楊葉桂 李諾 石佳欣 黃京菊 方衛(wèi) 覃斯娜 謝露 陳蒙華*

發(fā)生心跳驟停（Cardiac Arrest，CA）后恢復(fù)自主循環(huán)（Return of Spontaneous Circulation，ROSC）的患者仍有一定幾率發(fā)生遲發(fā)性腦損傷，此現(xiàn)象與腦的缺血再灌注損傷（Ischemia Reperfusion Injury，IRI）有關(guān)。大量活性氧（reactive oxygen species，ROS）的生成導(dǎo)致腦組織氧化應(yīng)激損傷是缺血再灌注機制之一。降低氧化應(yīng)激損傷成為減輕心肺復(fù)蘇（Cardiopulmonary Resuscitation，CPR）患者遲發(fā)性腦損傷的有效手段。

既往研究顯示：相比電刺激誘導(dǎo)CA 的動物模型而言，使用高血鉀誘導(dǎo)CA 的動物控制性高血鉀能夠耐受更長時長的腦缺血，且復(fù)蘇后腦損傷表象甚微［1，2］。我們推測后者血液中的較高的血鉀水平可能發(fā)揮減輕腦組織IRI 的作用，因為在體外實驗還證實了細胞外高鉀環(huán)境能夠抑制細胞凋亡的發(fā)生［3］。

ROS 含量在短時間內(nèi)劇增是引起氧化應(yīng)激損傷的原因。而ROS 水平是體內(nèi)活性氧“生成”和“清除”兩種機制共同作用下的結(jié)果。假如提高CA 動物模型血鉀能夠發(fā)揮腦保護作用，其潛在機制是降低ROS 的生成水平還是提升ROS 的清除能力尚未可知。

本研究將基于ROS 代謝原理，探討控制性高血鉀降低CA 動物模型腦損傷的潛在機制。

1 材料與方法

1.1 動物隨機從廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心選取7-8 周，體重為210-240 g，健康成年雄性Sprague?Dawley（SD）大鼠，置在SPF 級環(huán)境進行飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度26℃，術(shù)前禁食12 h，允許自由飲水和活動。本研究方案經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會批準，動物許可證號：SYXK 桂2014-0003。

1.2 動物模型動物模型的準備：腹腔注射2%戊巴比妥鈉注射液（30 mg/kg）麻醉大鼠，分別分離左側(cè)股靜脈、股動脈，并穿刺置管，分別用于藥物注射及動脈壓監(jiān)測，記錄標準Ⅱ肢體導(dǎo)聯(lián)心電。

動物模型建立：根據(jù)Chen 等［4］人報道的方法，經(jīng)食道電刺激誘導(dǎo)大鼠室顫，建立CA/CPR 模型，將CA 大鼠隨機為生理鹽水組（NS 組，n=16），氯化鉀組（KCL 組，n=16）。CA 6 min 時，分別經(jīng)靜脈注射3.2 ml/kg 的生理鹽水、2.5%氯化鉀（60 ug/g），同時行常規(guī)CPR、機械通氣。CPR 啟動后未ROSC，則在CPR 1 min、3 min 靜脈注射腎上腺素（0.02 mg/kg）。CRP 10 min 仍未ROSC 則定義為復(fù)蘇失敗。ROSC 后維持血流動力學(xué)穩(wěn)定1 h，后撤機、拔管，置于籠中單獨飼養(yǎng)。另隨機選取12 只大鼠作為假手術(shù)組（SH 組，n=12），僅行麻醉及穿刺置管。建模期間，使用加熱燈維持大鼠體溫恒定（直腸溫度37.0±0.3℃）。

1.3 評判標準（1）CA 的標準：心電圖顯示室顫或無脈電活動，平均動脈壓<20 mmHg（1 mmHg =0.133 kPa）。（2）ROSC 的標準：心電呈室上性節(jié)律（竇性、房性、交界性心律），平均動脈壓≥50 mmHg持續(xù)5 min 以上。

