涂濤，羅會(huì)穎，姚斌

（動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193）

蛋白質(zhì)工程是指以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其生物功能的關(guān)系作為基礎(chǔ)，采用理性設(shè)計(jì)、定向進(jìn)化等技術(shù)手段，按照人們意志改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能或創(chuàng)造全新蛋白質(zhì)的過(guò)程［1］。作為合成生物學(xué)中的一門核心基礎(chǔ)學(xué)科，蛋白質(zhì)工程對(duì)于催化元件功能的靶向定制做出了重要貢獻(xiàn)，在食品、輕工、醫(yī)藥、飼料等眾多行業(yè)中廣泛應(yīng)用［2］。飼料用酶制劑作為飼料添加劑領(lǐng)域最為熱門的研究熱點(diǎn)之一，以其無(wú)殘留、無(wú)污染、無(wú)抗藥性等強(qiáng)勢(shì)優(yōu)勢(shì)被廣泛推廣和應(yīng)用，極大促進(jìn)了飼料行業(yè)的健康發(fā)展。在飼料中添加飼料用酶制劑，不僅可以補(bǔ)充內(nèi)源消化酶的不足、降解飼料中抗?fàn)I養(yǎng)因子，提高日糧營(yíng)養(yǎng)的消化利用，而且還能調(diào)節(jié)腸道結(jié)構(gòu)和功能，促進(jìn)畜禽腸道健康，其應(yīng)用效果已在世界范圍內(nèi)得到公認(rèn)［3］。目前，《飼料添加劑品種目錄》中包含飼料用酶制劑14種，分別為淀粉酶、α-半乳糖苷酶、纖維素酶、β-葡聚糖酶、葡萄糖氧化酶、脂肪酶、麥芽糖酶、β-甘露聚糖酶、β-半乳糖苷酶、果膠酶、植酸酶、蛋白酶、角蛋白酶、木聚糖酶。與其他酶制劑不同，這些飼料用酶在性能方面有著特殊的應(yīng)用要求。第一，限于飼料加工制粒過(guò)程中瞬時(shí)高溫的工藝要求，飼料用酶必須具有良好的熱穩(wěn)定性；而飼料用酶需要在畜禽體內(nèi)發(fā)揮功能，因此又必須在生理溫度下具有高活性。第二，作為飼料添加劑，飼料用酶需要在畜禽動(dòng)物完整消化道中游離，因此飼料用酶必須在酸性到中性pH 范圍內(nèi)具有高活性。第三，在胃液到腸道環(huán)境中存在胃蛋白酶、胰蛋白酶等消化酶，因此飼料用酶必須具有良好的內(nèi)源性蛋白酶抗性。絕大多數(shù)飼料用酶的綜合性能都不能完全滿足上述三方面的要求，嚴(yán)重影響了飼喂效果，從而限制了其應(yīng)用和發(fā)展。

隨著蛋白質(zhì)工程技術(shù)的跨越式發(fā)展，基因挖掘、結(jié)構(gòu)解析、分子設(shè)計(jì)等系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)為飼料用酶制劑的研發(fā)提供了廣闊的知識(shí)與技術(shù)支持［4］。利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)，基于結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)來(lái)改造和設(shè)計(jì)飼料用酶的酶學(xué)性能，從而滿足飼料工業(yè)的應(yīng)用需求。本文聚焦飼料用酶的熱穩(wěn)定性、pH 依賴性、蛋白酶抗性和催化活性等4 個(gè)方面，綜述了計(jì)算機(jī)輔助的蛋白質(zhì)理性設(shè)計(jì)技術(shù)在飼料用酶制劑研發(fā)中的應(yīng)用研究進(jìn)展，并展望了未來(lái)飼料用酶制劑分子改良的重點(diǎn)方向。

1 熱穩(wěn)定性

飼料制粒加工條件通常為75～85 ℃處理1 min左右，長(zhǎng)時(shí)間的高溫處理一方面會(huì)導(dǎo)致淀粉糊化、原料結(jié)構(gòu)改變，另一方面也會(huì)使熱敏性飼料添加劑失活［5］。因此，飼料用酶在80 ℃條件下短時(shí)間處理后的剩余酶活成為評(píng)價(jià)飼料用酶在熱穩(wěn)定性方面是否具有應(yīng)用潛力的核心指標(biāo)［6］。隨著結(jié)構(gòu)生物學(xué)和生物信息學(xué)的迅速發(fā)展，基于結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的酶熱穩(wěn)定性理性設(shè)計(jì)準(zhǔn)確率也得到了顯著提升。表1列舉了近幾年中在酶熱穩(wěn)定性理性設(shè)計(jì)方面表現(xiàn)突出的軟件。這些策略從不同角度優(yōu)化了飼料用酶的結(jié)構(gòu)構(gòu)象，如氫鍵、鹽鍵、二硫鍵、疏水核心等，從而實(shí)現(xiàn)局部作用網(wǎng)絡(luò)乃至整體結(jié)構(gòu)的剛性增強(qiáng)，導(dǎo)致飼料用酶的熱穩(wěn)定性提高。例如，Dotsenko 等［21］利 用PremPS 和mCSM 的 計(jì) 算方法對(duì)Penicillium canescens木聚糖酶E 的自由能進(jìn)行優(yōu)化并指導(dǎo)設(shè)計(jì)了6個(gè)熱穩(wěn)定性突變體，經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證確認(rèn)獲得4個(gè)正突變體（A45V、S104M、E177P和A341P），它們的Tm值較野生型提高了1.1～3.1 ℃，在70 ℃下的半衰期較野生型提高了1.3～1.7 倍。Navone 等［22］通過(guò)在大腸桿菌植酸酶AppA中引入二硫鍵（L28C/W360C）后，在不影響酶活的前提下（野生型和突變體的比活分別為1150 U/mg±138 U/mg 和1273 U/mg±238 U/mg）使得其在85 ℃條件下處理20 min 后的剩余酶活由野生型的2%提高到47%。以上述研究結(jié)果為代表，一方面說(shuō)明了以結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)為指導(dǎo)的飼料用酶熱穩(wěn)定性設(shè)計(jì)準(zhǔn)確率可觀，但另一方面也提示表征飼料用酶熱穩(wěn)定性的參數(shù)很多，不同的研究者選用了不同的參數(shù)進(jìn)行熱穩(wěn)定性研究，因此，有必要對(duì)熱穩(wěn)定性參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)一和細(xì)分。

