李 洋，張夢(mèng)雅，馬超群，周 宇，王 崢，王慧智

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院；2.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院婦產(chǎn)科，黑龍江 牡丹江 157011)

我國(guó)高度重視出生缺陷防治工作，甚至將多地的產(chǎn)前篩查項(xiàng)目納入民生工程。隨著生育政策的放開，高齡孕婦的比例相應(yīng)增加，理論上，胎兒染色體異常的發(fā)生率也會(huì)增加，因單一年齡為高危因素需進(jìn)行介入性產(chǎn)前診斷的需求上升，這需要對(duì)母體子宮進(jìn)行穿刺采樣，屬于有創(chuàng)性操作，可能發(fā)生感染、出血、甚至小概率及潛在的胎死宮內(nèi)、流產(chǎn)等風(fēng)險(xiǎn)[1]。無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)(non-invasive prenatal testing,NIPT)主要益處在于提高臨床靶向異常的檢出率，同時(shí)減少假陽性結(jié)果和侵入性檢測(cè)的數(shù)量[2]。雖然我國(guó)仍將預(yù)產(chǎn)期年齡≥35歲的孕婦作為該技術(shù)的慎用人群，但有研究表明，NIPT技術(shù)在高齡孕婦中也有良好的檢測(cè)性能，2015年美國(guó)婦產(chǎn)科醫(yī)師學(xué)會(huì)(American College of Obstetricians and Gynecologists,ACOG)和母胎醫(yī)學(xué)會(huì)(Society for Maternal-Fetal Medicine,SMFM)推薦所有孕婦都可選擇NIPT篩查[3]，鑒于其復(fù)雜性和成本受限，我國(guó)針對(duì)高齡孕婦的產(chǎn)前篩查和診斷決策仍然存在爭(zhēng)議，故本研究回顧分析了不同預(yù)產(chǎn)年齡孕婦產(chǎn)前篩查、診斷及妊娠結(jié)局隨訪，進(jìn)而探討NIPT的篩查價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象我們收集了我們收集了2020年1月至2020年12月于北京市貝瑞和康基因診斷實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行NIPT檢測(cè)的牡丹江地區(qū)孕婦共1295例，檢測(cè)過程均符合國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)于2016年發(fā)布的《孕婦外周血胎兒游離DNA產(chǎn)前篩查與診斷技術(shù)規(guī)范》。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)檢測(cè)孕周為12～22+6周；(2)自然受孕者；(3)孕婦及家屬充分知情并自愿要求進(jìn)行NIPT。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)既往明確有過染色體異?；虿幻髟蛩绿毫鳟a(chǎn)、引產(chǎn)、分娩、畸形及新生兒死亡史者；(2)夫妻任意一個(gè)和兩個(gè)存在染色體異常或基因遺傳病家族史者；(3)夫婦任一個(gè)或兩個(gè)自身或家族有近親婚配史者；(4)曾明確接觸過有毒化學(xué)物質(zhì)或放射性物質(zhì)者；(5)孕期曾患有嚴(yán)重感染性疾病者；(6)1年內(nèi)曾行細(xì)胞免疫治療、異體輸血或者接受過移植手術(shù)者；(7)胎兒超聲檢查已經(jīng)提示有結(jié)構(gòu)異常者；(8)重度肥胖者(BMI>40 kg/m2)；(9)雙胎及多胎妊娠者；(10)患有惡性腫瘤者；(11)各種原因無法明確胎兒核型分析或完成妊娠結(jié)局隨訪者(隨訪應(yīng)至少至分娩后12周)；(12)臨床信息不完整者；(13)專業(yè)醫(yī)師評(píng)估可能存在有其他能影響檢測(cè)準(zhǔn)確性者。本研究獲得牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 傳統(tǒng)產(chǎn)前篩查 (1)血清學(xué)篩查 抽取妊娠15～20+6周孕婦2 mL靜脈血，分離血清待檢測(cè)。早孕期篩查指標(biāo)包括胎兒頸項(xiàng)透明層(nuchal translucency,NT)厚度、血清絨毛膜促性腺激素的游離β亞單位(free β-human chorionic gonadotropin,free β-hCG)、妊娠相關(guān)血漿蛋白A(pregnancy associated plasma protein A,PAPP-A)。中孕期篩查指標(biāo)有血清甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)、hCG或free β-hCG、游離雌三醇(unconjugated estriol,uE3)、抑制素A(inhibinA,InhA)。本研究采用逐步的序貫篩查(stepwise sequential screen-ing)：先行早孕期篩查并計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)值，是否依據(jù)早孕期風(fēng)險(xiǎn)即進(jìn)行產(chǎn)前診斷，還是等待完成中孕期篩查、結(jié)合早孕期篩查結(jié)果共同計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)值之后再?zèng)Q定是否行產(chǎn)前診斷，則由患者自行選擇，此為最理想篩查模式[4]。(2)傳統(tǒng)篩查風(fēng)險(xiǎn)等級(jí) 血清學(xué)篩查結(jié)果：T21高風(fēng)險(xiǎn)：風(fēng)險(xiǎn)值≥1∶270，臨界風(fēng)險(xiǎn)值:1∶1000≤風(fēng)險(xiǎn)值<1∶270；T18高風(fēng)險(xiǎn)：風(fēng)險(xiǎn)值≥1∶350，臨界風(fēng)險(xiǎn)值：1∶1000≤風(fēng)險(xiǎn)值<1∶350；T13 高風(fēng)險(xiǎn)：風(fēng)險(xiǎn)值≥1∶350，臨界風(fēng)險(xiǎn)值:1∶1000≤風(fēng)險(xiǎn)值<1∶270。NT值>2.5 mm為異常。

