茍 鼎，張臘梅，黃紅琴

（達(dá)州中醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院藥學(xué)院，四川達(dá)州 635000）

花椒是中國特有的香辛類作物，除花椒粒本身具有廣泛的實(shí)用價(jià)值外，其主要副產(chǎn)物花椒葉的使用價(jià)值也越來越被重視。目前的研究表明，花椒葉可以提取出一系列化學(xué)物質(zhì)，主要是揮發(fā)類、黃酮類、多糖、生物活化酶和一些生物堿，游離脂肪酸等物質(zhì)，總體種類數(shù)量已經(jīng)接近150 種。提取花椒葉中的有機(jī)溶液進(jìn)行生化特性分析，發(fā)現(xiàn)其在消除羥基自由基、抑菌抗毒等方面有著較為明顯的作用。本文對(duì)幾種不同品種的花椒葉提取物進(jìn)行成分分析，綜述了目前對(duì)花椒葉成分分析的部分成果，同時(shí)介紹了有關(guān)實(shí)驗(yàn)和測(cè)定方法，以期對(duì)提高花椒葉的研究和利用效能做出貢獻(xiàn)。

1 花椒葉化學(xué)成分分析

目前研究表明，通過各種方法提取花椒葉中的成分進(jìn)行分析，得出的花椒葉的主要成分類似，主要有黃酮類物質(zhì)、揮發(fā)油、酰胺、多糖以及生物酶，其中黃酮類物質(zhì)和揮發(fā)性物質(zhì)是當(dāng)前研究利用的重點(diǎn)，成分所占比例較大。表1 中將各類物質(zhì)集的主要代表物質(zhì)加以羅列說明。

表1 花椒葉主要成分

1.1 揮發(fā)油

吳剛[1]，周江菊[2]，史芳芳[3]等人分別對(duì)椿葉花椒、樗葉花椒和竹葉花椒進(jìn)行了物質(zhì)的分離和提取實(shí)驗(yàn)操作。將5g 的花椒葉進(jìn)行干燥并粉碎加入燒瓶中，加入蒸餾水，采用揮發(fā)油提取法提取揮發(fā)物質(zhì)，進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析，其中色譜柱條件為：尺寸30m *0.25mm,0.25μm，載氣種類為氦，流速5.6 mL/min;加熱過程:柱初溫400C，勻速升溫到1000C，標(biāo)定用時(shí)時(shí)長4min。再勻速升溫至2600C，標(biāo)定用時(shí)時(shí)長20min。質(zhì)譜儀條件為離子源溫度2300C;接口溫度2800C，質(zhì)量掃描范圍m/z 30-400;電離電壓70 eV;溶劑延遲時(shí)間2min。

實(shí)驗(yàn)分離出了揮發(fā)性成分。通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)，三種花椒葉的揮發(fā)油成分主要以烯類物質(zhì)，單氧原子醇、雙氧原子酯，單氧原子酮類物質(zhì)為主，偶有醛類物質(zhì)和酸類物質(zhì)。圖1是三種花椒葉成分的含量占比圖。通過圖1可知三種花椒葉在物質(zhì)集上重合度較高，在各分子的具體含量上統(tǒng)一性較小同時(shí)三種花椒葉中，烯類物質(zhì)分子式主要以C10H16C15H24為主，醇類物質(zhì)主要以C10H18O、C15H26O 為主，酯類物質(zhì)分子式C12H20O2，酮類物質(zhì)分子式主要以C10H16O 為主。上述物質(zhì)在分子結(jié)構(gòu)上存在較多的相似性，且有一定比例的分子結(jié)構(gòu)的手向性。表2 將目前研究分流出的主要化合物進(jìn)行列舉，通過與圖1 對(duì)比可知，不同的花椒葉其化合物的種類、含量差異較為明顯。

表2 花椒葉總體化合物的種類

由圖1 可知三種花椒葉的揮發(fā)油成分主要集合在烯類化合物，醇類化合物范圍內(nèi)，椿葉花椒葉的揮發(fā)油成分中較為突出地含有大量的酮類化合物，酯類化合物和酸類化合物偶見于樗葉花椒葉中。上述物質(zhì)在色覺和味覺上具有類似表現(xiàn)，因此在一定程度上可以解釋不同種花椒葉的生理試驗(yàn)的相似性。