事實(shí)上，酶熱穩(wěn)定性可以拆分為熱力學(xué)穩(wěn)定性和動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性兩大類［23］。熱力學(xué)穩(wěn)定性與酶蛋白折疊和解折疊構(gòu)象間的平衡相關(guān)［24］，不同的熱力學(xué)參數(shù)，如解折疊自由能（unfolding free energy，?Gu）、解折疊平衡常數(shù)（unfolding equilibrium constant，Ku）、解鏈溫度（melting temperature，Tm）、變性濃度（denaturing concentration，Cm）等都可以用來(lái)表征酶的熱力學(xué)穩(wěn)定性。而動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性與酶蛋白不可逆失活的速率有關(guān)，表征參數(shù)如最適溫度（temperature of maximum enzymatic activity，Tmax）、半失活溫度（temperature at which 50% of the maximal activity of an enzyme is retained，T50）、半衰期（half-life，t1/2）、表觀失活速率常數(shù)（apparent inactivation rate constant，kobs）等［25］。盡管酶蛋 白的解折疊和失活存在一定關(guān)聯(lián)度，但它們是兩個(gè)完全不同的過(guò)程。從應(yīng)用角度來(lái)講，理想中的飼料用酶需要保持足夠長(zhǎng)時(shí)間的活性狀態(tài)（即動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性），而不完全是在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持折疊狀態(tài)（即熱力學(xué)穩(wěn)定性）［26］。而從計(jì)算設(shè)計(jì)角度來(lái)看，通過(guò)表1中列舉的不同策略優(yōu)化飼料用酶的剛性結(jié)構(gòu)，能夠直接改善的是飼料用酶熱力學(xué)穩(wěn)定性［27-29］（圖1）。這些飼料用酶的熱力學(xué)穩(wěn)定性提高后會(huì)導(dǎo)致其動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性有不同程度的提高，二者的關(guān)聯(lián)機(jī)制還有待進(jìn)一步的深入研究。Tu 等［30］以嗜熱多聚半乳糖醛酸酶為研究材料，針對(duì)表面極性氨基酸進(jìn)行丙氨酸掃描實(shí)驗(yàn)，獲得了一個(gè)顯著影響酶動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性的突變體T284A。突變體T284A的Tm值與野生型相當(dāng)（僅低1.4 ℃），但是在60 ℃下的t1/2由野生型的1242.7 min 減少到41.6 min，晶體結(jié)構(gòu)分析表明殘基Thr284 的羥基通過(guò)與Gln255的Cα原子間形成一個(gè)碳氧氫鍵來(lái)穩(wěn)定殘基Gln255的側(cè)鏈構(gòu)象，從而促進(jìn)酶動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性提升。這一研究理論有效指導(dǎo)了該酶的熱穩(wěn)定性進(jìn)一步提升，在80 ℃下的半衰期提高了15倍［31］，達(dá)到了飼料用酶在熱穩(wěn)定性方面的應(yīng)用要求。

圖1 計(jì)算機(jī)輔助的飼料用酶熱穩(wěn)定性分子設(shè)計(jì)Fig.1 Computer-aided molecular design for thermo-tolerant feeding enzymes

表1 用于酶熱穩(wěn)定性設(shè)計(jì)的軟件總結(jié)Tab.1 Summary for the software used for designing thermo-toler enzymes

