楊紫荊 趙春麗梁文琦陳鐘壡 柳 柯 龔樹(shù)生*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，北京 100050；2.首都醫(yī)科大學(xué)耳聾疾病臨床診療與研究中心，北京 100050)

噪聲性聽(tīng)力損失(noise-induced hearing loss, NIHL)是最為常見(jiàn)的感音神經(jīng)性聾之一[1]。現(xiàn)代社會(huì)日益成為一種充滿(mǎn)噪聲源的環(huán)境，因此NIHL也得到了廣泛關(guān)注。聽(tīng)力損害的程度與接觸噪聲的種類(lèi)、強(qiáng)度和時(shí)間等因素密切相關(guān)，研究[2-3]表明，短時(shí)中等強(qiáng)度的噪聲暴露僅造成暫時(shí)性聽(tīng)力閾移 (temporary threshold shift, TTS), 這種聽(tīng)閾變化可在噪聲后一段時(shí)間內(nèi)恢復(fù)的現(xiàn)象被Liberman等[2]命名為隱性聽(tīng)力損失 (hidden hearing loss, HHL)。研究[3-4]表明噪聲性隱性聽(tīng)力損失(noise-induced hidden hearing loss, NIHHL)雖不會(huì)引起永久性聽(tīng)力下降，但會(huì)造成耳蝸內(nèi)結(jié)構(gòu)的損傷，具體表現(xiàn)為內(nèi)毛細(xì)胞 (inner hair cell, IHCs)與螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元之間帶狀突觸(ribbon synapses, RS)的損害，從而影響聲音的處理，是NIHHL的重要致病機(jī)制。

線(xiàn)粒體是哺乳動(dòng)物細(xì)胞有氧呼吸的主要場(chǎng)所，其代謝產(chǎn)物活性氧(reactive oxygen species, ROS)的累積近年來(lái)被認(rèn)為是NIHL的主要發(fā)病機(jī)制之一[5-6]。因此，線(xiàn)粒體功能正常是內(nèi)耳細(xì)胞進(jìn)行多種生理活動(dòng)的必要條件。線(xiàn)粒體主要的去乙酰化蛋白(sirtuin-3, SIRT3)是Sirtuins家族中的一員，在維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)和能量調(diào)節(jié)中起著重要的作用[7]。研究[8-10]表明，SIRT3可抵抗耳蝸內(nèi)氧化應(yīng)激從而保護(hù)聽(tīng)力，然而其在NIHHL中是否也發(fā)揮同樣的作用還不明確。因此，本研究建立了NIHHL小鼠模型，通過(guò)抑制SIRT3來(lái)探討其在NIHHL中的具體作用，為噪聲性聾的發(fā)生和防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

SIRT3抑制劑[3-(1H-1,2,3-triazol-4-yl) pyridine, 3-TYP] (美國(guó)MCE公司)；5%(體積分?jǐn)?shù))山羊血清(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)；0.3%(體積分?jǐn)?shù))Triton X-100(美國(guó)Sigma公司)；4-羥基壬烯醛 (4-hydroxynonenal, 4-HNE)抗體(英國(guó)Abcam公司)；CtBP2抗體、Myosin-VIIa抗體 (美國(guó)BD Biosciences公司)；山羊抗鼠IgG1 Alexa Fluor 568抗體、山羊抗兔IgG (H+L) Alexa Fluor 647抗體(美國(guó)Invitrogen公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

C57BL/6J雄性小鼠購(gòu)自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2019-0010，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用遵循醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理實(shí)施細(xì)則以及首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理細(xì)則。對(duì)小鼠聽(tīng)力初篩排除異常小鼠后，將其采用數(shù)字表法隨機(jī)分為對(duì)照組 (Control組，n=8)、噪聲組 (NE 組,n=8) 和3-TYP組(n=8)。其中3-TYP組在噪聲前1周對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射3-TYP，50 mg·kg-1·d-1，連續(xù)7 d，而噪聲組只接受噪聲暴露，未做其余處理。兩組小鼠均在6周齡接受噪聲，并于噪聲后24 h及2周進(jìn)行ABR測(cè)聽(tīng)(圖1)。以上所有組別小鼠均于12 h暗環(huán)境中飼養(yǎng)，每籠最多5只，可自由進(jìn)食和飲水。所有涉及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)流程和操作都經(jīng)過(guò)首都醫(yī)科大學(xué)倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理審批號(hào)：AEEI-2018-011。

