 =50%時所對應(yīng)的ovPAG7質(zhì)量濃度）。

AiA0=a+b lg ρ ovPAG7 （1）

其中， ?Ai? 為不同質(zhì)量濃度ovPAG7對應(yīng)的450 nm處的吸光度， A0? 為ovPAG7質(zhì)量濃度為0時測定的450 nm處的吸光度， b 為斜率 ，a 為截距， ρ ovPAG7 為ovPAG7的質(zhì)量濃度。

檢測限：參考國家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 33411-2016）中的方法 [18] ，取10份空白樣品（無ovPAG7的BB緩沖液和陰性血清體系），按照方法1.3.1步驟進(jìn)行測定，求出吸光度的平均值（ x 0）和標(biāo)準(zhǔn)偏差（ s ），計算 x 0-2s（競爭抑制法），以此數(shù)值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上算出對應(yīng)的ovPAG7質(zhì)量濃度，即為檢測限（Limit of detection， LOD）。

特異性：參照方法1.3.1分別測定ovPAG7、bPAG9、bPAG4、BSA、孕酮（P4）的抑制曲線，計算 IC 50 和交叉反應(yīng)率（ CR ）， CR = IC 50 （ovPAG7）/ IC 50 （各抑制物）×100% [19] ，以評估該方法的特異性。

加標(biāo)回收率：采用空白加標(biāo)回收試驗考察ic-ELAA的準(zhǔn)確性與精密度。取陰性血清，在線性范圍內(nèi)分別添加低、中、高3種質(zhì)量濃度水平的ovPAG7，使ovPAG7終質(zhì)量濃度分別為1 ng/ml 、5 ng/ml 、20 ng/ml 。按照方法1.3.1檢測，通過標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線計算樣品中ovPAG7濃度，并計算加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（ RSD ）。每個添加水平設(shè)5個重復(fù)。

1.3.4 ic-ELAA在綿羊早孕診斷中的應(yīng)用 樣品采集及檢測：選擇人工授精（Artificial insemination， AI）后28 d的中國美利奴母羊80只，頸靜脈無菌采集血液3～ 5 ml，室溫下放置約1～ 2 h，血清自動析出后收集血清。以ovPAG7（5 ng/ml ）溶液為陽性對照，用BB緩沖液作為空白對照，以胎羊血清作為陰性對照，采用方法1.3.1的步驟進(jìn)行檢測。血清樣品同時采用牛PAG-ELISA商業(yè)化試劑盒進(jìn)行檢測。

超聲波檢測：在AI后 60 d以超聲波檢測作為金標(biāo)方法確診羊的懷孕狀態(tài)。

結(jié)果判斷：檢測結(jié)果采用臨界值（Cut-off， CO）判定為陽性或陰性。有研究者發(fā)現(xiàn) [20-21] ，未孕母羊的PAG質(zhì)量濃度常小于1 ng/ml ，所以PAG的臨界值常定為1 ng/ml ， cut-off ?≥1 ng/ml 為陽性， cut-off ?< 1 ng/ml 為陰性。檢測結(jié)果若與超聲波檢測結(jié)果不一致，則以超聲波檢測結(jié)果為準(zhǔn)。最后統(tǒng)計陽性、假陽性、陰性和假陰性結(jié)果，根據(jù)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（SN/T 2435-2010《出入境動物檢疫診斷試劑盒質(zhì)量評價規(guī)程》）評價診斷敏感性、診斷特異性 [22] 。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差方式表示，采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）方法分析試驗數(shù)據(jù)，顯著性水準(zhǔn)為 α = 0.05。用 Kappa值分析本方法及PAG-ELISA試劑盒與B超檢測結(jié)果的一致性。Kappa值為0.4～ 0.5，表明一致性一般;Kappa值為0.5～ 0.6，表明一致性較好;Kappa值大于0.6，表明一致性很高;Kappa值為1，表示完全一致 [23] 。

2 結(jié)果與分析

2.1 間接競爭酶聯(lián)適配體檢測條件的優(yōu)化

2.1.1 包被條件優(yōu)化 采用方陣滴定法確定最佳ovPAG7包被質(zhì)量濃度及適配體工作濃度，在包被緩沖液為50 mmol/L ?CB（pH 9.6）、用1% BSA封閉4 h、SA- HRP 稀釋比例為1∶ 20 000 ?（體積比）、ovPAG7與適配體反應(yīng)時間為60 min等試驗條件下測定 OD 450 ，以 OD 450 為1.0左右時對應(yīng)的ovPAG7包被質(zhì)量濃度和適配體濃度為最佳工作條件 [24] 。結(jié)果如圖2A所示，當(dāng)ovPAG7質(zhì)量濃度為2.0 μg/ml? 、適配體濃度為40 nmol/L 時，吸光度接近1.0。為獲得較高的抑制率和靈敏度，選擇ovPAG7包被質(zhì)量濃度為2.0 μg/ml ，適配體濃度為40 nmol/L 。