除了計(jì)算策略本身的設(shè)計(jì)思路，合成生物學(xué)中定量化、標(biāo)準(zhǔn)化和模塊化的指導(dǎo)策略也在飼料用酶熱穩(wěn)定性分子改良中得到應(yīng)用。Liu 等［32］以兩個(gè)耐熱性差異顯著的β-甘露聚糖酶（最適溫度分別為90 ℃和70 ℃，序列一致性為73%）為核心研究材料，確定了N末端和C末端兩個(gè)模塊為β-甘露聚糖酶熱穩(wěn)定性的重要影響區(qū)域。進(jìn)一步針對(duì)N末端和C末端進(jìn)行局部劃分，分別找到兩個(gè)關(guān)鍵的氨基酸位點(diǎn)：將N 末端中的His112 和Phe113 位點(diǎn)分別突變?yōu)門yr 后，Tm值提高了7.6 ℃，75 ℃下的半衰期提高了7.5 倍；將C 末端中的Leu375 和Ala408 位點(diǎn)分別突變?yōu)镠is 和Pro 后，Tm值提高了5.6 ℃，75 ℃下的半衰期提高了1.5倍。將上述4個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行組合突變后，得到的四點(diǎn)突變體Tm值和75 ℃下的半衰期分別較野生型提高了13.8 ℃和89倍。類似的，Zheng等［33］基于糖苷水解酶第5家族纖維素酶的βα 八筒狀結(jié)構(gòu)進(jìn)行拆分，將每個(gè)βα基序作為一個(gè)模塊對(duì)兩個(gè)熱穩(wěn)定性差異明顯的纖維素酶（最適溫度分別為90 ℃和60 ℃，序列一致性為51%）進(jìn)行雜合組裝，發(fā)現(xiàn)β1α1、β2α2 和β3α3三組基序?qū)w維素酶的熱穩(wěn)定性起重要作用。與野生型相比，雜合酶的最適溫度提高了20 ℃，Tm值提高了22.9 ℃，55 ℃下的半衰期提高了650倍。

針對(duì)飼料用酶這樣的生物大分子，想要通過(guò)簡(jiǎn)單地突變一個(gè)或兩個(gè)氨基酸來(lái)獲得耐熱性能滿足飼料工業(yè)應(yīng)用需求的突變體是不太現(xiàn)實(shí)的，合成生物學(xué)中全局調(diào)控的思路給飼料用酶的熱穩(wěn)定性分子改良指明了方向。Bu 等［34］采用FRESCO（framework for rapid enzyme stabilization by computational libraries）策略對(duì)木聚糖酶的熱穩(wěn)定性進(jìn)行了理性設(shè)計(jì)?；贔oldX、Rosetta_ddg 和ABACUS 3 種算法從酶蛋白全局的角度對(duì)Neocallimastix patriciarum木聚糖酶進(jìn)行能量計(jì)算，選取所有能量值降低的突變體組成虛擬突變體庫(kù)（庫(kù)容量為293）。然后，借助分子動(dòng)力學(xué)模擬的技術(shù)手段對(duì)虛擬突變庫(kù)中的突變體進(jìn)行監(jiān)測(cè)和評(píng)估，發(fā)現(xiàn)其中的188個(gè)突變體對(duì)木聚糖酶的穩(wěn)定性會(huì)造成不利的影響。因此，選擇其余的105個(gè)突變體進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證，獲得了10 個(gè)熱力學(xué)穩(wěn)定性顯著提高（?Tm>1 ℃）的單點(diǎn)突變體，進(jìn)一步組合突變后獲得了一個(gè)四點(diǎn)突變體XynCDBFV-m，其Tm值和最適溫度分別較野生型提高了14 ℃和10 ℃，提高幅度非常明顯。葡萄糖氧化酶作為一種重要的抗生素替代用酶，可通過(guò)非藥物性機(jī)制和途徑殺菌抑菌，改善腸道微生態(tài)，是飼料用酶制劑中的明星酶種［35-36］。然而，自然環(huán)境中篩選得到的葡萄糖氧化酶均屬于中溫酶，不能滿足飼料用酶的耐熱性能要求［37］。因此，在沒(méi)有嗜熱酶作為參考模板的前提下，Tu 等［38-39］基于合成生物學(xué)中工程學(xué)的設(shè)計(jì)理念，綜合了隨機(jī)突變、酰胺基優(yōu)化、疏水核心優(yōu)化、蛋白表面電荷優(yōu)化、N-糖基化修飾、輔基穩(wěn)定、能量計(jì)算等多種策略對(duì)葡萄糖氧化酶的熱穩(wěn)定性進(jìn)行定向進(jìn)化研究，經(jīng)過(guò)多角度的設(shè)計(jì)與改造，使得葡萄多糖氧化酶的80 ℃條件下處理2 min 后的剩余酶活由野生型的完全喪失提高到80%，解決了該酶耐熱性能差無(wú)法滿足飼料工業(yè)應(yīng)用的行業(yè)性瓶頸問(wèn)題，目前該嗜熱突變體已實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

