戰(zhàn)楚婷 張境豐 陳夢池 劉江華

燈盞細辛，為菊科植物短葶飛蓬的干燥全草，主要分布在我國云貴高原。燈盞花素（Breviscapine，BVP）是燈盞細辛主要成分之一，屬于黃酮類化合物，臨床上主要用于治療心腦血管系統(tǒng)［1］等疾病。胰腺癌（Pancreatic cancer，PC）惡性程度高，5年生存率極低，其診斷與治療一直是難點［2］。研究證實，BVP 有關(guān)抗腫瘤中作用，例如在胃癌中通過調(diào)控PTEN/PI3K 通路抑制上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化［3］，在非小細胞肺癌［4］中改善耐藥。而BVP 在PC 中鮮有研究。本研究利用網(wǎng)絡藥理學結(jié)合實驗的模式，探討治療PC 的潛在靶點和初步機制，為中醫(yī)藥防治PC 提供理論和實踐基礎。

1 臨床資料

1.1 靶點篩選、藥物-作用靶點-通路網(wǎng)絡的構(gòu)建和富集分析通過SwissTargetPrediction 等數(shù)據(jù)庫獲得BVP 靶點；利用Gencard 等數(shù)據(jù)庫獲得PC 相關(guān)靶點。將相關(guān)靶點導入Cytoscpe3.7.2 構(gòu)建藥物-靶點-通路圖（見圖3）。將圖2 中得到的靶點導入STRING（https：//string?db.org/）數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用（protein?protein interaction，PPI）網(wǎng)絡；使用Metascape（https：//Metascape.ncifcrf.gov/）對共同靶點進行對共同靶點進行基因本體（Gene Ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes.，KEGG）富集分析。

1.2 細胞培養(yǎng)人胰腺癌BXPC?3 細胞培養(yǎng)在溫度：37℃，5%CO2，用10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液的RIPM?1640 培養(yǎng)，正常培養(yǎng)細胞為對照組；而相同條件下用BVP 濃度為800 μmol/L 干預BXPC?3 細胞為實驗組。

1.3 透射電鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu)收集培養(yǎng)48小時對數(shù)生長期對照組與實驗組細胞，經(jīng)入固定液4℃固定過夜，用1%的鋨酸4℃下固定2 h，磷酸緩沖液PBS（PH7.4）漂洗3 次，經(jīng)梯度脫水、滲透、包埋、切片、染色，最后置于電鏡觀察，采集圖像下并分析。

1.4 流式細胞術(shù)檢測凋亡收集培養(yǎng)48 小時對數(shù)生長期對照組與實驗組細胞，各約5*105個/管。根據(jù)試劑盒說明書染色，孵育30 min。過濾后，上機檢測。

1.5 WB 檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達取培養(yǎng)48小時對數(shù)生長期對照組與實驗組細胞六孔板細胞，棄上清，PBS 洗滌，加入裂解液置于冰上，30 min后，超聲、離心留上清、BCA 法檢測濃度。經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗、二抗孵育，收集圖像信息。

1.6 統(tǒng)計學分析采用SPSS 26.0 進行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的連續(xù)數(shù)值型變量用（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 BVP的化學結(jié)構(gòu)式 見圖1。

圖1 BVP 化學結(jié)構(gòu)式（3D）

2.2 BVP靶點和PC 靶點 共獲得49 個BVP 作用基因靶點，4146 個PC 相關(guān)基因靶點信，利用veny 網(wǎng)站對共同靶點取交集后得到共同靶點30個，見圖2。

圖2 BVP 抗PC 韋恩圖

2.3 構(gòu)建藥物-靶點-通路圖及PPI蛋白作用網(wǎng)絡 使用Cytoscape 3.7.2 構(gòu)建藥物-靶點-通路網(wǎng)絡，見圖3；對“2.2”中得到的靶點構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡（見圖4）。

圖3 BVP-靶點-通路圖

圖4 蛋白相互作用網(wǎng)絡圖

2.4 共同靶點的富集分析本使用METASCAPE對靶點進行GO 富集分析和KEGG 通路富集分析，GO 富集分析使用氣泡圖進行可視化（圖5），KEGG通路富集分析使用柱狀圖進行可視化（圖6）。

圖5 共同靶點GO 富集分析

圖6 共同靶點KEGG 通路富集分析

2.5 透射電鏡觀察結(jié)果電鏡下對照組細胞形態(tài)規(guī)則，細胞膜完整，細胞核較大、核膜完整、核仁清晰，線粒體結(jié)構(gòu)清晰。實驗組組細胞排列松散，細胞膜表面微絨毛消失，細胞核呈畸形改變，線粒體嚴重腫脹、嵴減少，可見的凋亡小體。（見圖7）