1.4 檢測指標記錄ROSC 后30 min 平均動脈壓（MAP），ROSC 后24 h 神經(jīng)功能評分（NDS），ROS、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）。（1）NDSROSC 后24 h 進行NDS 評分，總分0-80 分，分數(shù)越低提示神經(jīng)損傷越重。（2）ROS 熒光強度、MDA 水平、SOD 活性的檢測ROSC 后24 h，隨機抽取7 只大鼠/組，麻醉后立即斷頭取腦，冰凍標本后，分離左右大腦用于后續(xù)檢測。ROS 熒光強度：作右側(cè)腦組織視交叉處冠狀面切片，用二氫乙啶（10 mmol/L）避光孵育30 min，用激光共聚焦顯微鏡測定海馬區(qū)熒光強度。MDA 水平、SOD 活性：取左側(cè)海馬組織100 mg 進行勻漿，用多功能酶標儀測定MDA 的吸光度值（波長532 nm）及SOD 吸光度值（波長550 nm），按測定盒（南京建成生物工程研究所）提供公式計算MDA 含量和SOD 活力。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 22 統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料采用（±s）表示，服從正態(tài)分布、方差齊性的計量資料使用ANOVA 單因素方差分析；方差不齊使用Dunnett's 兩兩比較，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠的基線特征見表1。

表1 各組大鼠基線特征

2.2 各組大鼠復(fù)蘇效果比較見表2。

2.3 ROSC 后30min 的MAP 比較見圖1。

圖1 ROSC 后1-30 min 的MAP 比較

2.4 海馬ROS、MDA水平、SOD活性比較見表2。

表2 各組大鼠復(fù)蘇效果的比較

表2 各組大鼠復(fù)蘇效果的比較

3 討 論

在本研究中結(jié)果顯示KCL 組大鼠ROSC 后24 h NDS 明顯改善，ROS 及MDA 水平，ROSC 后1-30 min MAP 無統(tǒng)計學(xué)差異，結(jié)果表明提高血鉀可能通過抑制ROS 生成，減輕氧化應(yīng)激，改善腦IRI，使用該劑量氯化鉀是安全的。

ROS 是電子與氧結(jié)合生成的單電子還原產(chǎn)物。缺血缺氧時線粒體出現(xiàn)呼吸鏈功能障礙，導(dǎo)致電子泄露，恢復(fù)再灌注時大量泄露電子與富含氧血液中的氧氣結(jié)合，產(chǎn)生大量ROS。過量的ROS 增加降解細胞內(nèi)的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，從而造成氧化應(yīng)激損傷，導(dǎo)致線粒體去極化、膜電位喪失，加重線粒體功能障礙，導(dǎo)致線粒體釋放更多的ROS［5］。MDA 是過量ROS 氧化磷脂的多聚不飽和脂肪酸的產(chǎn)物，其含量高低反映氧化損傷程度。SOD 是生物體內(nèi)清除自由基的重要的抗氧化酶。本研究發(fā)現(xiàn)，CPR 時提高血鉀濃度可減少ROS 及MDA 水平，減輕大腦神經(jīng)損傷，但SOD 未見明顯改變，因此，推測提高血鉀可能通過減輕ROS 的生成，抑制氧化應(yīng)激，改善腦IRI。

細胞內(nèi)鉀離子外排和細胞收縮是細胞凋亡的特征，細胞質(zhì)鉀離子在啟動細胞凋亡中起調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)提高細胞外鉀離子濃度可改善線粒體功能，減輕缺血缺氧損傷［3，6］。Crestanello JA等［7］發(fā)現(xiàn)，使用線粒體鉀離子通道開放劑可增加鉀離子內(nèi)流，可抑制ROS 的生成，維持線粒體的穩(wěn)定性，延緩或減輕細胞凋亡。另有研究報道，細胞內(nèi)外鉀離子濃度可影響caspase 的激活和由化學(xué)應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡的啟動，細胞內(nèi)鉀離子升高至135 mM 可以完全抑制CD95 介導(dǎo)的凋亡，低于95 mM則無明顯改善，介于95 mM 至135 mM 時，其保護效應(yīng)與鉀離子濃度呈濃度依賴性［8］。那么，CPR 時繼續(xù)增加氯化鉀劑量是否可以增強其保護作用？眾所周知，CA/CPR 后的心臟經(jīng)歷了缺血及IRI 的雙重打擊，對高血鉀的耐受性會降低。本研究中，氯化鉀組大鼠ROSC 后的MAP 與NS 組比較，雖無統(tǒng)計學(xué)差異，但ROSC 后10 min 內(nèi)的MAP 呈現(xiàn)一定的下降趨勢，繼續(xù)增加劑量則可能增加其對心肌的負性作用，削弱其保護作用。因此，適度提高細胞外鉀離子濃度可改善腦IRI，但需警惕過高血鉀對心肌的抑制作用。

綜上，CPR 時升高血鉀通過減少ROS 生成，降低MDA水平，減輕氧化應(yīng)激，改善CPR后的腦IRI。

4 結(jié) 論

心肺復(fù)蘇早期升高血鉀濃度可抑制ROS 生成，減少氧化應(yīng)激改善腦IRI。