沈金峰， 朱慧萍， 胡芳， 晏子友， 李云生， 鐘森

（1.溫嶺市第一人民醫(yī)院，浙江溫嶺 317500；2.龍巖市中醫(yī)院，福建龍巖 364000；3.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西南昌 330006）

糖尿病腎病（diabetic nephropathy）是導(dǎo)致慢性腎臟病及終末期腎病的首要原因[1]。細(xì)胞程序性死亡在糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展中起重要作用[2]。細(xì)胞焦亡是一種新型的程序性細(xì)胞死亡方式，與細(xì)胞凋亡、壞死不同，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生焦亡時(shí)，細(xì)胞內(nèi)釋放大量物質(zhì)，誘發(fā)強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，因此又稱細(xì)胞炎性壞死[3]。已有研究表明，細(xì)胞焦亡是造成糖尿病腎病潛在的炎性發(fā)病機(jī)制之一[4]。近年來，以細(xì)胞焦亡為切入點(diǎn)，探討糖尿病腎病的潛在治療藥物及其療效機(jī)制成為研究熱點(diǎn)。大蒜素（diallyl trisulfide）是從大蒜鱗莖中獲得的揮發(fā)性油狀物，化學(xué)名為二烯丙基三硫化物[5]，研究發(fā)現(xiàn)，其具有抗心肌纖維化、降脂、抗腫瘤、抗老年癡呆、抗炎、抗菌、抗氧化、抗感染、保護(hù)心血管、保護(hù)腎臟等廣泛藥理學(xué)作用，其中，在抗炎方面的研究最為深入[6]。既往有研究表明，大蒜素具有減少糖尿病腎病大鼠蛋白尿和保護(hù)腎功能的作用[7]，但其具體干預(yù)機(jī)制尚不清楚?；诖?，本研究觀察大蒜素對(duì)糖尿病腎病大鼠腎組織細(xì)胞焦亡的影響，探討大蒜素對(duì)糖尿病腎病的干預(yù)機(jī)制，以期為大蒜素臨床治療糖尿病腎病提供可靠依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物50只SPF級(jí)成年雌性大鼠，體質(zhì)量180～200 g，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK（浙）20180003。動(dòng)物適應(yīng)1 周，尿蛋白陰性者方可使用。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度（22± 3）℃、相對(duì)濕度（55±10）%。本實(shí)驗(yàn)方案已通過溫嶺市第一人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查。

1.2 藥物、試劑與儀器大蒜素（分子式：C6H9S3），購自上海禾豐制藥有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：8239402。鏈脲佐菌素（STZ），美國Sigma 公司生產(chǎn)，批號(hào)：040M1412；白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-18等抗體（美國R&D Systems 公司）；凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）抗體、含pyrin結(jié)構(gòu)域NOD樣受體家族3（NLRP3）抗體（美國CST公司）；Caspase-1抗體（英國Abcam 公司）；GAPDH 抗體（美國Bioworld 公司）。熒光顯微鏡，日本Olympus 公司生產(chǎn)。

1.3 動(dòng)物分組、造模與給藥將50只大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組，大蒜素低、中、高劑量組，每組10只。假手術(shù)組大鼠給予普通飼料喂養(yǎng)，其他組別大鼠給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)。4周后，除假手術(shù)組外，其他組別大鼠給予一次性腹腔注射鏈脲佐菌素35 mg·kg-1，假手術(shù)組大鼠給予一次性腹腔注射等體積枸櫞酸緩沖液。72 h后大鼠尾靜脈取血，若隨機(jī)血糖≥16.7 mmo·L-1則提示糖尿病造模成功。定期檢測(cè)大鼠血糖和24 h 尿蛋白定量水平，24 h 尿蛋白定量＞30 mg 為糖尿病腎病模型成功標(biāo)準(zhǔn)[8]。造模成功后開始灌胃。按照沈映君主編的《中藥藥理學(xué)》[9]中藥實(shí)驗(yàn)用藥選擇換算大鼠用藥劑量，10 倍于臨床用藥劑量折算為等效劑量給藥。大蒜素高、中、低劑量組分別給予10、20、40 mg·kg-1·d-1大蒜素灌胃，假手術(shù)組與模型組給予等體積生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)8周。

1.4 觀察指標(biāo)與方法

1.4.1 大鼠一般情況 每日觀察記錄大鼠的毛發(fā)、攝食量、活動(dòng)、精神狀態(tài)及體質(zhì)量變化，每周測(cè)量尿量、24 h尿蛋白。

1.4.2 腎臟組織病理學(xué)觀察 沿腎蒂剪下殘余腎臟，10%甲醛固定后，流水沖洗，常規(guī)脫水，透明，浸蠟，包埋，切片，脫蠟，再分別進(jìn)行HE、Massion 染色，脫水、封片，光鏡下觀察腎臟組織的改變。

1.4.3 二氫乙啶（DHE）熒光探針檢測(cè)腎組織活性氧簇（ROS）含量 取腎組織冰凍切片，復(fù)溫至室溫，PBS 洗滌3 次，每次5 min。擦干玻片水漬，將含有DHE的PBS滴加于玻片上，37 ℃孵育30 min，PBS洗滌3次，抗熒光猝滅劑封片。熒光顯微鏡觀察腎組織中熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度代表ROS水平。