圖1 花椒葉揮發(fā)油成分對(duì)比

1.2 黃酮類物質(zhì)

黃酮類物質(zhì)具有較大的藥用價(jià)值[4-5]，其主要表現(xiàn)在體內(nèi)外抗自由基氧化破壞能力較強(qiáng)，且對(duì)常見致病桿菌和一些病毒的活性抑制能力較強(qiáng)。楊立琛[6]等人分別進(jìn)行了花椒葉的黃酮類物質(zhì)的提取，稱取一定量的花椒葉粉末，按1:30 的料液比加入濃度為65%乙醇溶液為溶劑，放入微波玻璃反應(yīng)器中，選擇微波功率為500 W，在600C 下用微波萃取儀萃取4 min,待提取液冷卻后進(jìn)行過濾，濾液經(jīng)石油醚萃取以除去葉綠素等脂溶性成分，去掉石油醚層，得到了花椒葉黃酮的提取液。他們的結(jié)果表明黃酮類物質(zhì)中主要以金絲桃苷和槲皮苷為主。孫晨倩[7]和紀(jì)珍珍[8]分別在各自的實(shí)驗(yàn)研究中利用上述方法測(cè)算出了黃酮類物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為133.63g/kg,15.97mg/g。陳紅林[9]進(jìn)行了陜西三種品種的花椒葉的黃酮類物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定，具體方法為稱取三種經(jīng)過粉碎的三種花椒葉各1g,按照料液比1:30 在每份中加入80%甲醇溶液30mL，溫度設(shè)置為500C，進(jìn)行超聲波震蕩提取持續(xù)40 min，過濾后稱取50ml 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，再加入蘆丁C2H60,NaOH,CHC13,Al(N03)39H20,NaNO2等制劑，均勻后利用紫外/可見光光度計(jì)進(jìn)行分析，經(jīng)過測(cè)定在2017 年6 月和8 月花椒葉的黃酮類物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均值為14.07mg/g和11.69mg/g。范箐華[10]等人利用溶液萃取法，分別用三種溶液進(jìn)行了黃酮提取，三次實(shí)驗(yàn)的黃酮提取率均值為3.45%。黃酮類物質(zhì)的提取實(shí)驗(yàn)較為復(fù)雜，從原理上劃分主要是以化學(xué)萃取，物理萃取和生物質(zhì)等方法為主。表3 中將目前幾種主要的實(shí)驗(yàn)方法和原理進(jìn)行了總結(jié)。

表3 黃酮類成分提取方法

1.3 酰胺

酸胺類化合物是導(dǎo)致花椒呈現(xiàn)味覺上的辛麻感的主導(dǎo)原因，目前研究結(jié)果表明花椒葉中的酰胺類物質(zhì)的存在集群是脂肪酸胺為主，且其不飽和性比例較高。陳槐萱[11]將干燥花椒葉和果皮分別粉碎，按料液比1:10 加入氯仿，250C 下進(jìn)行混合過濾，對(duì)濾渣再次進(jìn)行上述操作，合并兩組過濾后的液體進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)操作，純化后的液體進(jìn)行色譜分析，發(fā)現(xiàn)提取物的主要物質(zhì)為山椒素類物質(zhì)，具體分子形式有三種。茍鼎[12]等人利用乙醇進(jìn)行花椒葉中分離成分的萃取保有試劑，采用微波震動(dòng)能量系統(tǒng)對(duì)花椒葉中的花椒素進(jìn)行分離和提純，得出了在溫度為298K，功率在0.4KW 的條件下，其最大山椒素提取量為5.98mg/g。

1.4 糖類和蛋白質(zhì)

