何文廣 郭海坤 朱晟 劉小梨

肝細(xì)胞癌是我國(guó)常見(jiàn)的一類惡性腫瘤，具有發(fā)病隱匿、治療手段少及預(yù)后差等特點(diǎn)［1］。目前，手術(shù)是治療HCC 最常見(jiàn)的治療手段，但術(shù)后生存形勢(shì)依然較為嚴(yán)重［2］。因此，進(jìn)一步探索闡明HC發(fā)生及進(jìn)展的分子機(jī)制顯得極為迫切。近年來(lái)，circRNA 參與參與多種腫瘤發(fā)生、侵襲和遷移等惡性生物學(xué)行為［3-4］。本課題組前期通過(guò)高通量測(cè)序檢測(cè)HCC 患者病理組織異常表達(dá)的circRNA，發(fā)現(xiàn)其中一種circ_RNA_PCAC1 在HCC 患者表達(dá)升高，查閱文獻(xiàn)未見(jiàn)其在HCC 中的報(bào)道。基于此，因此，本研究檢測(cè)circ_RNA_PCAC1在肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)，并進(jìn)一步探討其對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，為闡明其在肝癌中的作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料人肝癌細(xì)胞系Li?7、HepG2、Hep3B 及人正常肝細(xì)胞系HL?7702 購(gòu)自美國(guó)ATCC 細(xì)胞庫(kù)，胎牛血清，DMEM 培養(yǎng)基（Gibco，USA），Trizol 試劑（美國(guó)Invitrogen 公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒購(gòu)自（日本Takara 公司），引物（生工生物工程科技（上海）有限公司）；CCK?8 試劑（碧云天公司），Transwell小室及基質(zhì)膠（Corning 公司）。circ_RNA_PCAC1沉默慢病毒（siRNA）及相應(yīng)的陰性對(duì)照組慢病毒（NC）（上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)肝癌細(xì)胞系及正常肝細(xì)胞系用含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合達(dá)到80%以上時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化，并進(jìn)行傳代。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)circ_RNA_PCAC1 mRNA 的表達(dá)水平應(yīng)用Trizol 法提取細(xì)胞總RNA，分光光度計(jì)測(cè)量總RNA 濃度及純度，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書將1 μg RNA 按逆轉(zhuǎn)錄為合成cDNA，隨后進(jìn)行qRT?PCR。內(nèi)參GAPDH 的引物序列為：F：5′?ACA GTC AGC CGC ATC TTC TT?3′；R：5′?GACAAGCTTCCCGTTCTCAG?3′。circ_RNA_PCAC1 引 物 序 列 為：F：5′?GAGGGTTCTGCT?GTCCTGT；R：5′?GATAGACGCGTGCACCAC?3′，PCR 反應(yīng)程序：95 ℃，5 min 預(yù)變性；95 ℃30 s 變性，60℃，30 s 退火；72 ℃，30 s 延伸。PCR 反應(yīng)體系為10 μL ：2×SYBR Green Master（ROX），上下游引物各0.3 μL，cDNA 模板1 μL，RNase Free dH2O補(bǔ)至10 μL，以GAPDH 為內(nèi)參，使用2-△△Ct法分析目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 circ_RNA_PCAC1 敲低的肝癌細(xì)胞模型胰酶消化細(xì)胞接種至6孔板，感染前6 h 更換培養(yǎng)基，慢病毒稀釋后與增強(qiáng)感染液混合。參照感染說(shuō)明書分別將circ_RNA_PCAC1沉默慢病毒及相應(yīng)陰性對(duì)照組慢病毒感染HepG2細(xì)胞，分別設(shè)為siRNA 組和NC 組，6 h 后替換常規(guī)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。感染72 h后，更換含2 μg/mL嘌呤霉素的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)14 d，然后用qRT?PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)感染效率。

1.5 CCK?8 檢測(cè)肝癌細(xì)胞增殖能力用胰酶消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的感染細(xì)胞，按5×103個(gè)/孔接種于96 孔板中，每組重復(fù)5 次。分別于培養(yǎng)0 h、24 h、48 h、72 h 時(shí)加入CCK?8 試劑10 μL，繼續(xù)孵育2 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)，以450 nm 波長(zhǎng)處的光密度（OD）值代表增殖活力。

1.6 平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)增殖能力用胰酶消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的感染細(xì)胞，加入完全培養(yǎng)液5 ml終止消化，1 000 rpm，4℃離心5 min，棄上清；加入3 mL 完全培養(yǎng)液，以200 細(xì)胞/孔的密度接種至6孔板，培養(yǎng)至細(xì)胞集落形成。4% 多聚甲醛固定20 min，PBS 清洗3 次，1% 結(jié)晶紫染色20 min，拍照記錄細(xì)胞集落形成情況，計(jì)算細(xì)胞克隆形成數(shù)。

1.7 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)遷移能力用胰酶消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的感染細(xì)胞，然后將細(xì)胞按5×103個(gè)/孔接種于接種于6 孔板，將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞的融合達(dá)到90%，用10 μL 的無(wú)菌槍頭劃板，棄去原培養(yǎng)基，用PBS 輕輕清洗3 次。分別于劃痕后0 h、48 h 時(shí)取樣，同時(shí)利用Image J軟件測(cè)量遷移距離。

