羅媛 肖川 林偉杰

阿爾茲海默癥（Alzheimer's disease，AD）是一種常見于65 歲以上老年人的神經(jīng)退行性疾病。其主要的特征是認知功能在多個領(lǐng)域呈現(xiàn)出漸進性損傷，包括記憶、語言、情感、行動能力等，并伴隨有淡漠、行為缺陷。中國已逐漸步入老齡化社會，預(yù)計到2050 年我國AD 患者人數(shù)將超過4000萬人，為社會和家庭帶來了沉重負擔(dān)［1］。

根據(jù)《柳葉刀》癡呆癥預(yù)防、干預(yù)和護理委員會的數(shù)據(jù)顯示，在至少10 年隨訪中，發(fā)現(xiàn)中年（小于65 歲）的低密度脂蛋白膽固醇水平與患癡呆風(fēng)險呈現(xiàn)中度相關(guān)，為癡呆癥可控危險因素［2］?；颊叽竽X顯示膽固醇生物合成和周轉(zhuǎn)減少，海馬CA3?CA2 層椎體神經(jīng)元膽固醇水平升高［3］。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，星形膠質(zhì)細胞在維持CNS 電解質(zhì)平衡、神經(jīng)介質(zhì)攝取、神經(jīng)元的發(fā)育及受損后的修復(fù)等方面起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，成人大腦中主要的膽固醇合成主要由星形膠質(zhì)細胞參與完成［4］。與此同時，活化的星形膠質(zhì)細胞會釋放出特異性標(biāo)志物，包括代謝產(chǎn)物，蛋白和外泌體等到血液中［5］，有望成為臨床AD 疾病進展篩查的的潛在指標(biāo)。

鑒于大腦中膽固醇代謝及星形膠質(zhì)細胞與AD 發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，本研究主要探究5xFAD 模型小鼠海馬腦區(qū)中膽固醇合成通路關(guān)鍵基因的表達及調(diào)控；并使用Stattic 藥物抑制腦內(nèi)膽固醇合成的上游調(diào)控基因，探究對海馬腦區(qū)星形膠質(zhì)細胞的影響，進一步為阿爾茲海默癥的篩查和治療靶點提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料（1）儀器與試劑熒光顯微鏡（Nikon），GFAP 抗體（Cell SignalingTechnology），t?STAT3 抗體（Cell Signaling Technology），p?STAT3 抗體（Cell Signaling Technology），防熒光淬滅劑（YEASEN），BODIPY 染料（Invitrogen），RT 試劑盒（Novoprotein），qPCR 試劑盒（Novoprotein）。

1.2 實驗動物實驗使用雌雄C57BL/6 品系小鼠，AD 模型小鼠5xFAD（JAX#034840），由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，中山大學(xué)北校飼養(yǎng)，在整個實驗過程中對動物的處置均符合動物倫理要求。

1.3 方法Stattic（MCE，美國）每次上午腹腔注射，實驗組5xFAD 小鼠給藥劑量為：20 mg/kg/day，對照組5xFAD 小鼠給等體積生理鹽水，連續(xù)給藥20 天。

1.4 測序分析海馬組織測序數(shù)據(jù)來源于已發(fā)表文獻［6］。樣本來自12 月齡WT 及5xFAD，雌性及雄性樣本各5 個。文庫序列與小鼠基因組對比后，使用GENCODE v21 注釋。Reads 用STAR（2.5.1b?static）定位，使用RSEM（1.2.22）對基因表達定量分析。使用edgeR 對不同基因型、不同性別海馬組織差異基因表達進行分析，篩選出p value<0.01 差異基因制作熱圖，并使用ggplot2 包繪制熱圖。

1.5 RNA 提取及RT?qPCR 檢測用Trizol 提取RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑將其逆轉(zhuǎn)為cDNA，再使用qPCR 儀進行PCR 擴增，計算RNA 相對表達水平。

引物名稱Fli1?for Fli1?rev Msx1?for Msx1?rev Gtf2b?for Gtf2b?rev序列ATGGACGGGACTATTAAGGAGG GAAGCAGTCATATCTGCCTTGG TGCTGCTATGACTTCTTTGCC GCTTCCTGTGATCGGCCAT TCGACCAGCCGTTTGGATG TTCGGGACAGATCATATCGCC

1.6 組織免疫熒光檢測（1）BODIPY 染色腦片以1xPBS 漂洗。10%山羊血清室溫封閉1 小時。BODIPY 室溫避光孵育15 分鐘后封片。（2）GFAP染色腦片以1xPBS 漂洗，GFAP 抗體孵育過夜。二抗室溫避光封閉2 小時后封片。