2 pH依賴性

飼料用酶需要在動(dòng)物胃腸道內(nèi)發(fā)揮作用。以家禽動(dòng)物為例，雞嗉囊、腺胃和肌胃的pH 環(huán)境分別為4.5～5.5、3.7～3.9和2.0～2.2，而飼料在整個(gè)消化道食糜排空的時(shí)間為32 h［40］。因此，飼料用酶的最適作用pH 應(yīng)該為酸性且在酸性胃液環(huán)境至腸道中性環(huán)境的范圍內(nèi)（pH 1.5～8.0）具有高活性。因此，最適pH 值和酸穩(wěn)定性是衡量飼料用酶在pH 依賴性方面是否具有應(yīng)用前景的重要依據(jù)［41］。目前，人們普遍認(rèn)為酶的最適pH 值與其催化殘基的pKa值（酸度系數(shù)）大小緊密相關(guān)［42］。于是，基于一些pKa值預(yù)測(cè)軟件如H++［43］、CpHMD（continuous constant-pH molecular dynamics）［44］、pKD［45］、PROPKA［46］等可有效改變飼料用酶催化殘基pKa值，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)飼料用酶pH 依賴性的分子設(shè)計(jì)。例如，Cockburn 等［47］針對(duì)不同最適pH 值的纖維素酶序列進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析設(shè)計(jì)突變體，并利用H++和PROPKA 軟件評(píng)估突變位點(diǎn)對(duì)催化殘基pKa值變化的影響，獲得了3個(gè)在pH5.0下活性顯著提高的突變體。Wang 等［48］基于PROPKA 的預(yù)測(cè)結(jié)果，對(duì)Bacillus subtilis α-淀粉酶催化殘基周圍0.45 nm 以內(nèi)的氨基酸進(jìn)行設(shè)計(jì)，獲得了3 個(gè)最適pH 值下降0.5～1.5 個(gè)單位的突變體。Ludwiczek等［49］針對(duì)Bacillus circulans木聚糖酶進(jìn)行了更為大膽的嘗試，直接將酸/堿親核試劑殘基Glu172 突變?yōu)镠is以調(diào)整其pKa值，成功將酶的最適pH 值由5.6 降低到4.7，但遺憾的是酶活力只剩余了8%。試驗(yàn)結(jié)果充分說(shuō)明了催化殘基的pKa值大小直接決定了酶最適pH值的高低。

通常來(lái)講，調(diào)整酶催化殘基pKa值的策略主要有3種（圖2）：①基于靜電作用原理在催化殘基周圍引入帶負(fù)電荷氨基酸或帶正電荷氨酸從而提高或降低其pKa值。②基于氫鍵作用網(wǎng)絡(luò)通過(guò)催化殘基作為氫受體或供體從而提高或降低其pKa值。③基于疏水作用力通過(guò)催化殘基的羧基基團(tuán)去質(zhì)子化從而提高其pKa值。以具有典型的β jelly-roll三維結(jié)構(gòu)的糖苷水解酶第11 和12 家族木聚糖酶和葡聚糖酶為例［50-51］。它們催化口袋中起酸/堿親核試劑作用的催化殘基周圍存在一個(gè)最適pH 依賴的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)，在嗜酸飼料用酶中該位點(diǎn)為天冬氨酸，在嗜中性飼料用酶中該位點(diǎn)則為天冬酰胺。將嗜酸飼料用酶中的天冬氨酸突變?yōu)樘於０分?，可?dǎo)致最適pH 值升高（木聚糖酶突變體D37N最適pH值由2.8提高到5.5；葡聚糖酶突變體D98N 最適pH 值由4.0 提高到5.1），反之相反。結(jié)構(gòu)分析表明，嗜酸木聚糖酶中氨基酸Asp37側(cè)鏈與酸/堿親核試劑催化殘基間形成穩(wěn)定的氫鍵網(wǎng)絡(luò)，當(dāng)該氨基酸被突變?yōu)樘於０泛笸ㄟ^(guò)破壞氫鍵作用力從而改變了催化殘基pKa值，使得最適pH 值升高。Pokhrel 等［52］嘗試在Bacillus circulans木聚糖酶催化殘基Glu72 和Glu178 周圍引入帶正電荷氨基酸Arg 以降低催化殘基的pKa值，獲得了4 個(gè)最適pH 值向酸性方向偏移0.5～1.5 個(gè)單位的突變體。進(jìn)一步，Li 等［53］利用高分辨率X 射線晶體衍射技術(shù)、中子晶體學(xué)技術(shù)和CpHMD 模擬技術(shù)對(duì)糖苷水解酶第11 家族木聚糖酶pH 依賴性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)隨著反應(yīng)體系pH 值的升高，氨基酸殘基Y88 與催化殘基E177 之間的氫鍵鍵長(zhǎng)縮短，有力阻止了氨基酸E177 的側(cè)鏈向下旋轉(zhuǎn)從而無(wú)法從水分子中獲得質(zhì)子高效反應(yīng)。這一研究理論將會(huì)有效指導(dǎo)飼料用酶的pH依賴性分子設(shè)計(jì)。

圖2 調(diào)整飼料用酶催化殘基pKa值的3種策略［42］（1）靜電作用：在催化殘基周圍引入帶負(fù)電荷氨基酸或帶正電荷氨酸從而提高或降低其pKa值；（2）氫鍵作用：通過(guò)催化殘基作為氫受體或供體從而提高或降低其pKa值；（3）疏水作用：通過(guò)催化殘基的羧基基團(tuán)去質(zhì)子化從而提高其pKa值Fig.2 Strategies for adjusting the pKa value of catalytic residues in feeding enzymes[42](1)Electrostatic interactions:Introducing the negatively or positively charged amino acids around catalytic residues to increase or decrease the pKa value;(2)Hydrogen-bond interactions:Acting as the hydrogen acceptor or donor of catalytic residues to increase or decrease the pKa value;(3)Hydrophobic interactions:Deprotonation of the carboxyl group of catalytic residues to increase the pKa value.