圖7 藥物處理后BXPC-3 的超微結(jié)構(gòu)（注：A 對照組，B 實驗組）

2.6 流式細胞術(shù)細胞凋亡分析結(jié)果示對照組和實驗組BXPC?3 細胞凋亡比率分別為（2.47±0.23）%、（58.81.84±10.01）% ；兩組相比，有顯著差異（P<0.05）。（見圖8）。

圖8 BVP 作用BXPC?3 細胞凋亡情況（圖8a 對照組凋亡；圖8b 實驗組凋亡）

2.7 WB檢測凋亡相關(guān)蛋白 與對照組相比，經(jīng)BVP 處理48 h 后實驗組BXPC?3 細胞抗凋亡蛋白Bcl?2 顯著降低，TNF?α 表達顯著升高，均有差異（P<0.05）（見圖9）。

圖9 Bcl?2、TNF?α 蛋白表達

3 討 論

PC 惡性程度高，5 年生存率極低［5］。目前早期PC 治療以手術(shù)為主，但多數(shù)患者被確診時已喪失手術(shù)機會或治療效果不佳［7］。有研究顯示中草藥在PC 治療中發(fā)揮著延長患者中位生存時間等優(yōu)勢［8］。

BVP 是一種天然黃酮類化合物。研究顯示BVP 具有抗癌作用［9-11］。本研究共篩選出BVP 的共同靶點30 個；通過GO 富集分析共同基因靶點在生物學過程、細胞組分和分子功能這三個方面富集的條目分別是14、6、7，可能參與免疫反應、凋亡過程、蛋白質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、酶的結(jié)合等多個方面；KEGG 通路富集分析顯示共同靶點富集在6 個KEGG 信號通路，包括癌癥通路、PI3K?AKT、HIF?1、MAPK、NF?κB、P53 等信號通路，其中PI3K?AKT 通路表現(xiàn)出較高程度的富集，表明BVP 在抗PC 中起著重要作用。有研究提示PI3K?AKT 的異常激活狀態(tài)，會導致腫瘤更易發(fā)生侵襲和凋亡［15-16］。

研究顯示PI3K?AKT 通路的異常激活與PC 發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，沉默該通路的下游基因Girdin可降低p?AKT 和p?PI3K 水平，增加PC 細胞凋亡并誘導細胞周期停滯［17］。PI3K?AKT 通路異常也被證實與PC 患者總生存期較差有關(guān)［19］。越來越多的證據(jù)顯示，PI3K?AKT 通路參與調(diào)控細胞周期和凋亡［20］。本研究關(guān)注BVP 是否對PC 發(fā)揮抗腫瘤效應，基于網(wǎng)絡藥理學基礎進一步驗證：首先電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，給藥后細胞體積變小，細胞膜微絨毛消失，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等細胞器均發(fā)生改變，可見凋亡小體。應用流式細胞術(shù)結(jié)果顯示BVP 干預后，可明顯誘導凋亡。最后又通過WB 發(fā)現(xiàn)BVP處理后能夠下調(diào)BXPC?3 細胞抗凋亡蛋白Bcl?2 表達。目前已證實：PI3K/AKT 信號傳導通路可調(diào)控Bcl?2 家族；AKT 磷酸化Bad ，引起B(yǎng)ad 與14?3?3 蛋白結(jié)合，阻止其與抗凋亡蛋白Bcl?2 和Bcl?XL 的相互作用，發(fā)揮促進凋亡作用［20］；也有研究證實：體外條件下TNF?α 能夠誘導胃癌細胞［21］的凋亡，在本研究中BVP 處理后BXPC?3 細胞發(fā)生凋亡，同時TNF?α 表達上調(diào)，二者之間可能存在某種聯(lián)系，需進一步驗證。綜合以上，提示BVP 可能是通過抑制PI3K?AKT 信號通路發(fā)揮抗腫瘤效應。

總之，本研究從網(wǎng)絡藥理學和體外實驗的角度，篩選BVP 治療PC 的相關(guān)靶點及信號通路。已初步闡明了BVP 的關(guān)鍵靶點，推測BVP 可能通過調(diào)控PI3K?AKT 通路發(fā)揮抗腫瘤效應，下一步研究中將對體內(nèi)實驗加以驗證，為BVP 治療PC 提供更多可靠的理論依據(jù)。