李 培年文珠薛應(yīng)鈺陳軍宏張 揚黒雅婭

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護學(xué)院/甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實驗室,蘭州 730070)

美洲南瓜(Cucurbita pepo)屬于1 a生蔓性草本植物,栽培歷史悠久,原產(chǎn)于北美洲,中國最早于19世紀中期引進種植[1-2],目前是僅次于黃瓜的第二大瓜類蔬菜[3]。其營養(yǎng)豐富,味道鮮美,食用方法多樣,具有極高的食用和藥用價值,深受消費者的青睞。2018 年甘肅省南瓜種植面積約8.7×103hm2,武威市作為無殼美洲南瓜的優(yōu)勢產(chǎn)區(qū),常年種植面積大于2.7×103hm2[4],美洲南瓜已成為當(dāng)?shù)剞r(nóng)民增收致富的支柱產(chǎn)業(yè)。然而,隨著美洲南瓜種植面積的擴大和多年連作栽培,由尖孢鐮孢菌(Fusarium oxysporum)引起的枯萎病日趨嚴重,一般可導(dǎo)致減產(chǎn)20%～30%,嚴重時可達50%～60%,尤其是連作地塊可導(dǎo)致全田絕收[5]。防治枯萎病已成為當(dāng)?shù)孛乐弈瞎仙a(chǎn)中亟待解決的重要問題之一。

枯萎病是一種土傳病害,生產(chǎn)中主要采用化學(xué)措施防治,如用高錳酸鉀或多菌靈浸種,用多菌靈苗床消毒,用棉隆、異氰尿酸、含氯藥劑等處理土壤[6]。但是,長期大量使用化學(xué)農(nóng)藥容易造成污染環(huán)境、破壞生態(tài)、危害健康和病原菌產(chǎn)生抗藥性等一系列問題[7]。生物防治具有高效、安全和環(huán)境友好等特點且符合國家“減肥減藥”戰(zhàn)略和發(fā)展綠色農(nóng)業(yè)等的要求,其在植物病害防治中的應(yīng)用已成為目前研究的熱點[8]。目前,瓜類枯萎病的拮抗微生物中以細菌居多,尤其以芽孢桿菌應(yīng)用最為廣泛,趙佳等[9]報道解淀粉芽胞桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)Lh-1 對西瓜枯萎病的防治效果達78.5%。季倩茹等[10]研究表明,多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)B207、巨大芽孢桿菌(B.megaterium)B213 和枯草芽孢桿菌(B.subtilis)B204 單獨或組合施用后能有效抑制黃瓜枯萎病的發(fā)生,3種菌劑聯(lián)用處理后黃瓜枯萎病的發(fā)病率降低79.99%。另外,生防真菌在瓜類枯萎病的防治也有報道,Pu等[11]通過根際接種非致病性尖孢鐮孢菌CS-20,發(fā)現(xiàn)黃瓜枯萎病的病情指數(shù)降低18.83～61.67;劉佳等[12]研究表明,長枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)T6菌株對美洲南瓜枯萎病菌具有較強的抑制作用,抑菌率達60.09%。但是,應(yīng)用植物內(nèi)生真菌防治瓜類枯萎病的報道較少。植物內(nèi)生真菌是存在于健康植物的組織和器官內(nèi)部對寄主不形成明顯侵染的真菌[13],它與寄主植物之間存在著互惠互利的共生關(guān)系。據(jù)報道,目前已發(fā)現(xiàn)的內(nèi)生真菌中,大約有1/3對植物病原真菌具有較強的抑制活性[14]。因此,本研究以一株分離自美洲南瓜的內(nèi)生真菌N-1為試驗材料,測定其對美洲南瓜枯萎病的拮抗效果,通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)手段確定其分類地位并研究其生物學(xué)特性,以期為南瓜枯萎病的生物防治提供新的材料,也為內(nèi)生生防真菌的進一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 內(nèi)生真菌N-1菌株(分離自美洲南瓜根部)和美洲南瓜枯萎病菌尖孢鐮孢菌(F.ox ysporum)保存于與甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院植物病原學(xué)實驗室。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 供試7 種培養(yǎng)基,包括PDA、GA、Czapek、SYA、SDAY、LB和PA,按照方中達[15]植病研究法配置培養(yǎng)基,滅菌后常溫保存,備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株N-1對南瓜枯萎病菌的拮抗作用