在固定試驗條件下（ovPAG7包被質(zhì)量濃度為2.0 μg/ml ，適配體濃度為40 nmol/L 、1% BSA封閉4 h、SA- HRP 稀釋體積比為1∶ 20 000 、室溫結(jié)合時間為60 min），考察不同包被溶液對ovPAG7的包被效果，選擇吸光度較大的包被緩沖液。結(jié)果如圖2B所示，CB包被緩沖液試驗組吸光度顯著高于Tris-HCl和PBS試驗組（ P < 0.05），故選擇50 mmol/L ?CB作為包被緩沖液。

2.1.2 封閉條件優(yōu)化 以最佳包被條件包被ovPAG7，采用BSA封閉后直接加入SA- HRP （1∶ 20 000 ，體積比），觀察BSA封閉液含量和封閉時間對SA- HRP 非特異性吸附的影響。吸光度越小，表明SA- HRP 非特異性吸附越少，封閉效果越好。結(jié)果（圖3）顯示，當(dāng)BSA封閉液含量低于0.5%時，封閉不完全，隨著BSA液含量的增加，吸光度逐漸下降，說明SA- HRP 非特異性吸附效果降低。另外，非特異性吸附效果隨著封閉時間的延長而降低，當(dāng)封閉時間超過2 h后，吸光度無明顯變化。綜合以上分析，選擇1.0% BSA封閉2 h。

2.1.3 SA- HRP 稀釋比例 固定以上優(yōu)化的試驗條件，將SA- HPR 用BB緩沖液以1∶ 10 000 、1∶ 20 000 、1∶ 40 000 、1∶ 60 000 、1∶ 80 000 和1∶ 100 000 體積比稀釋，測定 OD 450 。結(jié)果如圖4所示，SA-HRP稀釋比例為1∶ 10 000～ 1∶ 40 000 時，吸光度變化不顯著（ P >0.05），隨著稀釋比例的進(jìn)一步增大，吸光度顯著降低（ P < 0.05）。故后續(xù)試驗選擇SA- HRP 稀釋比例為1∶ 40 000 。

2.1.4 競爭反應(yīng)時間 固定以上試驗條件，采用ic-ELAA測定固相-ovPAG7和樣品中ovPAG7（50 ng/ml ）與適配體競爭反應(yīng)時間對抑制率的影響。結(jié)果（圖5）顯示，抑制率隨著競爭結(jié)合時間的延長而增大，超過40 min后抑制率無明顯變化（ P > 0.05）。故選擇競爭結(jié)合時間為40 min。

綜上所述，ic-ELAA的最佳工作條件為：ovOAG7包被質(zhì)量濃度2.0 μg/ml ，適配體濃度為40 nmol/L ，包被緩沖液為50 mmol/L ?CB緩沖液（pH 9.6），1.0% BSA封閉2 h，SA- HRP 稀釋比例為1∶ 40 000 （體積比），競爭反應(yīng)時間為40 min 。

2.2 ELAA方法學(xué)評估

2.2.1 競爭抑制曲線 在優(yōu)化條件下，將系列濃度的ovPAG7分別在BB緩沖液和陰性血清樣品體系中進(jìn)行競爭反應(yīng)。圖6為ovPAG7在2種反應(yīng)體系中的競爭抑制曲線，通過回歸方程計算可知，在緩沖體系和血清體系中，ovPAG7在0.1～ 50.0 ng/ml? 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好線性（ R2 > 0.994）， IC 50 分別為1.40 ng/ml 和2.11 ng/ml ，檢測限分別為0.11 ng/ml 和0.19 ng/ml 。結(jié)果表明，本方法檢測限低、線性范圍寬。血清基質(zhì)中的 IC 50 和檢測限稍高于緩沖液體系，原因可能是血清基質(zhì)對ic-ELAA檢測有一定影響。