孫晨倩等對(duì)花椒葉進(jìn)行了糖類的提取和質(zhì)量測(cè)定，取適量花椒葉樣品粉末，按照料液比1∶40 加入純水進(jìn)行均勻攪拌，攪拌后的液體在25℃的條件下用60W 的超聲波儀器進(jìn)行輔助提取30min;隨后進(jìn)行離心過濾，并凍干封存，采用GB50095—2010 方法進(jìn)行測(cè)定，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)測(cè)定其多糖含量為8.5g/kg。其對(duì)花椒葉進(jìn)行的蛋白質(zhì)測(cè)定實(shí)驗(yàn)表明蛋白質(zhì)含量豐富，且其中的氨基酸種類基本為人體進(jìn)行正?；顒?dòng)所需氨基酸[13]，所測(cè)定的花椒葉中的必需氨基酸在氨基酸總類中占比達(dá)到了0.46。紀(jì)珍珍對(duì)鳳縣花椒、野生花椒等花椒葉作了不同時(shí)期的蛋白質(zhì)提取分析實(shí)驗(yàn)，按照GB/T50095-2010 中蛋白質(zhì)的測(cè)定方法中的自動(dòng)凱氏定氮儀法進(jìn)行測(cè)定，其中稱取樣品1g，精確至0.001g。研究發(fā)現(xiàn)7 種花椒葉的蛋白質(zhì)含量的總提變化范圍在9.8g/100g 到22.7g/100g。孫偉[14]等人利用超聲波設(shè)備儀器對(duì)花椒葉進(jìn)行多糖的提取并進(jìn)行了提取能力的評(píng)估測(cè)算，發(fā)現(xiàn)在溫度為342K，醇沉濃度為0.9，料液比為1:20g/ml 時(shí)，多糖的提取響應(yīng)值最大，可達(dá)到0.981%，與理論值0.990%非常接近，響應(yīng)效果十分良好。

1.5 其他成分

除上述成分外，花椒葉中還含有一定比例的脂肪、酚類、粗纖維和灰分等[15]。其中酚類具有一定的藥用價(jià)值[16]，有一定的健康導(dǎo)向的血糖調(diào)節(jié)能力，并對(duì)于心臟和腦部的血液和血管系統(tǒng)有一定的保護(hù)能力。孫晨倩和紀(jì)珍珍分別進(jìn)行了花椒葉的酚類含量的測(cè)定，分別為552.71g/kg,23.66mg/g。兩人對(duì)于花椒葉中脂肪的測(cè)算結(jié)果均表明，花椒葉中的脂肪含量較低，有益于人體良性發(fā)展。對(duì)于有機(jī)纖維和無機(jī)灰的測(cè)定結(jié)果的含量比例分別超過了0.05 和0.06。

2 花椒葉提取物的生物特性作用分析

花椒葉提取物具有一定的藥用作用，比如抑制身體內(nèi)的炎癥癥狀及反應(yīng)，降低病毒活性毒性，促進(jìn)血糖的正向調(diào)節(jié)。具有上述功效的重要原因是其在體內(nèi)外抗氧化活性，抑菌抗毒性和酶生化活性等方面具有一定程度的作用能力。

2.1 抗氧化活性

羥基和自由基對(duì)生物細(xì)胞的衰老性作用呈現(xiàn)正相關(guān)，原因是自由基會(huì)對(duì)細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和核糖核酸等物質(zhì)造成氧化性腐蝕[17]。周江菊等對(duì)樗葉花椒葉的提取物進(jìn)行了自由基類物質(zhì)的清除能力測(cè)定，取用一定量的花椒葉純化提取物溶液，再加入0.05mol/L 的Trics-HCL 的溶液進(jìn)行水浴加熱，再加入鄰苯三酚和鹽酸溶液進(jìn)行水浴加熱，溫度均為250C,然后進(jìn)行吸光度的測(cè)定，進(jìn)而測(cè)定清除率。由圖2 可知，樗葉花椒葉的提取物對(duì)自由基進(jìn)行氧化破壞的抵制能力較強(qiáng)，清除比率較高。自由基的清除能力與提取物的作用數(shù)量呈現(xiàn)正向的類線性關(guān)聯(lián)。對(duì)在0.5g/ml 到3g/ml 的濃度變化范圍內(nèi)，三種自由基的清除比率的斜率較大，在3g/ml 到4g/ml 時(shí)，三種自由基的清除比率的斜率較小，幾乎不再發(fā)生變化。

圖2 樗葉花椒葉的提取物對(duì)三種自由基清除效果

王征帆[18]等利用超波提取法對(duì)大紅袍花椒的花椒葉進(jìn)行了內(nèi)容物的提取，以乙醇溶液為溶劑，將提取物溶液分別加入到放有超氧自由基和羥基自由基的溶液中進(jìn)行反應(yīng)，采用比色法對(duì)反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行處理。大紅袍花椒葉的提取物對(duì)兩種自由基一定程度清除效果如圖3 所示。該實(shí)驗(yàn)分別加入了0.2ml，0.4ml，0.6ml 和1ml 的花椒葉提取物溶液，隨著提取液質(zhì)量的增加，兩種自由基的清除比率均增加，且對(duì)超氧自由基的清除效果要低于羥基自由基的清除效果。李君珂[19]等通過對(duì)加入花椒葉提取物的白鰱咸魚的脂肪含量和脂肪酸含量與不加入花椒葉提取物的同種咸魚進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)加入花椒葉提取物后游離脂肪酸含量降低而脂肪含量相對(duì)較高，證明了花椒葉提取物在一定程度上阻止了脂肪被氧化成脂肪酸的進(jìn)程。