菌株N-1活菌對美洲南瓜枯萎病菌的抑制作用:利用平板五點對峙培養(yǎng)法[16]測定菌株N-1對南瓜枯萎病菌的拮抗作用。分別培養(yǎng)菌株N-1 和南瓜枯萎病菌菌株5 d后,用5 mm 打孔器打取美洲南瓜枯萎病菌菌餅接到PDA 平板中央,菌株N-1接到枯萎病菌四周距離南瓜枯萎病菌15 mm 處,以接種PAD 菌餅為對照,用“十字交叉法”測量南瓜枯萎病菌菌落直徑,計算抑菌率。

抑菌率=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/處理菌落直徑×100%

菌株N-1 發(fā)酵液對美洲南瓜枯萎病菌菌落生長的影響:采用菌絲生長速率法[17]。菌株N-1在PDA 培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d后,接入到80 m L PDB液體培養(yǎng)基中,于28 ℃、180 r/min的搖床振蕩培養(yǎng)7 d,8 000 r/min離心15 min取上清液,將上清液通過孔徑為0.22μm 的細菌過濾器過濾得到無菌發(fā)酵液。將一定量無菌發(fā)酵液與冷卻至45 ℃左右的PDA 培養(yǎng)基充分混勻,使發(fā)酵液在培養(yǎng)基中稀釋終濃度分別為0、10、50和100倍,倒培養(yǎng)皿,每皿20 m L,待凝固后備用。用直徑5 mm 的無菌打孔器在培養(yǎng)7 d 的美洲南瓜枯萎病菌菌落邊緣打取菌餅。然后將菌餅置于含有發(fā)酵液的PDA 平板中央,以含無菌水的PDA 平板作為對照,每個處理重復(fù)3 次。28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d后,采用“十字交叉法”測量菌落生長量。按公式計算菌落生長抑制率。并用光學(xué)顯微鏡觀察枯萎病菌菌絲的變化,最后用Canon 100D 照相機和Nikon E200-2MV-U2生物顯微成像分析系統(tǒng)拍照。

菌株N-1 發(fā)酵液對美洲南瓜枯萎病菌分生孢子萌發(fā)的影響:用PDB稀釋菌株N-1發(fā)酵液使其終濃度分別為0、10、50 和100 倍,分別吸取1 m L發(fā)酵液于無菌凹玻片中,然后吸取100μL預(yù)先制備好的美洲南瓜枯萎病菌分生孢子懸浮液(濃度為1×108個/m L)分別加入到盛有不同稀釋倍數(shù)發(fā)酵液的凹玻片中,28 ℃恒溫培養(yǎng)8 h后,在光學(xué)顯微鏡下觀察分生孢子的萌發(fā)情況,共觀察5個視野,每個視野觀察20個孢子,統(tǒng)計萌發(fā)孢子數(shù)。以無菌水作為對照,每個處理重復(fù)3次,按如下公式計算孢子萌發(fā)抑制率:

孢子萌發(fā)抑制率=(對照孢子萌發(fā)數(shù)-處理孢子萌發(fā)數(shù))/對照孢子萌發(fā)數(shù)×100%

菌株N-1 發(fā)酵液對美洲南瓜枯萎病的盆栽防效測定:選取健康飽滿的美洲南瓜種子,品種為‘光板’(由甘肅武威金蘋果公司提供),先用75%酒精消毒3 min后,接著用無菌水沖洗干凈,擺放于鋪有無菌濾紙的培養(yǎng)皿中,將培養(yǎng)皿置于25 ℃、12 h光照、12 h黑暗的培養(yǎng)箱中催芽,培養(yǎng)7 d后選取出芽一致的種子播種于裝有滅菌營養(yǎng)土的花盆中。待長至4～5葉期時,選取長勢一致的美洲南瓜幼苗從花盆中挖出,沖洗根部并用無菌濾紙吸干多余水分,然后用無菌剪刀將須根剪掉2 mm,將根部有傷口的幼苗植株根部浸泡在預(yù)先配置好的美洲南瓜枯萎病菌分生孢子懸浮液中30 min,將美洲南瓜幼苗重新栽入花盆中,3 d后灌入配置好的菌株N-1發(fā)酵液原液100 m L,以灌入等量的無菌水作為對照,培養(yǎng)1周后觀察發(fā)病情況并計算發(fā)病率和病情指數(shù)[18]。病情分級標準參照南宇航等[19]的方法進行。每個處理20株,重復(fù)3次。

發(fā)病率=發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)×100%

4）日作業(yè)暴露面：根據(jù)該設(shè)備設(shè)計參數(shù)，一次性堆高5m，每日暴露面可以控制在40m×10m×5 m或20 m×20 m×5 m，減少控制晚間噴藥除臭的成本。

病情指數(shù)=Σ(各級病株數(shù)×各級代表值)/(調(diào)查總株數(shù)×最高級代表值)×100

1.2.2 菌株N-1的鑒定 形態(tài)學(xué)觀察:將菌株N-1在28 ℃黑暗下培養(yǎng)5 d,“十字交叉法”測定菌落的生長直徑,描述菌落形態(tài)、菌落正反面顏色和氣味等。挑取28 ℃黑暗培養(yǎng)5 d的PDA 平板上的菌落,進行顯微觀察產(chǎn)孢情況、孢子的大小以及菌絲形態(tài)。

分子生物學(xué)鑒定:從形態(tài)學(xué)鑒定所用的活化菌株上刮取適量菌絲體,進行分子學(xué)鑒定,由北京擎科生物科技有限公司西安分公司利用真菌基因組DNA 提取試劑盒提取菌株N-1的基 因 組 總DNA,采 用 真 菌 通 用 引 物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)PCR 擴增菌株N-1的ITS r DNA 并進行序列測定。將菌株N-1 ITS r DNA 拼接序列的測定結(jié)果用BLAST 工具在GenBank 數(shù)據(jù)庫中進行同源序列對比,利用BLAST 的結(jié)果,通過MEGA 7.0軟件構(gòu)建菌株N-1的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 菌株N-1 生物學(xué)特性 p H 對菌株N-1生長及產(chǎn)孢的影響:配置PH 分別為4、5、6、7、8、9和10的PDA 培養(yǎng)基,將5 mm 菌株N-1菌餅接種于培養(yǎng)基中,每個處理5個重復(fù),28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d,記錄數(shù)據(jù)并計算菌株生長速率及產(chǎn)孢量[20]。

不同培養(yǎng)基對菌株N-1生長及產(chǎn)孢的影響:將在PDA 培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d的菌株N-1打成5 mm菌餅,接種在6 種培養(yǎng)基平板中央:PDA、SYA、Czapek、GA、SDAY 和LB,28 ℃培養(yǎng)5 d,每個處理5次重復(fù),“十字交叉法”測量菌落直徑,記錄數(shù)據(jù)并計算生長速率。利用直徑為5 mm 打孔器在菌落中央至邊緣1/2處打取菌餅,挑取菌餅于50 m L離心管內(nèi),加入10 m L 0.05%吐溫-80無菌水,振蕩充分后用血球計數(shù)板計數(shù),計算產(chǎn)孢量。