2.2.2 ic-ELAA的特異性 為評估ic-ELAA的特異性，選擇血清中的相關(guān)激素、蛋白質(zhì)及結(jié)構(gòu)類似物為抑制物，采用方法1.3.1中的步驟測定各抑制物的抑制曲線，計算 IC 50 和交叉反應(yīng)率。結(jié)果見圖7，可見適配體與BSA和P4基本無交叉反應(yīng)，與牛妊娠相關(guān)糖蛋白（bPAG9和bPAG4）具有一定交叉反應(yīng)，交叉反應(yīng)率分別為22.0%和19.4%，這可能與牛羊PAG氨基酸序列同源性較高、蛋白質(zhì)含有一些相似的抗原表位有關(guān) [4] 。

2.2.3 ic-ELAA的加標(biāo)回收率 采用建立的ic-ELAA對陰性血清進(jìn)行添加回收試驗，進(jìn)一步評價該方法的準(zhǔn)確性和精密度。如表1所示，ovPAG7添加回收率為96.4%～ 106.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（ RSD ）為4.02%～ 5.28%，說明本方法具有高的準(zhǔn)確性和精密度。

2.3 ic-ELAA的在綿羊早孕檢測中的應(yīng)用

為驗證ic-ELAA的實際應(yīng)用效果，采集80份母羊血清，按照方法1.3.1進(jìn)行檢測后按照方法1.3.4進(jìn)行結(jié)果判定，并與B超檢測結(jié)果比較，結(jié)果如表2和圖8所示。從表2中可以看出，本方法共檢測出53只妊娠綿羊（陽性），27只空懷綿羊（陰性），出現(xiàn)5個假陽性，2個假陰性，診斷敏感性為96.0%，診斷特異性為83.3%，診斷準(zhǔn)確率為91.2%，與商品化試劑盒的診斷準(zhǔn)確率結(jié)果相比差異不顯著（ P > 0.05）。實際應(yīng)用結(jié)果表明，本方法與B超診斷結(jié)果符合率較高，Kappa值為0.810，大于0.6，表明具有較高的一致性。

3 討 論

在ic-ELAA分析方法的建立中，優(yōu)化反應(yīng)條件對提高其檢測性能至關(guān)重要。如果ovPAG7包被濃度過小，可能會導(dǎo)致高非特異性吸附;如果包被濃度過大，則導(dǎo)致蛋白質(zhì)與基板材料的結(jié)合較弱，在洗板過程中易被洗掉，濃度過高還有可能影響檢測靈敏度 [17，24] 。另外，酶標(biāo)板上多余位點的封閉也較為關(guān)鍵，若封閉不完全，SA- HRP 和生物素化的適配體均會與聚苯乙烯板發(fā)生非特異性結(jié)合，造成較高的背景值，降低檢測靈敏度 [25] 。除此以外，選擇合適的包被緩沖液可提高包被原的包被效果 [16-17，24] ，一般來說，緩沖液pH大于包被蛋白質(zhì)的等位點（pI），以保持其活性。在ic-ELAA分析中，SA-HRP是ic-ELAA顯色反應(yīng)的關(guān)鍵因素，如果SA- HRP 濃度過低，顯色反應(yīng)不充分;SA- HRP 濃度過高易引起非特異性吸附。因此，本試驗對多種檢測條件進(jìn)行優(yōu)化，在優(yōu)化條件下，建立的ic-ELAA獲得了低的檢測限和高的準(zhǔn)確性。

目前，ovPAG測定方法包括放射免疫分析法（ Radioimmunoassay， RIA）和酶聯(lián)免疫吸附測定法（Enzyme linked immunosorbent assay， ELISA） [10-11，26-29] 。在早期，人們大都采用異源RIA測定母羊血液中ovPAGs濃度 [11，20，30] 。如Karen等 [20] 采用異源RIA檢測母羊配種后22 d外周血中ovPAG濃度，妊娠診斷敏感性和特異性分別達(dá)到93.5%和100.0%。但ovPAG濃度與品種、妊娠天數(shù)、胎次、樣品來源等有一定關(guān)系 [9，11，30] ，因此診斷準(zhǔn)確性受多種因素影響。Barbato等 [30] 采用異源RIA檢測母羊配種后18 d、24 d、26 d、28 d、30 d和50 d的血液樣品，發(fā)現(xiàn)懷雙胎的妊娠母羊PAG水平高于懷單胎的妊娠母羊，個體差異較大。除了血液樣品，RIA也用于乳樣檢測，但是乳樣的妊娠確診天數(shù)（28 d）多于血漿樣品（20 d）;另外，與血漿樣品不同，乳樣中PAG濃度與多胎或單胎無明確相關(guān)性 [11] 。