圖3 大紅袍花椒葉提取物對(duì)兩種自由基的清除率

茍鼎等利用微波提取法對(duì)花椒葉成分進(jìn)行提取，主要提取產(chǎn)物為山椒素，其展開山椒素的抗氧化活性的實(shí)驗(yàn)，以鐵還原力、0H 自由基清除能力和ABTS 自由基清除能力模型來評(píng)價(jià)花椒葉山椒素抗氧化能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4 所示。結(jié)果表明山椒素的抗氧化活性能力顯著，且與山椒素的施加濃度呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)聯(lián)。

圖4 花椒葉山椒素的抗氧化活性測(cè)定

2.2 抑菌性

施瑤[20]等利用乙醇溶液對(duì)花椒葉提取物進(jìn)行萃取，以變形鏈球菌、放線菌和嗜血放線伴生桿菌為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，利用瓊脂擴(kuò)散法和最低抑菌濃度法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將萃取溶液滴入含有口腔疾病致病細(xì)菌的培養(yǎng)基中，結(jié)果表明萃取溶液對(duì)致病細(xì)菌的活性抑制呈現(xiàn)正向關(guān)聯(lián)，且與濃度正相關(guān)。龔晉文[21]等利用花椒葉提取物對(duì)大腸桿菌等常見菌類進(jìn)行混合實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在一定條件下，提取物溶液對(duì)上述菌群的活性及其增殖性均有破壞性效果。其中抑制效果與提取物的溶液濃度正相關(guān)，與溶液環(huán)境的堿性指向性正相關(guān)，且在酸性條件下，提取物的抑菌效果不明顯。李克坤[22]對(duì)花椒葉提取物進(jìn)行了物質(zhì)分離和結(jié)構(gòu)掃描，并對(duì)分離后的化學(xué)成分進(jìn)行了臨床的藥物敏感性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)分離成分對(duì)除大腸桿菌之外的常見致病性細(xì)菌和真菌，如引起皮膚真菌感染和病理性肺炎的菌群的抑制和殺滅能力顯著。呂可[23]等將花椒葉進(jìn)行浸泡，將浸泡一定時(shí)間的液體進(jìn)行盆栽植物的澆灌。該實(shí)驗(yàn)對(duì)盆栽載體中的各類真菌和細(xì)菌等數(shù)量進(jìn)行觀察記載，發(fā)現(xiàn)在澆灌后一段時(shí)間內(nèi)，培養(yǎng)載體內(nèi)的多數(shù)細(xì)菌和真菌類生物的數(shù)量和活動(dòng)活性均呈下降態(tài)勢(shì)。且浸泡液的質(zhì)量濃度在40g/L,其對(duì)細(xì)菌的抑制效果最好，此時(shí)細(xì)菌群落數(shù)量同比下降超過22%。孫偉等利用花椒葉提取物進(jìn)行了痢疾和傷寒類疾病致病的菌群作用效果實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明花椒葉提取物對(duì)上述細(xì)菌群落的抑制作用均呈現(xiàn)正向關(guān)聯(lián)。

2.3 酶化活性

呂可等通過研究發(fā)現(xiàn)，花椒葉浸泡葉作用過的盆栽植物載體土壤中，根際土蛋白酶、蔗糖酶和酸性磷酸酶活性明顯低于非根際土相應(yīng)的酶活性,而過氧化氫酶和多酚氧化酶活性則顯著升高。土壤的蛋白酶活性與蔗糖酶活性重合度極高,多酚氧化酶活性與蔗糖酶活性重合度極高。孫晨倩等利用黑腹果蠅進(jìn)行生物體內(nèi)的花椒葉醇溶物的酶活性影響評(píng)估，發(fā)現(xiàn)花椒葉醇溶物對(duì)S0D 等指標(biāo)呈現(xiàn)正向作用關(guān)系。

