溫丹婷， 彭瀟， 鄭瑋琳， 徐珉

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510045；2.廣東省中醫(yī)院，廣東廣州 510120；3.廣東省第二人民醫(yī)院，廣東廣州 510310）

卵巢功能過早衰竭是目前嚴(yán)重影響女性生殖健康的臨床常見疑難病，如何治療和延緩卵巢儲(chǔ)備功能減退（diminished ovarian reserve，DOR）仍然是目前婦科臨床處理過程中最具挑戰(zhàn)性的問題。中醫(yī)藥在提高DOR 治療有效率及穩(wěn)定病情方面有一定優(yōu)勢。中藥復(fù)方仙子益真膠囊是根據(jù)多年的臨床觀察數(shù)據(jù)與基礎(chǔ)研究成果，結(jié)合中醫(yī)經(jīng)典理論與全國名老中醫(yī)李麗蕓教授“調(diào)經(jīng)重在補(bǔ)腎”的學(xué)術(shù)思想，提煉、創(chuàng)制而來的，具有滋養(yǎng)肝腎、填精益髓功效，前期臨床療效研究已肯定仙子益真膠囊治療DOR 的有效性、安全性和穩(wěn)定性。本課題組前期研究證實(shí)，仙子益真膠囊可以提高卵巢早衰模型小鼠血清雌二醇（E2）含量，降低卵泡刺激素（FSH）、促黃體生成素（LH）含量，改善卵巢早衰小鼠生殖內(nèi)分泌環(huán)境[1-2]，亦可有效改善雷公藤多苷誘導(dǎo)DOR 大鼠卵巢功能，提高卵巢儲(chǔ)備功能[3]。但仙子益真膠囊的治療機(jī)制仍未完全闡明，限制了其推廣運(yùn)用。本研究以Bcl-2/Bax凋亡途徑為著眼點(diǎn)，探討仙子益真膠囊治療DOR的作用機(jī)制，旨在明確其關(guān)鍵作用靶點(diǎn)，以期為應(yīng)用仙子益真膠囊臨床早期預(yù)防和解決DOR 提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物60只12周齡SPF 級(jí)雌性SD 大鼠，體質(zhì)量250 ～270 g，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK（粵）2016-0041]，動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)：44002100014319。飼養(yǎng)于室溫22～26 ℃、明暗各12 h 的SPF 級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后備用。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（粵）2018-0094。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品仙子益真膠囊（由熟地黃、菟絲子等組成，每粒約含生藥量1.65 g），由廣東省中醫(yī)院提供，粵藥制字：Z20070627，生產(chǎn)批號(hào)：189101；雷公藤多苷片，遠(yuǎn)大醫(yī)藥黃石飛云制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：20170901；戊酸雌二醇片，拜耳醫(yī)藥保健有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：2011361A；地屈孕酮片，荷蘭Abbott Biologicals B.V 公司生產(chǎn)，批號(hào)：1091278。

1.3 主要試劑與儀器核轉(zhuǎn)錄因子kappaB（NF-κB）p65抗體（美國Cell Signaling公司）；雌激素受體α（ERα）抗體、孕激素受體（PR）抗體（美國Santa Cruz公司）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒（美國Thermo 公司）；蛋白酶抑制劑（瑞士Roche公司）；放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解液（碧云天生物有限公司）；檸檬酸組織抗原修復(fù)液[邁新公司（中國）]；逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒（美國Promega 公司）；TRIzol 試劑（美國Invitrogen 公司）；即用型高效免疫組化二抗試劑盒[優(yōu)寧維公司（中國）]。酶標(biāo)儀（型號(hào)：EONC）、PCR 擴(kuò)增儀（型號(hào)：CFX96）（美國Bio-Rad 公司）；凝膠成像分析儀（上海培清公司，型號(hào)：JS-680B）；漩渦混合器（上海精科實(shí)業(yè)有限公司，型號(hào)：XW-80A）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀公司，型號(hào)：TGL-16）；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）；轉(zhuǎn)移電泳槽（廣州譽(yù)維生物科技儀器有限公司，型號(hào)：VE-186）；垂直電泳槽（廣州譽(yù)維生物科技儀器有限公司，型號(hào)：VE-180B）。