RIA雖然具有較高的診斷靈敏度和特異性，但由于受到輻射因素的限制，RIA沒有得到大規(guī)模推廣應(yīng)用。鑒于PAG蛋白含有一些相似的抗原表位，可用于跨種免疫檢測 [31] ?。人們嘗試使用牛PAG-ELISA試劑盒檢測ovPAG，以對綿羊進(jìn)行早期妊娠診斷 [12-13] 。如Rovanil等 ?[32] 使用商業(yè)化牛PAG-ELISA試劑盒（IDEXX）檢測綿羊血清中PAG，與超聲波檢測法相比較，PAG-ELISA診斷敏感性和特異性分別為93.5%和98.9%，不同于RIA方法，該試劑盒則需在妊娠33 d后才能獲得高的診斷準(zhǔn)確率（96.1%），結(jié)果的差異可能與兩種檢測方法所測PAG不同亞型有關(guān)。Chaves等 [12] 同樣采用PAG-ELISA商業(yè)化試劑盒（IDEXX）檢測妊娠和空懷綿羊血清，獲得高敏感性（100%）、高特異性（93.75%～ 97.56%）和高準(zhǔn)確率（98.46%）。但Shahin等 [10] 卻獲得不一致的研究結(jié)果，他們分別采用山羊PAG-ELISA、綿羊PAG-ELISA和牛PA-ELISA檢測妊娠山羊血清中PAG，結(jié)果顯示，山羊和綿羊PAG-ELISA的檢測結(jié)果相似，而牛PAG-ELISA的檢測敏感性卻顯著降低。

本研究用建立的ic-ELAA方法檢測配種后28 d的綿羊血清，獲得的檢測結(jié)果與PAG-ELISA方法基本一致。本方法的妊娠診斷結(jié)果出現(xiàn)假陰性現(xiàn)象，可能與個體差異有關(guān)。有人研究發(fā)現(xiàn)，在母羊妊娠早期，PAG平均質(zhì)量濃度為（4.3± 1.4） ng/ml ，個別妊娠母羊的PAG質(zhì)量濃度低于臨界值（1 ng/ml ），導(dǎo)致了假陰性結(jié)果 [20] 。也可能由于部分樣品發(fā)生了溶血，釋放的血紅蛋白具有過氧化物酶活性，導(dǎo)致非特異性顯色，造成假陰性現(xiàn)象 [33] 。診斷結(jié)果中出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象，推測與適配體特異性有關(guān)，由于血清基質(zhì)較為復(fù)雜，適配體可能結(jié)合了血清中某種類似靶標(biāo)的未知物，產(chǎn)生了抑制效應(yīng)，造成假陽性結(jié)果。在本研究中，PAG-ELISA診斷特異性和準(zhǔn)確率低于部分研究結(jié)果 [12-13] ，也可能與部分樣品溶血有關(guān)，導(dǎo)致了假陽性現(xiàn)象，具體原因有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究以ovPAG7適配體為識別分子，代替抗體建立了一種間接競爭ELAA分析方法，在優(yōu)化條件下，該方法具有低的檢測限（0.11 ng/ml ）、高的準(zhǔn)確性（加標(biāo)回收率96.4%～ 106.8%）和精密度（ RSD < 6.0%）。將建立的ovPAG7-ELAA檢測方法應(yīng)用于血清學(xué)檢測，綿羊妊娠診斷準(zhǔn)確率達(dá)到91.2%，與PAG-ELISA試劑盒和超聲波檢測技術(shù)比較，具有簡便、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點，為綿羊早期妊娠診斷提供了一種無創(chuàng)快速檢測新技術(shù)，具有一定應(yīng)用前景。

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（責(zé)任編輯：張震林）

收稿日期：2021-07-25

基金項目：新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)科技創(chuàng)新人才計劃項目（2020CB022）;重慶市自然科學(xué)基金面上項目（cstc2020jcyj-msxmX0080）;國家重點實驗室優(yōu)秀中青年人才培養(yǎng)引導(dǎo)計劃專項（SKLSGIH2017A02）

作者簡介：盧春霞（1978-），女，河南商丘人，博士，教授，主要從事快速檢測技術(shù)研究。（E-mail）shzlcx2002@163.com

通訊作者：劉長彬，（E-mail）xlchangbin@163.com