值得注意的是，盡管在酶催化口袋中催化殘基的周圍進(jìn)行理性設(shè)計(jì)可以有效調(diào)節(jié)其pKa值進(jìn)而改變酶的最適pH 值，但與此同時(shí)也會(huì)大幅度影響酶的催化活性［54］，這對(duì)于飼料用酶的實(shí)際應(yīng)用非常不利。因此，在酸性條件下保持穩(wěn)定和高催化活性的飼料用酶pH 依賴性分子設(shè)計(jì)策略仍舊是蛋白質(zhì)工程研究領(lǐng)域的重點(diǎn)。Li 等［55］為了不影響酶催化活性，著眼于酶蛋白表面帶負(fù)電荷的氨基酸進(jìn)行理性設(shè)計(jì)，將5 個(gè)酸性氨基酸均突變?yōu)锳rg 之后，最適pH 值變化了2 個(gè)單位，由4.5 提高到了6.5，且催化效率提高了10.7 倍。Xia 等［56］發(fā)現(xiàn)O-糖基化修飾嚴(yán)重影響了β-葡萄糖苷酶的pH 穩(wěn)定性，將序列中O-糖基化特征基序突變后使得酶的耐受范圍從pH 4.0～5.0拓展到pH 3.0～10.0，且底物轉(zhuǎn)換數(shù)kcat由1664 s?1提高至1791~2136 s?1。此外，Zhou等［57］轉(zhuǎn)換了研究思路，基于植酸酶的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)進(jìn)行設(shè)計(jì)，以期將該酶的pH 反應(yīng)曲線向上平移，獲得了4 個(gè)在pH5.0 條件下活性提高的突變體。Ma 等［58］利用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)合Lasso 線性回歸方法對(duì)糖苷水解酶第11 家族木聚糖酶中影響最適pH 值的氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，獲取了8 個(gè)正突變體，它們的最適pH 值較野生型相比向酸性方向偏移了0.5～0.75 個(gè)單位，酶活維持在野生型的80%以上。盡管這些策略均有效實(shí)現(xiàn)了飼料用酶的活性和pH 依賴性雙重設(shè)計(jì)，但與酶穩(wěn)定性的設(shè)計(jì)效果相比，仍有較大提升空間。

3 蛋白酶抗性

在畜禽動(dòng)物的消化胃腸道中，會(huì)存在一些內(nèi)源性蛋白酶，如胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶等。在飼料中添加飼料用酶制劑，被畜禽動(dòng)物食用進(jìn)入消化道后，抵抗內(nèi)源性蛋白酶的降解特性成為了飼料用酶制劑的必要屬性［59］。這些內(nèi)源蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)的水解位點(diǎn)是保守的，如胃蛋白酶傾向于剪切氨基端或羧基端為芳香族氨基酸（如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸）或亮氨酸的肽鍵，胰蛋白酶專一性識(shí)別Arg/Lys 產(chǎn)生以Arg 和Lys 為碳末端殘基的肽段。因此，基于這些專一性的蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)進(jìn)行理性設(shè)計(jì)成為了首選策略，試圖通過(guò)消除蛋白酶的水解位點(diǎn)來(lái)增強(qiáng)飼料用酶抗內(nèi)源性蛋白酶水解的能力（圖3）。如Qiu等［60］針對(duì)黃曲霉素解毒酶中所有的Arg 和Lys 殘基展開分析，選取位于酶蛋白表面的45 個(gè)殘基為靶標(biāo)位點(diǎn)，結(jié)合分子對(duì)接技術(shù)和分子動(dòng)力學(xué)模擬技術(shù)設(shè)計(jì)出6個(gè)突變體并進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果表明其中兩個(gè)突變體（K213C/K244Q/K270T、R356E/K357T/R623C）抗胰蛋白酶水解能力較野生型分別提高了1.93倍和2.73倍。

圖3 飼料用酶對(duì)蛋白酶抗性的分子設(shè)計(jì)Fig.3 Design strategies for feed enzymes to resist the degradation of proteases

Niu等［61-64］針對(duì)植酸酶的蛋白酶抗性分子設(shè)計(jì)展開了系統(tǒng)研究。首先，以3個(gè)蛋白酶抗性差異顯著的植酸酶（序列一致性為83%）為核心研究材料進(jìn)行序列統(tǒng)計(jì)分析，選擇位于蛋白表面的Leu99、Leu162 和Glu230 3 個(gè)殘基為候選突變熱點(diǎn)［61］。與胃蛋白敏感的野生型植酸酶YeAPPA 相比，突變體E230G 抗胃蛋白酶降解的能力提高幅度高達(dá)447倍，而且這一有益突變位點(diǎn)還顯著提高了酶催化效率（2.1 倍）和在pH 1.0～1.5 條件下的穩(wěn)定性（處理1 h 后剩余酶活由野生型的63.7%～77.0%提高到92%以上）。隨后，該團(tuán)隊(duì)繼續(xù)瞄準(zhǔn)位于植酸酶表面的胃蛋白酶/胰蛋白酶切割位點(diǎn)進(jìn)行分子設(shè)計(jì)［62］。與胃蛋白敏感的野生型植酸酶YeAPPA 相比，3 個(gè)突變體（F89S、K226H、F89S/K226H）抗胃蛋白酶降解的能力提高幅度高達(dá)228～447 倍。將這一策略引入到α-半乳糖苷酶的胃蛋白酶抗性分子設(shè)計(jì)中，效果也非常明顯［63］。這一系列研究結(jié)果表明基于保護(hù)飼料用酶結(jié)構(gòu)表面的內(nèi)源性蛋白酶切割位點(diǎn)策略可有效增強(qiáng)飼料用酶抵抗蛋白酶水解的能力。基于這一結(jié)論，該團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步嘗試在植酸酶結(jié)構(gòu)表面引入N-糖基化修飾從而阻斷蛋白酶與其切割位點(diǎn)的接觸，以此達(dá)到抵抗蛋白酶水解的目的［64］。通過(guò)在植酸酶YeAPPA 蛋白表面引入N-糖基化修飾基序，使得酶經(jīng)過(guò)胃蛋白酶處理2 h 后的剩余酶活由野生型的不到1.3%提高到了21.1%～32.1%以上。胃蛋白酶抗性能力顯著增強(qiáng)的內(nèi)在原因表現(xiàn)在兩個(gè)方面：一是N-糖基化修飾增強(qiáng)了酶在pH 1.0～2.0 條件下的穩(wěn)定性；二是N-糖基化修飾有效阻止了胃蛋白酶與其切割位點(diǎn)的接觸，從而導(dǎo)致酶蛋白抵抗胃蛋白酶水解能力的提高。Hu 等［65］將該方法引入到β-甘露聚糖酶對(duì)蛋白酶抗性的分子改造中，獲得的兩個(gè)突變體g-347 和g-123 在經(jīng)胃蛋白酶處理2 h 后的剩余酶活由野生型的約50%提高到75%~85%。說(shuō)明該方法對(duì)飼料用酶抵抗蛋白酶能力的分子設(shè)計(jì)具有一定的普適性效果。