1.4.4 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測(cè)腎組織NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18 蛋白表達(dá) 取40 mg大鼠腎組織，加裂解液，研磨，二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量法測(cè)定蛋白濃度，加熱使蛋白變性；十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，50 g/L 脫脂奶粉封閉2 h；分別加入1∶2000 稀 釋 的NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18 等一抗，4 ℃孵育過夜；TBST 洗膜3 次，每次10 min，加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的免疫球蛋白（IgG）二抗（1∶5000稀釋），室溫孵育1 h；TBST 洗膜3次，每次10 min，滴加電化學(xué)發(fā)光液（ECL）（A 液、B 液按1∶1 混勻），化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光。以GAPDH 為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.4.5 免疫組織化學(xué)檢測(cè)腎組織IL-1β、IL-18表達(dá) 取腎組織石蠟切片，脫蠟，乙醇梯度水化，檸檬酸鈉抗原修復(fù)，去除內(nèi)源性過氧化物酶。10%牛血清白蛋白（BSA）室溫封閉1 h；滴加IL-1β、IL-18（1∶1000 稀釋）等一抗，4 ℃孵育過夜；二抗（1∶500稀釋）室溫孵育1 h。加入3，3’-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，染色30 s，沖洗5 min，乙醇脫水，然后透明，封片。使用ImageJ 軟件分析IL-1β、IL-18陽性表達(dá)強(qiáng)弱。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠24 h尿蛋白定量水平比較與假手術(shù)組比較，模型組大鼠24 h 尿蛋白定量水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，大蒜素低、中、高劑量組大鼠24 h 尿蛋白定量水平下降（P＜0.05）；各劑量組組間比較，大蒜素高劑量組的24 h 尿蛋白定量水平下降最顯著（P＜0.05）。結(jié)果如圖1所示。

圖1 各組大鼠24 h尿蛋白定量比較Figure 1 Comparison of 24-hour urinary protein amount among various groups of rats

2.2 各組大鼠腎組織病理變化比較假手術(shù)組大鼠腎臟腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)正常，系膜細(xì)胞和基質(zhì)無增生，腎間質(zhì)無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維化。模型組大鼠腎臟腎小球體積增大，系膜細(xì)胞和基質(zhì)增生，腎小管上皮細(xì)胞空泡樣變，基底膜增厚、腎間質(zhì)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維化。大蒜素低、中、高劑量組大鼠腎小球損傷減輕，系膜細(xì)胞及基質(zhì)增生減輕，腎小管上皮細(xì)胞空泡變性減輕，腎間質(zhì)炎性細(xì)胞減少、纖維化減輕，其中，大蒜素高劑量組的腎組織病理損傷最輕。結(jié)果如圖2所示。

圖2 各組大鼠腎組織病理變化比較（×200）Figure 2 Comparison of histopathological changes in the kidney tissue among various groups of rats（×200）

2.3 各組大鼠腎組織ROS水平比較與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腎組織ROS 水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，大蒜素低、中、高劑量組腎組織ROS 水平明顯降低（P＜0.05）；各劑量組組間比較，大蒜素高劑量組的ROS 水平最低（P＜0.05）。結(jié)果如圖3、圖4所示。

圖3 超氧化物陰離子熒光探針（DHE）法檢測(cè)各組活性氧簇ROS結(jié)果（×200）Figure 3 Results of ROS in various groups detected by fluorogenic probe dihydroethidium（DHE）（×200）

圖4 各組大鼠腎組織活性氧簇（ROS）水平比較Figure 4 Comparison of ROS level in kidney tissues among various groups of rats

2.4 各組大鼠腎組織NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-18、IL-1β 蛋白表達(dá)比較與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腎組織NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-18、IL-1β 蛋白表達(dá)水平顯著升高（均P＜0.05）；與模型組比較，大蒜素低、中、高劑量組大鼠腎組織NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-18、IL-1β蛋白表達(dá)水平降低（均P＜0.05）；各劑量組組間比較，大蒜素高劑量組NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-18、IL-1β蛋白表達(dá)水平最低（均P＜0.05）。結(jié)果如圖5、圖6所示。

圖5 NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-18、IL-1β的Western Blot電泳圖Figure 5 Western Blot electrophoretogram of NLRP3，ASC，Caspase-1，IL-18，IL-1β

圖6 各組大鼠腎組織NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-18、IL-1β蛋白表達(dá)水平比較Figure 6 Comparison of the expression levels of NLRP3，ASC，Caspase-1，IL-18 and IL-1β proteins in kidney tissues among various groups of rats

2.5 各組大鼠腎組織IL-1β、IL-18 陽性表達(dá)比較與假手術(shù)組比較，模型組小鼠腎組織IL-1β、IL-18 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，大蒜素低、中、高劑量組大鼠腎組織IL-1β、IL-18 表達(dá)水平降低（P＜0.05）；各劑量組組間比較，大蒜素高劑量組IL-1β、IL-18 表達(dá)水平最低（P＜0.05）。結(jié)果如圖7、圖8所示。