圖1 小鼠噪聲暴露模式圖 Fig.1 Schematic diagram of noise exposure in mice

1.3 噪聲暴露

將噪聲組及3-TYP組小鼠置于隔音室內(nèi)相對(duì)的兩個(gè)揚(yáng)聲器中間，暴露于100 dB聲壓級(jí)(sound pressure level, SPL)的寬帶白噪聲2 h。功率放大器與調(diào)音臺(tái)相連接，Cool Edit Pro軟件 (Adobe Systems, San Jose, CA)對(duì)聲音進(jìn)行編輯合成。

1.4 聽(tīng)力測(cè)試

為了評(píng)估噪聲后小鼠的聽(tīng)力情況，對(duì)其進(jìn)行了聽(tīng)覺(jué)腦干反應(yīng) (auditory brainstem response, ABR) 測(cè)試。小鼠腹腔注射100 mg/kg氯胺酮麻醉后，置于隔音室內(nèi)，分別將參考電極插入待測(cè)耳乳突后，記錄電極插入顱頂正中皮下，地極插入對(duì)側(cè)耳乳突后。特定頻率click、4 kHz、8 kHz、16 kHz、32 kHz聲音刺激以5 dB為間隔從90 dB依次衰減至0 dB，通過(guò)耳道內(nèi)的塑料管傳遞給小鼠，并記錄可重復(fù)波形處最小聲音強(qiáng)度為聽(tīng)力閾值和90 dB處 ABR I波的幅值。以上所有測(cè)試及聽(tīng)力評(píng)估均由同一人完成。

1.5 帶狀突觸計(jì)數(shù)

脊椎脫臼法處死小鼠，取雙側(cè)耳蝸浸泡于4% (質(zhì)量分?jǐn)?shù)) 多聚甲醛中4 ℃固定過(guò)夜。10% (體積分?jǐn)?shù)) EDTA脫鈣后，于鏡下剝離外殼、外側(cè)壁、蓋膜等結(jié)構(gòu)，將剩余基底膜分為頂中底三轉(zhuǎn)，置于含有5% (體積分?jǐn)?shù)) 山羊血清和0.3% (體積分?jǐn)?shù)) Triton X-100的破膜液中，室溫破膜2 h，4 ℃條件下，一抗(1∶500)孵育過(guò)夜，待PBS磷酸鹽緩沖液洗滌3次后，加入二抗(1∶300)室溫孵育2 h。樣本在共聚焦顯微鏡下(Hessen公司, 德國(guó))掃描成像，從頂回至底回，分別選取3個(gè)區(qū)域，對(duì)每個(gè)區(qū)域內(nèi)大約10個(gè)內(nèi)毛細(xì)胞下的突觸進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.6 冰凍切片染色

取材固定后的剩余耳蝸于10% (體積分?jǐn)?shù)) EDTA脫鈣12 h，再置于30% (質(zhì)量分?jǐn)?shù)) 蔗糖溶液中脫水2 h，OCT (Tissue-Tek)包埋過(guò)夜。將制備完成的耳蝸標(biāo)本以10 μm厚度進(jìn)行平行于蝸軸的冰凍切片，并在孵育相應(yīng)的一抗及二抗后，于共聚焦顯微鏡下掃描成像。最后用Image J 軟件對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 抑制SIRT3對(duì)小鼠聽(tīng)力的影響