氮碳源對菌株N-1 生長及產(chǎn)孢的影響:以2%葡萄糖作為碳源,分別添加2%(質(zhì)量體積比)尿素、硝酸鉀、酪氨酸和硝酸鈉,28 ℃培養(yǎng)5 d,測定氮源對菌株N-1生長及產(chǎn)孢的影響。

將PA 培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,分別添加2%(質(zhì)量體積比)葡萄糖、蔗糖、淀粉、甘露糖、果糖、肌醇和木糖,配置成7種培養(yǎng)基,分別對菌株N-1進行打孔、接種并測量。

溫度對菌株N-1生長及產(chǎn)孢的影響:將菌株N-1接在PDA 培養(yǎng)基上,分別置于25、28、30、35和40℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d,每個處理5個重復(fù),記錄數(shù)據(jù)并計算菌株生長速率及產(chǎn)孢量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析

試驗數(shù)據(jù)的整理及圖表的制作采用Excel 2010和Origin 2018,數(shù)據(jù)的處理及顯著性分析采用SPSS 24.0單因素方差分析(Duncan’s新復(fù)極差法)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株N-1活菌對南瓜枯萎病菌的拮抗作用

通過五點對峙法將菌株N-1 和美洲南瓜枯萎病菌在PDA 平板上對峙培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),菌株N-1對美洲南瓜枯萎病菌的生長具有明顯的抑制作用,抑菌率為75.93%。

2.2 菌株N-1發(fā)酵液對南瓜枯萎病菌菌落生長的影響

由表1可知,菌株N-1不同稀釋倍數(shù)的發(fā)酵液對美洲南瓜枯萎病菌菌落生長均有一定的抑制作用,而且隨著發(fā)酵液稀釋倍數(shù)的增加,其對美洲南瓜枯萎病菌的抑菌率呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢。其中發(fā)酵液原液的抑制效果最好,培養(yǎng)5 d的菌落直徑為11.31 mm,抑制率最大,達70.94%,100倍發(fā)酵液對美洲南瓜枯萎病菌的抑制效果最差,菌落直徑為55.14 mm,抑制率僅為24%。顯微觀察發(fā)現(xiàn),菌株N-1對美洲南瓜枯萎病菌的生長具有顯著影響。與對照正常生長的美洲南瓜枯萎病菌菌絲(圖1-A)相比,受菌株N-1抑制的枯萎病菌菌絲(圖1-B、1-C)出現(xiàn)原生質(zhì)濃縮,扭曲變形,分支增多,節(jié)間縮短,部分斷裂等現(xiàn)象。

圖1 與菌株N-1對峙培養(yǎng)中美洲南瓜枯萎病菌菌絲形態(tài)Fig.1 Inhibition effect of strain N-1 on mycelia morphology of F.oxysporum

表1 菌株N-1對美洲南瓜枯萎病菌的抑制率Table 1 Inhibition rate of strain N-1 on F.oxysporum

2.3 菌株N-1發(fā)酵液對美洲南瓜枯萎病菌分生孢子萌發(fā)的影響

結(jié)果表明,菌株N-1不同稀釋倍數(shù)的發(fā)酵液均能夠?qū)γ乐弈瞎峡菸【稚咦用劝l(fā)產(chǎn)生抑制作用,而且隨著稀釋倍數(shù)的增大,菌株N-1 發(fā)酵液對分生孢子萌發(fā)的抑制率逐漸降低。原液(稀釋倍數(shù)為0)的抑制率最大,為82.87%;100倍發(fā)酵液的抑制率最低,僅為31.38%(圖2)。

圖2 菌株N-1發(fā)酵液處理后美洲南瓜枯萎病菌分生孢子萌發(fā)情況Fig.2 Inhibition effect of strain N-1 fermentation liquid on spore germination of F.oxysporum