1.4 DOR 大鼠模型構(gòu)建SPF級(jí)健康雌性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)，每日進(jìn)行陰道涂片檢查，隨機(jī)抽取性周期正常的大鼠10只作為正常組，其余的為造模誘導(dǎo)組。正常組給予等體積生理鹽水灌胃。造模誘導(dǎo)組參照文獻(xiàn)研究[4]給予雷公藤多苷片50 mg·kg-1灌胃，每日2次，連續(xù)28 d。模型建立開始，每天通過觀察大鼠陰道脫落細(xì)胞涂片了解大鼠動(dòng)情周期變化。如果出現(xiàn)動(dòng)情期延長或動(dòng)情周期延長，可判斷動(dòng)情周期紊亂；如出現(xiàn)持續(xù)10 d 及以上的動(dòng)情間期，則判斷動(dòng)情周期失常；當(dāng)出現(xiàn)動(dòng)情周期失常，陰道角化上皮細(xì)胞減少，有核上皮細(xì)胞混雜，表示建立模型成功[5]。將造模組大鼠按隨機(jī)數(shù)字表分為模型組，中藥低、中、高劑量組，西藥組，每組10只。

1.5 分組與給藥造模第14天開始給藥。給藥劑量按成人體質(zhì)量（kg）的臨床用藥劑量以人鼠比例換算[6]，藥物均溶于生理鹽水制成等體積混懸液灌胃。正常組給予生理鹽水10 mL/kg 灌胃，中藥低、中、高劑量組給予仙子益真膠囊混懸液0.625、1.25、2.5 g·kg-1·d-1灌胃，西藥組給予補(bǔ)佳樂、地屈孕酮灌胃（具體方法：第1天開始，戊酸雌二醇0.14 mg·kg-1·d-1，連續(xù)4 d；第5天，地屈孕酮片0.92 mg·kg-1·d-1，1 d。第6天，停藥1 d 后，如此繼續(xù)序貫用藥）。干預(yù)28 d后，選擇動(dòng)情間期取材。正常組給予等體積生理鹽水灌胃。

1.6 指標(biāo)檢測與方法

1.6.1 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）法檢測大鼠卵巢內(nèi)凋亡因子Bcl-2、Bax、Caspase-3 和p53 mRNA表達(dá)水平 應(yīng)用TRIzol試劑提取卵巢組織的總RNA。Bcl-2、Bax、Caspase-3 和p53 以及β-actin mRNA 引物的合成均由華大基因公司完成。RT-PCR 引物序列見表1。取RNA 樣品，用核酸分析儀進(jìn)行定量。以5 μL RNA 作為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，按照SYBR Green PCR Reagents 說明書應(yīng)用7500 Real Time PCR System 進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性3 min，1 個(gè)循環(huán)；95 ℃變性10 s，60 ℃30 s 退火及延伸，共持續(xù)40 個(gè)循環(huán)。每個(gè)循環(huán)在60 ℃延伸時(shí)收集熒光值，測定達(dá)到熒光閾值時(shí)的最小循環(huán)次數(shù)（Ct 值），完成后進(jìn)行溶解曲線測定。以β-actin 為內(nèi)參基因，2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量，其中ΔΔCt=（Ct目的基因-Ctβ-actin）處理組-（Ct目的基因-Ctβ-actin）對(duì)照組。溶解曲線程序設(shè)置為：95 ℃10 s；65 ～95 ℃，每0.5 ℃進(jìn)行1次溶解曲線分析。記錄數(shù)據(jù)并分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