為了研究噪聲對(duì)不同組別小鼠的影響，通過(guò)ABR測(cè)聽(tīng)檢測(cè)了不同頻率處小鼠的聽(tīng)力閾值。與對(duì)照組相比，噪聲組小鼠在噪聲后一天4 kHz、8 kHz、16 kHz、32 kHz頻率處聽(tīng)力閾值明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且以高頻聽(tīng)力損失嚴(yán)重，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。這種聽(tīng)力變化在第14天基本恢復(fù)正常(P>0.05，圖2A、B)。3-TYP組小鼠在噪聲后一天各頻率處聽(tīng)力閾值均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，在第14天聽(tīng)力閾值雖有恢復(fù)趨勢(shì)，卻未能達(dá)到正常水平 (P<0.05，圖2A、C)。同時(shí)，記錄噪聲后第14天4 kHz、8 kHz、16 kHz、32 kHz 4個(gè)頻率下90 dB SPL的I波幅值。噪聲后的小鼠I 波幅值顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且在3-TYP組更為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，圖2D)。

圖2 噪聲后1 d和14 d NE組及3-TYP組ABR聽(tīng)力閾值的變化Fig.2 Changes of ABR threshold in the NE group and 3-TYP group one day and fourteen days after NE

2.2 抑制SIRT3可加重耳蝸帶狀突觸損害

為了研究噪聲是否引起了內(nèi)耳結(jié)構(gòu)的損害，取耳蝸基底膜進(jìn)行了免疫熒光染色。與對(duì)照組相比，各組別間內(nèi)外毛細(xì)胞數(shù)量及形態(tài)未見(jiàn)明顯變化，然而在噪聲后第14天NE組小鼠中轉(zhuǎn)帶狀突觸的丟失，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且3-TYP組小鼠帶狀突觸的丟失比NE組更為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001, 圖3)。

圖3 噪聲后第14天不同組別耳蝸中轉(zhuǎn)耳蝸帶狀突觸計(jì)數(shù) Fig.3 Quantification of ribbon synapses in IHCs of the middle turn of cochlea in the different groups after fourteen days of NE

2.3 抑制SIRT3可使耳蝸組織氧化應(yīng)激水平升高

為了檢測(cè)耳蝸內(nèi)的ROS水平，采用冰凍切片進(jìn)行4HNE染色。與對(duì)照組相比，在噪聲組與3-TYP組小鼠IHCs中4HNE表達(dá)均有升高，且3-TYP組升高更為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001, 圖4)。

圖4 抑制 SIRT3后內(nèi)毛細(xì)胞ROS的累積情況Fig.4 ROS accumulation in IHCs after inhibition of SIRT3

3 討論

NIHL按病理狀態(tài)可分為兩種：暫時(shí)性聽(tīng)力損失和永久性聽(tīng)力損失。其中，僅在噪聲暴露后出現(xiàn)暫時(shí)性聽(tīng)力閾移的聽(tīng)覺(jué)功能障礙被稱(chēng)為NIHHL[11-13]。噪聲后內(nèi)耳的氧化應(yīng)激可能與這種改變有關(guān)。SIRT3是定位于線(xiàn)粒體的一種去乙?；鞍?，在過(guò)去的實(shí)驗(yàn)中，被證實(shí)參與維持各系統(tǒng)氧化還原的穩(wěn)態(tài)，也可在熱量限制下介導(dǎo)抗氧化系統(tǒng)的激活，預(yù)防年齡相關(guān)性聽(tīng)力損失[8, 14-15]。在體外實(shí)驗(yàn)[16]中證實(shí)了ROS 誘導(dǎo)的線(xiàn)粒體氧化損傷會(huì)驅(qū)使毛細(xì)胞凋亡，而SIRT3 對(duì)于保護(hù)線(xiàn)粒體功能和保護(hù)耳蝸免受氧化損傷至關(guān)重要。為進(jìn)一步研究SIRT3在耳蝸中的作用以及NIHHL的發(fā)病機(jī)制，對(duì)小鼠進(jìn)行了中低強(qiáng)度的NE，與之前的報(bào)道[17-18]一致，小鼠在噪聲后聽(tīng)力閾值明顯升高，并在兩周后恢復(fù)正常，表現(xiàn)為T(mén)TS。3-TYP是一種SIRT3特異性抑制劑，在其他研究[19-20]中被證實(shí)通過(guò)腹腔注射，能有效降低SIRT3濃度。本研究結(jié)果顯示，在使用3-TYP抑制SIRT3后，經(jīng)過(guò)噪聲暴露的小鼠2周后聽(tīng)力雖有恢復(fù)趨勢(shì)，但未能達(dá)到正常水平，因而筆者推測(cè)SIRT3在NIHHL中可能抵抗噪聲所帶來(lái)的影響。