1.2.2 NIPT檢測(cè) 每名入組孕婦采集10 mL外周血于cell-free DNA BCT采血管(Streck,USA)，離心得到至少1.2 mL血漿后使用血漿游離DNA提取試劑盒(磁珠法，貝瑞)提取DNA(濃度0.05～0.2 ng/μL)，經(jīng)過末端補(bǔ)平-接頭連接來構(gòu)建文庫。以上反應(yīng)完成后立即純化處理(高通量測(cè)序文庫構(gòu)建DNA純化試劑盒，磁珠法，貝瑞)純化所得DNA文庫不低于10 pM，使用適用機(jī)型基因測(cè)序儀上機(jī)測(cè)序(NextSep CN500)，上機(jī)數(shù)據(jù)傳輸至貝比安數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)，運(yùn)行序列比對(duì)及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，獲得Z-score。Z-score=3.0為臨界值。染色體Z-score≥3.0判定為該染色體三體陽性，染色體Z-score<3.0判定為陰性。

1.2.3 侵入性產(chǎn)前診斷 由有產(chǎn)前診斷資質(zhì)醫(yī)生超聲介導(dǎo)下行經(jīng)腹羊膜腔穿刺獲得的羊水細(xì)胞行核型分析、熒光原位雜交(fluorescence in situhybridization,FISH)或染色體微陣列分析(chromo-some microarray analysis,CMA)，并出具報(bào)告。

1.3 結(jié)果獲取方法入組對(duì)象一般資料及傳統(tǒng)血清學(xué)篩查結(jié)果、NIPT結(jié)果由牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院及貝瑞和康北京基因診斷實(shí)驗(yàn)室共同提供，采用病案查詢和電話等方式對(duì)產(chǎn)前診斷結(jié)果、妊娠結(jié)局、新生兒健康狀況進(jìn)行隨訪(隨訪應(yīng)至少至分娩后12周)，若引產(chǎn)要行核型分析以確診。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法將NIPT結(jié)果分別與傳統(tǒng)血清學(xué)篩查、侵入性產(chǎn)前診斷結(jié)果(金標(biāo)準(zhǔn))進(jìn)行比對(duì)，計(jì)算侵入性產(chǎn)前診斷率，靈敏度、特異度、誤診率、漏診率、陽性預(yù)測(cè)值(positive predict value,PPV)、陰性預(yù)測(cè)值(negative predict value,NPV)。PPV=真陽性病例數(shù)/(真陽性病例+假陽性病例)×100%，NPV=真陰性病例數(shù)/(真陰性病例+假陰性病例)×100%，靈敏度=真陽性/(真陽性+假陰性)×100%，特異度=真陰性/(假陽性+真陰性)×100%。采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析：計(jì)量資料采用“均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差”表示，高齡組與適齡組組間率的比較采用四格表卡方檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)方面的意義。