2.4 菌株N-1發(fā)酵液對美洲南瓜枯萎病的盆栽防效

盆栽防效結(jié)果表明,菌株N-1發(fā)酵液對美洲南瓜枯萎病具有明顯的防治效果,經(jīng)灌根處理7 d后,美洲南瓜枯萎病的發(fā)病率和病情指數(shù)分別為21.67% 和19.38,顯著低于對照的發(fā)病率(85.00%)和病情指數(shù)(82.17),其防效達76.41%(表2)。

表2 菌株N-1發(fā)酵液對美洲南瓜枯萎病的盆栽防效Table 2 Control effect of fermentation broth of strain N-1 on Fusarium wilt of Cucurbita pepo in potted experiment

2.5 菌株N-1的鑒定

該菌株在培養(yǎng)基于28 ℃培養(yǎng)5 d后,菌落灰綠色,直徑57～64 mm,菌落質(zhì)地絲絨狀。分生孢子梗莖壁光滑;頂囊燒瓶狀,直徑26.1～30.4 μm,直立于胞梗莖上;瓶梗單層,大小(11.3～13.9μm)×(16.5～19.1μm);瓶梗排列緊密,形成柱形的分生孢子頭;分生孢子綠色,球形,直徑4.2～4.6μm(圖3),初步鑒定為曲霉屬(Aspergillussp.)。將菌株N-1 ITS r DNA 拼接序列的測定結(jié)果用BLAST 工具在GenBank 數(shù)據(jù)庫中進行同源序列對比,構(gòu)建N-J系統(tǒng)進化樹(圖4),菌株N-1與菌株Aspergillus fumigatus(KT229360.1)序列的相似度達到100%,結(jié)合形態(tài)學(xué)特征將菌株N-1鑒定為煙曲霉(Aspergillus fumigatus)。

圖3 菌株N-1在PDA培養(yǎng)基生長5 d的形態(tài)Fig.3 Morphological characteristics of strain N-1 on PDA medium for 5 days

圖4 N-1菌株的系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain N-1

2.6 菌株N-1的生物學(xué)特性

2.6.1 不同p H 對菌株N-1生長及產(chǎn)孢的影響不同p H 對菌株N-1 生長及產(chǎn)孢有顯著影響(圖5)。該菌在p H 為7時菌絲生長和產(chǎn)孢量最佳,5 d的菌落直徑為7.36 cm,產(chǎn)孢量為2.32×107個/m L,p H=8 時次之,5 d 的菌落直徑為6.37 cm,產(chǎn)孢量為2.07×107個/m L,p H 為4時最差,5 d 的菌落直徑為2.53 cm,產(chǎn)孢量為1.33×106個/m L。

圖5 不同p H 下菌株N-1 生長與產(chǎn)孢Fig.5 Growth rate and spore production of strain N-1 on different p H

2.6.2 不同培養(yǎng)基對菌株N-1生長及產(chǎn)孢的影響 不同培養(yǎng)基對菌株N-1生長及產(chǎn)孢均有顯著影響(圖6),在大多數(shù)培養(yǎng)基上生長良好,在SDAY 培養(yǎng)基上生長最快,5 d 的菌落直徑為7.17 cm,產(chǎn)孢量為2.73×107個/m L,PDA 培養(yǎng)基次之,5 d 的菌落直徑為7.36 cm,產(chǎn)孢量為2.32×107個/m L,GA 培養(yǎng)基生長最慢,5 d的菌落直徑為4.33 cm,產(chǎn)孢量為8.16×106個/m L。

圖6 不同培養(yǎng)基下菌株N-1的生長與產(chǎn)孢Fig.6 Growth rate and spore production of strain N-1 on different media

2.6.3 不同氮源對菌株N-1生長及產(chǎn)孢的影響

試驗表明,菌株N-1在含酪氨酸的培養(yǎng)基上生長最佳,5 d 的菌落直徑為2.87 cm,產(chǎn)孢量為6.83×106個/m L,在含尿素的培養(yǎng)基上不生長(圖7)。

圖7 不同氮源下菌株N-1的生長與產(chǎn)孢Fig.7 Growth rate and spore production of strain N-1 on different nitrogen sources