Wang等［66］基于酶束縛態(tài)形成的抑制過(guò)程建立了一套針對(duì)飼料用酶蛋白酶抗性的分子改造策略。選取β-葡萄糖苷酶BGL1 為研究材料，通過(guò)預(yù)測(cè)分析BGL1與胃蛋白酶互作的復(fù)合物結(jié)構(gòu)信息，獲取復(fù)合物構(gòu)象中的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)，最后基于分子動(dòng)力學(xué)模擬技術(shù)優(yōu)化并設(shè)計(jì)胃蛋白酶抗性突變體。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：獲得的兩個(gè)突變體Q627C 和Q627C/R543H/R646W 的胃蛋白酶抗性半衰期較野生型分別提高了1.36 倍和1.51 倍，胰蛋白酶抗性半衰期較野生型分別提高了0.93 倍和1.53 倍。這一策略是前面蛋白酶抗性分子改造方法的有力補(bǔ)充，對(duì)飼料用酶蛋白酶抗性分子設(shè)計(jì)的通用性方法的建立提供了技術(shù)支撐。

4 催化活性

飼料用酶的催化活性是評(píng)價(jià)其效價(jià)的首要參考指標(biāo)，決定了其應(yīng)用成本。所以，酶的催化機(jī)理解析以及活性提升一直是酶學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)研究問(wèn)題［67］?；钚钥诖敲傅鞍装l(fā)揮催化功能的直接部位，基于活性口袋的分子設(shè)計(jì)成為了提高酶催化效率的有效手段［68］。Tu 等［69-71］針對(duì)多聚半乳糖醛酸酶的活性口袋展開了系統(tǒng)的研究。首先，基于多聚半乳糖醛酸酶晶體結(jié)構(gòu)的構(gòu)象分析、酶-六聚半乳糖醛酸底物分子對(duì)接結(jié)果和分子動(dòng)力學(xué)模擬軌跡分析，研究了位于活性T3 loop 區(qū)上的Asn117 位點(diǎn)對(duì)于錨定底物的催化構(gòu)象起到的關(guān)鍵作用［69］。對(duì)該位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，導(dǎo)致底物轉(zhuǎn)化數(shù)kcat值由野生型的60 000 s-1下降到3～15 000s-1，說(shuō)明活性T3 loop區(qū)對(duì)該酶催化效率的影響非常大。于是，該團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步對(duì)活性T3 loop 區(qū)展開設(shè)計(jì)，試圖提高該酶的催化活力［70］。利用CAVER3.0.2 軟件對(duì)酶催化通道進(jìn)行預(yù)測(cè)并結(jié)合活性T3 loop 區(qū)的序列統(tǒng)計(jì)分析，找到非活性位點(diǎn)Thr113，將該位點(diǎn)突變成Lys 或Arg 后可使得酶催化效率較野生型提高28%～50%，其提升的分子機(jī)理為非活性位點(diǎn)Thr113 的突變改變了活性T3 loop 區(qū)的柔性進(jìn)而影響了酶與底物之間的結(jié)合。在對(duì)多聚半乳糖醛酸酶與底物的分子動(dòng)力學(xué)模擬時(shí)發(fā)現(xiàn)，在催化口袋內(nèi)部活性T3 loop 區(qū)上存在氨基酸殘基Asp129，其側(cè)鏈羧基與?2 位底物上的羧基通過(guò)一個(gè)Na+穩(wěn)定［71］。對(duì)該位點(diǎn)進(jìn)行虛擬飽和突變后并分別進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬分析，發(fā)現(xiàn)將Asp129 突變?yōu)長(zhǎng)ys后其側(cè)鏈可直接與底物結(jié)合，進(jìn)一步試驗(yàn)結(jié)果表明結(jié)合力ka值提高了50%，酶催化效率提高了4.7 倍。研究結(jié)果顯示了活性loop 區(qū)對(duì)調(diào)控酶的催化效率發(fā)揮了重要作用。