2.4 亞硝酸根的清除活性

亞硝酸根較為廣泛地存在于大白菜等綠葉蔬菜中，且亞硝酸根極易形成亞硝酸鹽等致癌性物質(zhì)。在世界范圍內(nèi)，亞洲人患胃癌的比例較大。中國東北部地區(qū)人口患胃癌的幾率要高于全國平均水平，原因在于上述地區(qū)的人口喜食高鹽和腌制類食品。清除亞硝酸根是有效防止胃癌的手段之一。周江菊等進(jìn)行了樗葉花椒葉的提取物在體外進(jìn)行亞硝酸根的清除模擬實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)如圖5 所示。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)花椒葉提取物對(duì)亞硝酸根的毒性轉(zhuǎn)化能力具有抑制作用，且花椒葉提取物的濃度與亞硝酸根的毒性轉(zhuǎn)化抑制效果呈正相關(guān)的關(guān)聯(lián)，在濃度為4mg/ml 時(shí)，亞硝酸根清除比率最大，超過了86%。

圖5 花椒葉提取物對(duì)亞硝酸根的清除作用

2.5 其他活性

張大帥[24]等利用花椒葉提取物對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行抑制實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其對(duì)于一種血癌細(xì)胞的抑制作用呈現(xiàn)明顯正向關(guān)聯(lián)，且在較低濃度時(shí)的抑制作用靈敏度較高，實(shí)驗(yàn)的另外三種癌細(xì)胞均能被提取物溶液抑制，相對(duì)于實(shí)驗(yàn)中的血癌細(xì)胞，其在較大的溶液濃度能表現(xiàn)出一定的抑制反應(yīng)靈敏度。

3 結(jié)論與展望

花椒作為中國飲食文化的一種特殊而不可或缺的存在，對(duì)于中國的飲食文化和中國人的飲食習(xí)慣均有重大貢獻(xiàn)。中國種植花椒的面積極廣，品種繁多。在利用好花椒粒的同時(shí)，充分利用好主要副產(chǎn)物的花椒葉是一個(gè)不可忽視的問題。根據(jù)對(duì)花椒葉的有關(guān)成分的分析，其主要成分有黃酮類物質(zhì)、揮發(fā)油、酰胺、多糖、生物酶等物質(zhì)，其中對(duì)于揮發(fā)油的提取方法較為單一，主要揮發(fā)油提取法提取揮發(fā)物質(zhì)，進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析，該種方法耗費(fèi)時(shí)間較長，其容易受雜質(zhì)影響，因此后續(xù)研究可優(yōu)化考慮優(yōu)化上述影響；對(duì)于黃酮類物質(zhì)的提取方法較多，目前主流的提取方法列表在文中，目前常用的溶液萃取法操作較為繁瑣，流程周期較長，超臨界萃取法需要特定的物理設(shè)備，如采用則需要一次性較大資金投入，生物酶解法相對(duì)前兩者優(yōu)點(diǎn)明顯，投入少，時(shí)間短，但是會(huì)有酶解出的其他生物分子的干擾因素，因此后續(xù)研究可以重點(diǎn)考慮生物酶解的純化工作。對(duì)于酰胺和多糖的提取工作，目前主要以國標(biāo)的方法進(jìn)行，有操作流程長，需要的化學(xué)制劑太多的缺陷，因此后續(xù)工作可以進(jìn)行相關(guān)的優(yōu)化研究。對(duì)于花椒葉提取物所展現(xiàn)的抗氧化活性、抑菌性、酶化活性等在食品衛(wèi)生中已經(jīng)有了較為不錯(cuò)的應(yīng)用，但是應(yīng)用領(lǐng)域較窄，后續(xù)研究可以推進(jìn)應(yīng)用的拓寬，對(duì)于其藥用和醫(yī)學(xué)價(jià)值的應(yīng)用，現(xiàn)在只在極少數(shù)的領(lǐng)域如中藥和幾種西醫(yī)的臨床實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行應(yīng)用[25]，因此后續(xù)研究可以考慮是否可以推進(jìn)其在更加廣泛的臨床醫(yī)學(xué)和制藥等方面的研究和應(yīng)用。推動(dòng)花椒葉的有關(guān)研究，有利于提高花椒屬作物的整體利用率和經(jīng)濟(jì)性，有利于完善花椒產(chǎn)業(yè)鏈的發(fā)展。