聲音的感受與處理很大程度上取決于耳蝸內(nèi)感覺(jué)毛細(xì)胞的功能狀態(tài)。已有研究[21]證實(shí)，表現(xiàn)為T(mén)TS的動(dòng)物，雖未有聽(tīng)力受損，但I(xiàn)HCs與螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞 (spiral ganglion cells, SGCs)之間的突觸連接中斷，形成了內(nèi)耳早期損傷。既往研究[22]也表明，耳蝸內(nèi)有害性ROS的累積可造成DNA等生物大分子的損傷，影響線(xiàn)粒體功能，從而影響聽(tīng)力。為了闡明SIRT3保護(hù)內(nèi)耳的具體機(jī)制，取小鼠耳蝸基底膜進(jìn)行了形態(tài)學(xué)研究。結(jié)果顯示，噪聲后兩周的小鼠雖未見(jiàn)有毛細(xì)胞損傷，但其RS在中高頻聽(tīng)力所在區(qū)域發(fā)生丟失，且抑制SIRT3后，這種丟失更為明顯。這與ABR測(cè)試中I波幅值的降低相應(yīng)，表明了RS功能的異常。本研究還發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，噪聲后小鼠IHCs內(nèi)4HNE表達(dá)增加，且在3-TYP組更為明顯，這些結(jié)果表明噪聲可引起耳蝸內(nèi)ROS累積，并造成帶狀突觸的損傷，而SIRT3的抑制使其對(duì)抗氧化應(yīng)激的能力下降。

NIHHL是一種噪聲引起的僅表現(xiàn)為帶狀突觸損傷的聽(tīng)覺(jué)功能障礙。盡管已有研究[16, 23]證明了SIRT3對(duì)耳蝸細(xì)胞的保護(hù)作用，但針對(duì)其在噪聲后內(nèi)耳中作用的體內(nèi)研究還比較少。本研究中，短時(shí)間中等強(qiáng)度的噪聲暴露雖未給聽(tīng)力帶來(lái)直接影響，但已然在內(nèi)耳中形成了早期氧化損傷，而SIRT3的下調(diào)使耳蝸細(xì)胞中ROS累積增加，從而加重了帶狀突觸的丟失，影響噪聲后聽(tīng)力的恢復(fù)，闡明了其對(duì)聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)的保護(hù)作用，可能是通過(guò)抵抗氧化應(yīng)激以保護(hù)帶狀突觸來(lái)實(shí)現(xiàn)的。然而SIRT3的抗氧化作用是多種通路共同參與的結(jié)果，今后將在此基礎(chǔ)上，將目光聚焦于其上下游分子，進(jìn)一步完善NIHL的研究，從而為臨床相關(guān)疾病的防治提供可能的藥物靶點(diǎn)和理論依據(jù)。

利益沖突所有作者聲明無(wú)利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明楊紫荊：實(shí)驗(yàn)、數(shù)據(jù)收集和論文撰寫(xiě); 趙春麗：數(shù)據(jù)收集; 梁文琦、陳鐘壡：數(shù)據(jù)分析; 柳柯、龔樹(shù)生：研究設(shè)計(jì)和論文指導(dǎo)。