1.7 Westernblot 檢測小鼠接受Stattic 腹腔給藥后20 天，取海馬組織蛋白定量后取20 μg 上樣，經(jīng)電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉后，用t?STAT3，p? STAT3 和β?actin 抗體4℃孵育過夜，二抗室溫搖床孵育2 小時，加上HRP 底物發(fā)光液后成像。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均以（平均值±標(biāo)準誤差）表示。只有兩個分組的實驗數(shù)據(jù)采用T 檢驗進行統(tǒng)計分析，超過兩組則采用單因素方差分析。P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 12 月齡5xFAD 小鼠海馬區(qū)膽固醇基因表達和膽固醇水平為探究5xFAD 在已出現(xiàn)認知差異的5xFAD小鼠海馬區(qū)膽固醇合成相關(guān)基因水平，我們使用12 月齡海馬組織測序結(jié)果進行分析。熱圖顯示5xFAD 小鼠海馬組織中膽固醇合成通路相關(guān)基因顯著上調(diào)（圖1A?B）。BODIPY 染色結(jié)果顯示，12 月齡5xFAD 小鼠海馬腦區(qū)和胼胝體區(qū)的膽固醇及中性脂質(zhì)含量顯著高于WT 小鼠（圖1C?D）。

圖1 12 月齡5xFAD 小鼠海馬區(qū)膽固醇基因表達和膽固醇水平

2.2 5xFAD 小鼠膽固醇合成基因轉(zhuǎn)錄因子表達升高我們篩選出膽固醇合成基因的轉(zhuǎn)錄因子Fli1，Msx1 和Gft2b。qPCR 結(jié)果顯示轉(zhuǎn)錄因子基因的表達水平在5xFAD 小鼠海馬區(qū)中顯著升高（圖2A?B）。進一步對上游轉(zhuǎn)錄因子篩選后，發(fā)現(xiàn)膽固醇合成通路的轉(zhuǎn)錄因子受信號轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）調(diào)控。檢測磷酸化STAT3 和總STAT3 蛋白水平后，發(fā)現(xiàn)5xFAD 小鼠海馬組織中p?STAT3蛋白水平顯著升高（圖2C?F），提示STAT3 激活并上調(diào)膽固醇合成通路轉(zhuǎn)錄因子，使得膽固醇合成基因表達升高，最終導(dǎo)致腦組織中的膽固醇含量增多。

圖2 調(diào)控膽固醇合成基因的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達水平

2.3 抑制STAT3 磷酸化改善5xFAD 小鼠海馬區(qū)星形膠質(zhì)細胞的激活對12 月齡WT 和5xFAD 小鼠連續(xù)20 天Stattic 給藥后，WB 結(jié)果顯示Sattic 有效抑制5xFAD 小鼠海馬腦區(qū)中STAT3 蛋白水平的磷酸化（圖3A?B），同時發(fā)現(xiàn)STAT3 抑制劑能減少皮層和海馬區(qū)星形膠質(zhì)細胞的激活（圖3C?E）。

圖3 STAT3 抑制劑改善12 月齡5xFAD 小鼠海馬腦區(qū)中星形膠質(zhì)細胞的激活

3 討 論

隨著中國老年化社會到來，阿爾茲海默癥已成為當(dāng)今公共健康的難題。本研究通過對5xFAD小鼠海馬腦區(qū)組織測序分析，發(fā)現(xiàn)5xFAD 小鼠海馬區(qū)膽固醇合成相關(guān)基因和相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達顯著升高。已有研究揭示，線粒體膽固醇積累可增加神經(jīng)元對Aβ 介導(dǎo)的神經(jīng)毒性敏感性，減低線粒體抗氧化細胞保護功能，加重神經(jīng)損傷［7］。我們對海馬腦區(qū)進行膽固醇檢測，觀察到5xFAD 小鼠海馬腦區(qū)中膽固醇在內(nèi)的中性脂質(zhì)含量顯著升高。成年人大腦內(nèi)膽固醇主要由星形膠質(zhì)細胞產(chǎn)生。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中星形膠質(zhì)細胞控制神經(jīng)元和突觸的穩(wěn)態(tài)［8］。星形膠質(zhì)細胞不僅檢測和響應(yīng)突觸傳遞信號，其活化形式亦可反應(yīng)機體的健康和疾病狀態(tài)。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)12 月齡5xFAD 小鼠海馬區(qū)膽固醇合成通路相關(guān)基因，轉(zhuǎn)錄因子表達顯著升高。抑制轉(zhuǎn)錄激活因子STAT3 的磷酸化能夠顯著改善5xFAD 小鼠海馬腦區(qū)中星形膠質(zhì)細胞的激活。這些結(jié)果提示降低大腦中膽固醇的合成，可能改善AD 疾病的發(fā)生發(fā)展，成為AD 新的治療靶點。此外，活化的星形膠質(zhì)細胞會釋放出特異性標(biāo)志物，包括代謝產(chǎn)物，蛋白和外泌體等，結(jié)合腦脊液和外周血液中膽固醇水平，以及其他AD 生物標(biāo)記物如p?Tau，Aβ，NFL 等共同檢測，有望為AD 的篩查和診斷提供重要臨床價值。