2 結(jié)果

2.1 入組孕婦一般情況、產(chǎn)前診斷及隨訪結(jié)果

2.1.1 1295例孕婦預(yù)產(chǎn)年齡、檢測(cè)孕周以及BMI的一般情況 本研究納入行NIPT孕婦共計(jì)1295例，其預(yù)產(chǎn)期年齡為(30.54±4.19)歲，檢測(cè)孕周為(17.45±1.66)周，BMI為(23.83±3.84) kg/m2，見表1。

表1 1295例孕婦預(yù)產(chǎn)年齡、檢測(cè)孕周以及BMI一般情況

2.1.2 不同年齡分組孕婦應(yīng)用NIPT情況及確診情況 1295例孕婦應(yīng)用NIPT的年齡集中在26～35歲之間，共計(jì)1007人，呈現(xiàn)正偏態(tài)分布，確診病例數(shù)共計(jì)10例，見圖1。

圖1 不同年齡分組孕婦應(yīng)用NIPT情況及確診情況

2.1.3 各檢測(cè)孕周孕婦應(yīng)用NIPT情況 大多數(shù)孕婦選擇在16周(23.48%)、18周(21.85%)、17周(21.31%)、19周(12.82%)、15周(7.26%)應(yīng)用NIPT,在22、14、13、12周應(yīng)用NIPT篩查者總計(jì)占比僅為2%，見圖2。

圖2 各檢測(cè)孕周孕婦應(yīng)用NIPT情況

2.1.4 NIPT產(chǎn)前篩查指征占比 1295例孕婦中半數(shù)人(50.43%)直接選擇行NIPT，而有指征選擇NIPT者僅占49.57%，單純高齡為211例(16.29%)，傳統(tǒng)產(chǎn)前篩查陽性為431例(33.28%)，見圖3。

圖3 NIPT產(chǎn)前篩查指征占比

2.1.5 NIPT對(duì)染色體數(shù)目異常篩查價(jià)值的評(píng)價(jià) 1295例孕婦中行傳統(tǒng)產(chǎn)前篩查605例(NT異常、血清學(xué)篩查臨界風(fēng)險(xiǎn)和(或)高風(fēng)險(xiǎn))任一項(xiàng)異常為傳統(tǒng)產(chǎn)前篩查陽性共431例，605例中NIPT陽性者為6例。1295例入組孕婦全部行NIPT篩查提示陽性者共13例，后行侵入性產(chǎn)前診斷提示異常者9例，核型分析結(jié)果與NIPT結(jié)果均相吻合，經(jīng)遺產(chǎn)咨詢后孕婦均選擇引產(chǎn)，1例經(jīng)后期超聲提示結(jié)構(gòu)異常后引產(chǎn)(核型分析與NIPT相符)，3例選擇妊娠至分娩，隨訪至產(chǎn)后12周未見明顯異常(未進(jìn)行核型分析)，即共3例與NIPT篩查結(jié)果不符，計(jì)算誤診率為0.23%(3/1295)，余1282例NIPT提示陰性者繼續(xù)妊娠至產(chǎn)后，隨訪至產(chǎn)后12周表型未見明顯異常，暫未行染色體檢查，見表2及表3。

表2 1295例孕婦NIPT、產(chǎn)前診斷結(jié)果及妊娠結(jié)局

表3 NIPT對(duì)染色體數(shù)目異常篩查價(jià)值的評(píng)價(jià)

2.2 年齡對(duì)NIPT結(jié)果的影響(傳統(tǒng)產(chǎn)前篩查陽性組)NIPT后侵入性診斷率僅為1.39%(6/431)；(高齡組)NIPT后侵入性診斷率僅為0.90%(2/221)。選擇連續(xù)性修正，高齡組與適齡組的NIPT檢測(cè)陽性率(χ2=0,P=1)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即NIPT檢測(cè)應(yīng)用于不同預(yù)產(chǎn)年齡也可能取得同樣的篩查價(jià)值。見表4。