圖7 各組大鼠腎組織IL-1β、IL-18免疫組織化學(xué)結(jié)果（×200）Figure 7 Immunohistochemistry results of IL-1β and IL-18 in kidney tissues in various groups of rats（×200）

圖8 各組大鼠腎組織IL-1β（A）、IL-18（B）陽性表達(dá)比較Figure 8 Comparison of the positive expression of IL-1β（A）and IL-18（B）in kidney tissues among various groups of rats

3 討論

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy）是糖尿病最常見最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，不但會(huì)縮短患者的預(yù)期壽命，嚴(yán)重降低患者的生活質(zhì)量，還會(huì)給家庭和社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)[10-11]。目前，尚無治療糖尿病腎病的特效藥物，主要通過改善患者生活方式、控制血糖、控制血壓、糾正脂質(zhì)代謝紊亂等方式來延緩糖尿病腎病的病情進(jìn)展。因此，進(jìn)一步探索糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制及尋找治療糖尿病腎病的藥物研究具有重要的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)意義。

研究發(fā)現(xiàn)，焦亡在糖尿病腎病發(fā)展中發(fā)揮重要作用[12]。細(xì)胞焦亡（pyroptosis）是一種炎癥小體介導(dǎo)的依賴于Caspase-1 的細(xì)胞程序性死亡方式。NLRP3 炎癥小體是細(xì)胞內(nèi)的免疫復(fù)合物，通過NOD 受體識(shí)別進(jìn)而激活并釋放Caspase-1，誘導(dǎo)細(xì)胞腫脹，胞膜溶解，細(xì)胞破裂釋放炎性物質(zhì)（IL-18、IL-1β 等）引起炎癥反應(yīng)[13-14]。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ROS 產(chǎn)生過多，激活NLRP3 炎性小體，致使細(xì)胞焦亡[15-16]。線粒體是ROS 產(chǎn)生的重要部位，90%內(nèi)源性ROS 由線粒體產(chǎn)生[17]。而腎臟是高耗能器官，富含線粒體，高糖可直接誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生ROS，還可通過晚期糖基化終末產(chǎn)物和細(xì)胞因子間接誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS 的產(chǎn)生[18]。當(dāng)腎組織ROS增加，ROS 通過NLRP3 誘發(fā)炎癥反應(yīng)介導(dǎo)細(xì)胞焦亡，當(dāng)使用線粒體分裂抑制劑（Mdivi-1）能有效減少ROS 產(chǎn)生，從而抑制腎小管上皮細(xì)胞焦亡，保護(hù)腎臟功能[19]。高血糖癥所致的糖基化終末產(chǎn)物增加，也是糖尿病腎病氧化應(yīng)激的重要刺激因素，后者促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)線粒體分解代謝，導(dǎo)致ROS 積聚并觸發(fā)NLRP3 炎性小體途徑，最終導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生焦亡[20]。Li 等[21]發(fā)現(xiàn)通過調(diào)節(jié)ROS 可以降低Caspase-1 水平從而抑制糖尿病腎病腎小管上皮細(xì)胞的焦亡。上述研究均證實(shí)了ROS 介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡是糖尿病腎病發(fā)病的關(guān)鍵因素。

中藥含有豐富抗氧化單體，可用于糖尿病腎病的防治[22]。本項(xiàng)目負(fù)責(zé)人長(zhǎng)期從事大蒜素治療腎病的研究。大蒜作為藥食同源植物，其營養(yǎng)、藥用成分及功效均得到了廣泛關(guān)注和研究，《本草綱目》記載：其“能達(dá)下焦，消水，利大小便……能通幽門，治關(guān)格不通”。說明大蒜可用于治療慢性腎病。大蒜素屬于抗氧化劑，在有機(jī)溶劑中能夠捕捉自由基，可保護(hù)重要的生物分子不被氧化[23]。對(duì)煙曲霉感染的小鼠，已有研究發(fā)現(xiàn)大蒜素可減輕其ROS/NLRP3 途徑所致的自噬和焦亡[24]。因此，我們預(yù)測(cè)大蒜素是具有一定潛力的治療糖尿病腎病中藥單體。

本研究結(jié)果顯示：建立的糖尿病腎病模型大鼠腎組織ROS 水平及NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18 表達(dá)升高，腎組織發(fā)生細(xì)胞焦亡；經(jīng)大蒜素治療后糖尿病腎病大鼠腎組織病理損傷減輕，腎組織ROS 水平降低，NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18 表達(dá)下降，與劑量呈相關(guān)性。提示大蒜素可以通過抑制細(xì)胞焦亡有效減輕糖尿病腎病大鼠腎組織病理損傷，從而達(dá)到治療糖尿病腎病的目的。

綜上所述，大蒜素能有效減少糖尿病腎病大鼠尿蛋白，其機(jī)制可能與抑制ROS/ NLRP3/Caspase-1通路活化，減輕腎組織細(xì)胞焦亡相關(guān)。