2.6.4 不同碳源對菌株N-1生長及產(chǎn)孢的影響

研究結(jié)果表明,不同碳源對菌株N-1的生長有顯著影響(圖8)。在含葡萄糖的培養(yǎng)基上生長最好,5 d的菌落直徑為7.07 cm,產(chǎn)孢量為2.32×107個/m L,含甘露醇的培養(yǎng)基上生長最差,5 d的菌落直徑為2.77 cm,產(chǎn)孢量為3.67×106個/m L。

圖8 不同碳源下N-1菌株的生長與產(chǎn)孢Fig.8 Growth rate and spore production of strain N-1 on different carbon sources

2.6.5 不同溫度對菌株N-1生長及產(chǎn)孢的影響菌株N-1的生長及產(chǎn)胞在不同溫度下存在顯著差異,其生長趨勢隨溫度的變化基本一致(圖9),在30～35 ℃時生長較為適宜,最適溫度為35 ℃,5 d 的菌落直徑為7.43 cm,產(chǎn)孢量為2.48×107個/m L。

圖9 不同溫度下菌株N-1的生長與產(chǎn)孢Fig.9 Growth rate and spore production of strain N-1 on different temperatures

3 結(jié)論與討論

枯萎病是為害美洲南瓜產(chǎn)業(yè)的第一大土傳性病害,利用功能微生物控制該病害被認為是有效的途徑之一。大量研究表明,植物內(nèi)生真菌在促進植物生長、抗逆和抗病等方面發(fā)揮著重要的作用,尤其是對多種植物病原真菌具有專一拮抗或廣譜抗性[21-23]。本研究將一株分離自美洲南瓜根部的內(nèi)生真菌N-1菌株通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法鑒定為煙曲霉(Aspergillus fumigatus)。關(guān)于煙曲霉應(yīng)用于植物病害的防治已有報道,周曉見等[24]報道對煙草青枯病菌(Ralstonia solanacearum)具有穩(wěn)定的拮抗作用的煙曲霉3F30菌株,其抑菌圈為10.0 mm;彭閣等[16]從煙草黑脛病發(fā)病植株根際土壤中分離篩選出1株煙曲霉GZ-3菌株,對煙草黑脛病菌(Phytophthora nicotianae)有明顯抑制作用,其對煙草黑脛病田間防治效果為61.82%。本研究表明,煙曲霉N-1菌株對美洲南瓜枯萎病菌菌落生長的抑制率為70.94%,分生孢子萌發(fā)抑制率達82.87%,室內(nèi)盆栽相對防效達76.41%,優(yōu)于劉佳等[12]報道的長枝木霉T6 菌株對美洲南瓜枯萎病的防效(69.06%),說明煙曲霉可作為美洲南瓜枯萎病防治的一個新的菌種資源,在防治美洲南瓜真菌病害方面具有潛在的應(yīng)用價值。

研究生防菌的培養(yǎng)條件可以為進一步提高菌體的生長量、抗菌活性物質(zhì)的產(chǎn)量及生防效果奠定基礎(chǔ)[25]。本研究結(jié)果表明,碳源、氮源、溫度和p H 等因素對煙曲霉N-1 菌株的生長有較大影響,最佳生長培養(yǎng)基為SDAY 培養(yǎng)基,生長的最適溫度為35 ℃;在p H 為4～10條件下菌落均可生長,以p H 為7時最適生長;可以利用的最佳碳源和氮源分別為葡萄糖和酪氨酸,這為煙曲霉N-1菌株的進一步開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

另外,由于生防菌應(yīng)用于田間受到多種因素的影響,因此,需要在不同條件下進行系統(tǒng)化地田間試驗。同時,深入開展N-1菌株抗菌活性次生代謝產(chǎn)物、在土壤中的定殖能力及其防病機理,進一步驗證該菌株的實際生防效果。