表4 高齡組(≥35歲)和適齡組(<35歲)對(duì)NIPT結(jié)果的影響

3 討論

產(chǎn)前篩查一般指的是對(duì)胎兒常見染色體非整倍體的篩查，即21-三體綜合征、18-三體綜合征、13-三體綜合征?？煞譃?類：(1)傳統(tǒng)產(chǎn)前篩查：妊娠早期(妊娠10～13+6周)和孕中期(妊娠15～20周)使用的母血清學(xué)篩查(maternal serum screening,MSS)，聯(lián)合或不聯(lián)合孕早期超聲檢查(妊娠14周以內(nèi))[5]。(2)以胎盤游離DNA(cell-free DNA,cfDNA)作為檢測(cè)指標(biāo)的產(chǎn)前篩查方法，即NIPT。染色體非整倍體的產(chǎn)前診斷可行核型分析，具有很高的準(zhǔn)確性，但依賴于侵入性手術(shù)，有感染、流產(chǎn)等風(fēng)險(xiǎn)[6-7]。

戚慶煒等[4]將SURUSS、FASTER以及BUN這幾個(gè)多中心大樣本前瞻性的關(guān)于孕婦血清學(xué)篩查早、中孕期的各種不同篩查模式效率的評(píng)價(jià)方面進(jìn)行研究匯總，研究結(jié)果顯示血清學(xué)篩查效能最理想的篩查模式是早中孕期序貫篩查模式。但這一篩查模式的缺陷在于中孕期回訪率不高，導(dǎo)致篩查無法完成，甚至喪失干預(yù)時(shí)機(jī)。我們的隊(duì)列研究顯示：NIPT檢測(cè)孕周為(17.45±1.66)周，圖2呈現(xiàn)了各孕周孕婦應(yīng)用NIPT情況，其中在妊娠16周(23.48%)、妊娠18周(21.85%)、妊娠17周(21.31%)、妊娠19周(12.82%)最多，而選擇在妊娠22、14、13、12周(共計(jì)2.00%)行NIPT的人數(shù)最少。圖3顯示了本研究中NIPT產(chǎn)前篩查指征占比分布，其中早中孕期血清學(xué)篩查陽性者為431位(33.28%)，單純高齡而要求篩查者211位(16.29%)，而單純要求直接NIPT篩查者653位(50.43%)，這表明NIPT在中孕期得到較廣泛的應(yīng)用，較多的孕婦在傳統(tǒng)產(chǎn)前篩查結(jié)果之后、即使未錯(cuò)過血清學(xué)篩查最佳時(shí)間或已可行侵入性產(chǎn)前診斷的孕周仍傾向選擇NIPT。這項(xiàng)研究也驗(yàn)證了無創(chuàng)的產(chǎn)前篩查技術(shù)在醫(yī)生和產(chǎn)婦中接受度和應(yīng)用量均處于高水平。結(jié)合近年來國(guó)外的相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)分析[8-11]，NIPT在篩查T21、T18和T13時(shí)具有較高的靈敏度和特異性，靈敏度值分別達(dá)94%～100%，87%～100%，和40%～100%，特異性值分別達(dá)99.9%、99.8%和99.9%。計(jì)算我們NIPT的靈敏度為100%、特異度為99.77%、誤診率為0.23%，漏診率為0%，PPV：76.92%，NPV：99.76%。NIPT不僅對(duì)常染色體異常具有較高的敏感性和特異性，而且對(duì)性染色體、其他染色體非整倍體異常和染色體亞微觀結(jié)構(gòu)(拷貝數(shù)變異，CNV)具有一定的臨床實(shí)用價(jià)值[12]。NIPT的非侵入性體現(xiàn)在于：本研究顯示(傳統(tǒng)產(chǎn)前篩查陽性組)NIPT后侵入性診斷率僅為1.39%(6/431)，(高齡組)NIPT后侵入性診斷率僅為0.90%(2/221)，因此NIPT的篩查價(jià)值和優(yōu)勢(shì)是值得肯定的。