與此同時(shí)，上述研究結(jié)果也說(shuō)明針對(duì)催化口袋上的活性loop區(qū)進(jìn)行分子設(shè)計(jì)，可有效改善酶的催化效率。Yang 等［72］研究了活性loop3 對(duì)糖苷水解酶第12家族催化效率的影響機(jī)理，較長(zhǎng)的loop3可以加強(qiáng)酶-底物之間的氫鍵作用網(wǎng)絡(luò)從而有利于酶解產(chǎn)物的釋放。Zheng 等［73］將該研究方法引入纖維素酶的催化效率分子改良研究中，將loop6 上的殘基Asn233突變成Ala或Gly后使得酶催化效率較野生型分別提高了45%和52%。Yu 等［74］等也借鑒此方法成功獲得將內(nèi)酯水解酶催化活力分別提高2.9倍和3.4倍的突變體。Singh等［75］利用該方法對(duì)糖苷水解酶第5 家族葡聚糖酶進(jìn)行分子設(shè)計(jì)，將L11 loop區(qū)上的Asp256突變?yōu)镚ly使得酶催化效率提高了22 倍。盡管基于活性loop 區(qū)對(duì)酶的分子設(shè)計(jì)已得到了較好的研究進(jìn)展，但是其完整功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)還需進(jìn)一步研究，這也是基于活性loop區(qū)設(shè)計(jì)提升酶催化效率的前提。

隨著研究的不斷深入，人們逐漸發(fā)現(xiàn)酶的催化活性不僅僅受限于其催化口袋的影響。例如，Wang 等［76］發(fā)現(xiàn)Bacillus subtilis木聚糖酶XynLC9的N 末端殘基可影響其催化效率，將殘基Trp6/Gln7 突變?yōu)镻he/His、Asn8 突變?yōu)門yr 后可分別使得酶催化活性提高2.6倍和1.8倍。Dong等［77］在瘤胃木聚糖酶的C 末端引入一段富含Pro 的肽段之后使得嵌合酶的催化效率較野生型提高了2.48 倍。Rubio 等［78］發(fā)現(xiàn)了不同位點(diǎn)的N-糖基化修飾對(duì)Aspergillus nidulans木糖苷酶BxlB 催化活性的影響程度不同，其中N5 位置的N-糖基化修飾對(duì)提高酶催化活力起主要作用，而N1 和N7 位置的N-糖基化修飾對(duì)提高酶催化活力起輔助作用。Zhang等［79］發(fā)現(xiàn)了不同的linker 長(zhǎng)度影響了α-淀粉酶的催化活性，在野生型的基礎(chǔ)上延長(zhǎng)了linker 長(zhǎng)度使得酶催化效率提高了67%，但進(jìn)一步延長(zhǎng)linker 長(zhǎng)度后，酶催化效率提升幅度變小，較野生型僅提高43%。這一系列的研究結(jié)果表明，針對(duì)綠色、高效的飼料用酶蛋白催化反應(yīng)機(jī)理還有待進(jìn)一步的深入研究，除了酶蛋白直接與底物發(fā)生相互作用的催化口袋外，其他區(qū)域?qū)γ复呋钚缘挠绊懲瑯硬豢珊鲆暋Ｈ鏚im 等［80］發(fā)現(xiàn)了在Cryptopygus antarcticus甘露聚糖酶的結(jié)構(gòu)表面存在底物二級(jí)結(jié)合位點(diǎn)Trp147，可通過(guò)σ-π鍵作用力錨定甘露五糖底物。

也正是因?yàn)橛绊懨傅鞍捉Y(jié)構(gòu)構(gòu)象的因素呈現(xiàn)多樣化的特點(diǎn)，其綜合性能也會(huì)表現(xiàn)出相互平衡調(diào)節(jié)的現(xiàn)象，最直觀的體現(xiàn)是當(dāng)酶穩(wěn)定性得到提升時(shí)其催化活性會(huì)對(duì)應(yīng)的損失。如Wang 等［81］等對(duì)Streptomycessp.S9 木聚糖酶進(jìn)行理性設(shè)計(jì)，獲得了Tm值和在70 ℃下的t1/2提高7 ℃和9 倍的突變體，但該突變體的催化效率較野生型相比卻下降了6.1 倍。因此，借助合成生物學(xué)中全局調(diào)控的思路對(duì)飼料用酶的綜合性能進(jìn)行分子設(shè)計(jì)成為了當(dāng)前的首選策略。如Min 等［82］針對(duì)糖苷水解酶第11 家族木聚糖酶的結(jié)構(gòu)柔性進(jìn)行分析，重點(diǎn)圍繞中溫酶和嗜熱酶的柔性區(qū)域差異進(jìn)行設(shè)計(jì)，獲得了催化效率提高7.51 倍、構(gòu)象穩(wěn)定性提高0.7 ℃的突變體。Ren 等［83］圍繞堿性蛋白酶PROK 的催化三聯(lián)體周圍1 nm 范圍的氨基酸殘基，經(jīng)過(guò)B 因子、溶劑可接觸、保守性等角度的綜合設(shè)計(jì)，獲得了催化活性較野生型提高20%、60 ℃下穩(wěn)定性明顯提升的突變體。盡管這些有益探索取得了一定效果，但提升幅度仍有較大空間。