1.8 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力用胰酶消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的感染細(xì)胞，200 μL 肝癌細(xì)胞（含1×105 個(gè)細(xì)胞）接種至Transwell 小室的上室，用500 μL 含10%胎牛血清置于下室，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育48 h，4%多聚甲醛固定20 min，蘇木素染色30 min，隨機(jī)選取不同的5 個(gè)視野在光學(xué)顯微鏡下拍照并計(jì)數(shù)，最后取均值作為細(xì)胞侵襲數(shù)。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較單因素方差分析（One?Way ANOVA），以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 circ_RNA_PCAC1在肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞 中 的 表 達(dá)qRT ? PCR 檢 測(cè) 結(jié) 果 顯 示：circ_RNA_PCAC1 在人肝癌細(xì)胞系Li?7、HepG2、Hep3B 中的表達(dá)量明顯高于HL?7702 細(xì)胞系（P<0.05），詳見(jiàn)圖1。

圖1 circ_RNA_PCAC1 在肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞中的表達(dá)

2.2 circ_RNA_PCAC1 在肝癌細(xì)胞系中的沉默效 果 用qRT ? PCR 法 檢 測(cè) siRNA 組 的circ_RNA_PCAC1 表達(dá)水平明顯低于NC 組（P<0.05），表明成功建立沉默circ_RNA_PCAC1 的HepG2 細(xì)胞株。詳見(jiàn)圖2。

圖2 circ_RNA_PCAC1 在肝癌細(xì)胞系中的沉默效果

2.3 干擾circ_RNA_PCAC1 表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞HepG2 的增殖通過(guò)CCK?8 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾circ_RNA_PCAC1 后HepG2 細(xì)胞的生長(zhǎng)變化，結(jié)果顯示，與NC 組細(xì)胞相比，siRNA 組HepG2 細(xì)胞明顯抑制生長(zhǎng)，平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示siR?NA 后細(xì)胞形成的克隆數(shù)目明顯減少（P<0.05）。詳見(jiàn)圖3。

圖3 干擾circ_RNA_PCAC1 表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2 增殖的影響

2.4 干擾circ_RNA_PCAC1 表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞HepG2 的遷移細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：48 h 時(shí)，siRNA 組細(xì)胞遷移數(shù)目均較NC 組少（均P<0.05），見(jiàn)圖4。

圖4 干擾circ_RNA_PCAC1 表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞HepG2的遷移

2.5 干擾circ_RNA_PCAC1表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞HepG2 的侵襲Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，siRNA組細(xì)胞侵襲和遷移數(shù)目均較NC 組少（均P<0.05）。詳見(jiàn)圖5。

圖5 干擾circ_RNA_PCAC1 表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞HepG2的侵襲

3 討 論

高轉(zhuǎn)移和高侵襲性是造成肝癌患者死亡的重要因素［5］。因此，闡明肝癌進(jìn)展機(jī)制，仍是肝癌研究的重要內(nèi)容。目前多項(xiàng)研究證明環(huán)狀RNA 異常表達(dá)可以促進(jìn)或抑制肝癌的發(fā)生與進(jìn)展。可望成為潛在的腫瘤診療標(biāo)志物，具有巨大的應(yīng)用前景。

circ_RNA_PCAC1 是一個(gè)新近發(fā)現(xiàn)的cir?cRNA，國(guó)內(nèi)李玉婷等［6］受研究首次發(fā)現(xiàn)circRNA?PCAC1 在胰腺導(dǎo)管腺癌中高表達(dá)并促進(jìn)胰腺導(dǎo)管腺癌侵襲轉(zhuǎn)移，然而到目前為止，circ_RNA_PCAC1在肝癌中的表達(dá)方式和生物學(xué)功能尚不清楚。基于本課題組前期對(duì)HCC 組織的測(cè)序的結(jié)果，本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)circ_RNA_PCAC1 在肝癌中表達(dá)明顯高于旁癌組織。但其是否對(duì)肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為并未研究。本研究首先檢測(cè)了肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞中 circ_RNA_PCAC1 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)circ_RNA_PCAC1 在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)均高于正常肝細(xì)胞。因此，推測(cè)circ_RNA_PCAC1 在肝癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。為了進(jìn)一步明確circ_RNA_PCAC1 在肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移中的作用，本研究建立沉默circ_RNA_PCAC1的HepG2細(xì)胞模型，通過(guò)細(xì)胞體外CCK?8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、劃痕愈合實(shí)驗(yàn)以及Tran?swell 小室實(shí)驗(yàn)全面驗(yàn)證其對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和侵襲等行為的影響，各項(xiàng)結(jié)果顯示，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默circ_RNA_PCAC1 可以顯著抑制肝癌細(xì)胞在體外的增殖、遷移及侵襲能力，因此，本研究利用體外實(shí)驗(yàn)首次證明了circ_RNA_PCAC1在肝細(xì)胞癌中的促癌作用。今后將通過(guò)生物信息學(xué)手段和雙熒光素酶等技術(shù)手段探索circ_RNA_PCAC1的下游調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

綜上所述，circ_RNA_PCAC1 在肝癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，沉默circ_RNA_PCAC1 可以明顯制肝癌細(xì)胞增殖，遷移和侵襲，今后還需深入研究circ_RNA_PCAC 在肝癌發(fā)生發(fā)展中的確切分子機(jī)制。