隨著生育政策的開放，高齡作為獨(dú)立危險(xiǎn)因素而進(jìn)行產(chǎn)前篩查和診斷數(shù)量增加。2020年美國(guó)婦產(chǎn)科醫(yī)師學(xué)會(huì)提出：無論年齡或其他風(fēng)險(xiǎn)因素如何，均建議對(duì)所有孕婦進(jìn)行無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)[13]，在日本大于35歲孕婦因傳統(tǒng)產(chǎn)前篩查存在較高假陽性率，而選擇NIPT，確實(shí)明顯減少了侵入性診斷量[14]。我國(guó)具體分劃出其適用、慎用、禁用人群，明確將NIPT檢測(cè)技術(shù)作為介于血清學(xué)篩查和羊水穿刺染色體核型分析之間的二次篩查手段，作為常規(guī)產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷技術(shù)的有益補(bǔ)充[15]。使用NIPT前應(yīng)使患者能夠清楚地了解基于cffDNA的產(chǎn)前篩查的能力和局限性。我們?yōu)?3例NIPT檢測(cè)提示為陽性的孕婦提供了遺傳咨詢服務(wù)，其中有9例選擇了羊膜腔穿刺術(shù)取羊水細(xì)胞進(jìn)行核型分析，其產(chǎn)前診斷證明與NIPT結(jié)果相符合，其中21-三體2例，18-三體3例，13-三體1例，性染色體異常3例。終止妊娠后我們停止隨訪，但是提供相應(yīng)的遺傳咨詢。4例拒絕介入性診斷，要求繼續(xù)妊娠，定期產(chǎn)檢，1例因后期超聲提示結(jié)構(gòu)異常(心臟、泌尿系統(tǒng)結(jié)構(gòu)、側(cè)腦室增寬)，選擇引產(chǎn)，引產(chǎn)后仍進(jìn)行核型分析，要求明確胎兒畸形原因。3例因超聲未提示明顯異常選擇妊娠至分娩，我們隨訪至產(chǎn)后12周表型未見明顯異常，暫未行染色體檢查。她們檢測(cè)預(yù)產(chǎn)年齡為17～45歲(30.54±4.19)，我們將不同預(yù)產(chǎn)年齡孕婦分組發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用NIPT檢測(cè)的年齡段集中在26～35歲之間，約為77.76%(1007/1295)。在符合技術(shù)適用條件下高齡組(≥35歲)與適齡組(<35歲)的NIPT檢測(cè)陽性率(2=0，P=1)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，不可否定高齡組應(yīng)用NIPT也可能獲得與適齡組一樣的篩查價(jià)值。

綜上所述，NIPT廣泛用于檢測(cè)常見胎兒三體性和SCA，但檢測(cè)罕見染色體疾病綜合征的附加臨床價(jià)值仍然存在爭(zhēng)議。多項(xiàng)研究表明擴(kuò)展性NIPT(NIPT-PLUS)在NIPT基礎(chǔ)上檢測(cè)臨床顯著的微缺失和微重復(fù)有著高靈敏度和特異性[16-18]。從國(guó)際趨勢(shì)上看，35歲以下孕產(chǎn)婦行NIPT比例升高，意味著NIPT在低危妊娠中的使用有所增加。同時(shí)我國(guó)“三孩政策”的放開擴(kuò)大了產(chǎn)前篩查和診斷的使用范圍，基因診斷領(lǐng)域的巨大創(chuàng)新使孕婦能選擇更多的產(chǎn)前篩查方法。NIPT已在整個(gè)歐洲、澳大利亞和美國(guó)被廣泛采用，但只有少數(shù)國(guó)家/州制定了使用NIPT的國(guó)家政策且多為自費(fèi)，因此NIPT利用率的差異很大[19-20]。隨著獲取成本障礙的解決和分析循環(huán)cfDNA的技術(shù)和生物信息學(xué)算法進(jìn)步，NIPT在低風(fēng)險(xiǎn)人群中的利用可能會(huì)隨著時(shí)間的推移而繼續(xù)變化[21-23]。有研究表示[24-25]我國(guó)在倫理上不如西方背景復(fù)雜，因此出于醫(yī)療原因終止妊娠較常見，NIPT在遺傳咨詢指導(dǎo)時(shí)應(yīng)當(dāng)慎重解讀,由于技術(shù)問題、醫(yī)療成本、保險(xiǎn)等原因，NIPT仍然是篩查方式而不是診斷方式[26]。