5 總結(jié)與展望

我國(guó)是畜禽養(yǎng)殖和飼料生產(chǎn)大國(guó)，2021 年產(chǎn)飼料達(dá)2.93 億噸。飼料用酶制劑作為綠色、環(huán)保的飼料添加劑，在提高飼料利用率、降低飼料生產(chǎn)成本、減少環(huán)境污染物排放等多方面發(fā)揮了巨大作用。飼料用酶的催化性能是決定其應(yīng)用功效的核心因素，直接關(guān)系到飼料用酶的效價(jià)。人們?cè)噲D從環(huán)境中直接獲取綜合性能優(yōu)良的飼料用酶基因，如Cheng 等［84］開發(fā)一個(gè)基于宏基因組測(cè)序結(jié)果快速獲取目標(biāo)基因的新策略。但限于絕大多數(shù)直接從自然環(huán)境中獲得的飼料用酶綜合性能都不能完全滿足飼料用酶制劑在熱穩(wěn)定性、pH 依賴性、蛋白酶抗性和催化活性等4 方面的要求，因此，催化性能的提升是飼料用酶制劑研發(fā)過(guò)程中必不可少的一個(gè)研究環(huán)節(jié)。

隨著結(jié)構(gòu)生物學(xué)和生物信息學(xué)的快速發(fā)展，蛋白質(zhì)工程技術(shù)在提升飼料用酶催化性能方面得到空前應(yīng)用。如前所述，針對(duì)飼料用酶的催化活性和熱穩(wěn)定性的研究策略多樣、提升效果相對(duì)明顯，且實(shí)現(xiàn)了二者同時(shí)提升的重大突破，顯著提升了飼料用酶制劑的效價(jià)。如武漢新華揚(yáng)生物股份有限公司先后推出的亮點(diǎn)產(chǎn)品賽樂(lè)植酸酶、耐熱植酸酶、超級(jí)GOD4000、超級(jí)GOD10000 等，既保證了飼料用酶的應(yīng)用效果，保護(hù)了生態(tài)環(huán)境，也大大降低了飼料用酶制劑的生產(chǎn)成本，實(shí)現(xiàn)了經(jīng)濟(jì)效益、社會(huì)效益、生態(tài)效益“三贏”。盡管如此，在不影響酶活性的前提下對(duì)飼料用酶綜合性能提升的分子設(shè)計(jì)依舊是未來(lái)的研究重點(diǎn)。如前所述，針對(duì)飼料用酶單一性能的分子改造技術(shù)已經(jīng)有了非常好的研究進(jìn)展，如何利用合成生物學(xué)的思想從酶蛋白全局角度出發(fā)以綜合提升飼料用酶的催化性能，為蛋白質(zhì)工程研究者們提出了巨大的挑戰(zhàn)。

此外，飼料用酶作為一種應(yīng)用導(dǎo)向極強(qiáng)的飼料添加劑，在蛋白質(zhì)工程技術(shù)方面的發(fā)展方向主要有以下幾點(diǎn)：一是秉承以應(yīng)用效果為導(dǎo)向的飼料用酶分子設(shè)計(jì)。飼料原料中的組成成分是極其復(fù)雜的，除了主鏈多糖以外還存在大量的分支側(cè)鏈多糖，因此基于單一組分標(biāo)準(zhǔn)底物設(shè)計(jì)的高催化活性飼料用酶突變體在實(shí)際應(yīng)用場(chǎng)景中很難高效發(fā)揮作用。二是多功能酶的分子設(shè)計(jì)。除了多結(jié)構(gòu)域多功能酶外，近年還發(fā)現(xiàn)了單結(jié)構(gòu)域雙功能酶以高效降解復(fù)雜底物的主鏈和側(cè)鏈部分。如Cao 等［85］發(fā)現(xiàn)了一個(gè)單結(jié)構(gòu)域雙功能酶——乙酰酯酶/木糖苷酶，采用各自的催化口袋分別對(duì)木聚糖主鏈和側(cè)鏈多糖進(jìn)行水解，這為飼料原料的高效利用指明了新的方向。三是在重視飼料用酶的熱穩(wěn)定性研究的同時(shí)，需關(guān)注飼料用酶在生理體溫下的活性。由于飼料制粒加工工藝的要求，熱穩(wěn)定性的提升一直是飼料用酶工程領(lǐng)域的持續(xù)研究熱點(diǎn)，但最終飼料用酶是需要在動(dòng)物體內(nèi)的胃腸道里發(fā)揮作用的。大多數(shù)酶熱穩(wěn)定性的設(shè)計(jì)結(jié)果是將其最適溫度曲線向右平移，導(dǎo)致低溫下的活性降低，而You 等［86］針對(duì)耐熱木聚糖酶的loop區(qū)段進(jìn)行設(shè)計(jì)，獲得的有益突變體M173E/N269G最適溫度曲線向上平移，在保證熱穩(wěn)定性提高的同時(shí)實(shí)現(xiàn)了低溫條件下活性的提升。四是新技術(shù)的開發(fā)。酶分子設(shè)計(jì)技術(shù)的持續(xù)創(chuàng)新是飼料用酶不斷發(fā)展的核心動(dòng)力。如大數(shù)據(jù)人工智能技術(shù)已被應(yīng)用于提高酶的蛋白表達(dá)量上［87］。這些新技術(shù)的實(shí)施有望推動(dòng)飼料用酶制劑的研發(fā)邁向新的臺(tái)階。