表1 RT-PCR 引物序列Table 1 RT-PCR primer sequence

1.6.2 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測卵巢組織中NF-κB p65 蛋白及子宮內(nèi)膜ERα、PR 蛋白表達(dá)水平 液氮脆化卵巢組織、子宮內(nèi)膜組織后研磨，用加入蛋白酶抑制劑的RIPA 強(qiáng)裂解液在冰上裂解30 min，振蕩，離心，轉(zhuǎn)移上清至新EP管。用BCA 蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。用5×Loading Buffer 混合樣品，100 ℃10 min 變性，離心，-80 ℃保存。取30 μg 相應(yīng)蛋白樣品上樣，100 V恒壓跑電泳，300 mA 90 min 轉(zhuǎn)膜，50 g/L奶粉封閉，一抗（NF-κB p651∶100稀釋，ERα 1∶200稀釋，PR 1∶200 稀釋），4 ℃冰箱孵育過夜后，TBST 洗膜10 min × 3 次。第2天，二抗（1∶5000稀釋）室溫孵育1 h后，TBST洗膜10 min×3次。于化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)免疫發(fā)光，用Image Lab 顯影成像。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，應(yīng)用IamgeJ軟件分析條帶灰度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。符合正態(tài)分布與方差齊性的兩組間計(jì)量資料比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。多組間計(jì)量資料比較符合條件，采用單因素設(shè)計(jì)方差分析，組間兩兩比較采用LSD 法；多組間計(jì)量資料比較不符合應(yīng)用條件，采用Welch’s ANOVA，組間兩兩比較采用Games-Howell 法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠卵巢組織凋亡因子Bax、Caspase-3、p53、Bcl-2 mRNA表達(dá)比較圖1、圖2結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠卵巢組織Bax、Caspase-3、p53 mRNA 表達(dá)水平明顯升高，Bcl-2 mRNA表達(dá)水平明顯降低，Bcl-2/Bax比率下降（均P＜0.05）；與模型組比較，中藥低、中、高劑量組大鼠卵巢組織Bax、Caspase-3、p53 mRNA 表達(dá)水平呈劑量依賴性降低，Bcl-2 mRNA 表達(dá)水平呈劑量依賴性升高（均P＜0.05），Bcl-2/Bax 比率升高。以上結(jié)果表明，雷公藤多苷誘導(dǎo)的DOR 大鼠存在卵巢細(xì)胞凋亡，仙子益真膠囊可減少DOR 大鼠卵巢細(xì)胞凋亡。

圖1 各組大鼠卵巢組織中Bax（A）、Caspase-3（B）、p53（C）mRNA相對(duì)表達(dá)量比較Figure 1 Comparison of relative mRNA expression levels of Bax（A），Caspase-3（B）and p53（C）in ovarian tissues among various groups of rats

圖2 各組大鼠卵巢組織中Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量（A）及Bcl-2/Bax比率（B）比較Figure 2 Comparison of relative mRNA expression level of Bcl-2（A）in ovarian tissues and Bcl-2/Bax ratio（B）among various groups of rats

2.2 各組大鼠卵巢組織NF-κB p65蛋白表達(dá)比較圖3結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠卵巢組織NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，中藥低、中、高劑量組和西藥組大鼠卵巢組織NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平升高，其中，中藥中、高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 各組大鼠卵巢組織NF-κB p65蛋白表達(dá)比較Figure 3 Comparison of NF-κB p65 protein expression in ovarian tissues among various groups of rats

2.3 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織ERα、PR 蛋白表達(dá)比較圖4結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠子宮內(nèi)膜組織ERα、PR蛋白表達(dá)水平明顯下降（均P＜0.05）；與模型組比較，中藥低、中、高劑量組及西藥組大鼠子宮內(nèi)膜組織ERα、PR 蛋白表達(dá)水平明顯升高（均P＜0.05），且中藥各組呈劑量依賴性。

圖4 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織中ERα（A）、PR（B）蛋白表達(dá)量及ERα、PR蛋白電泳圖（C）Figrure 4 Expression of protein expression levels of and electrophoretogram of ERα and PR in endometrial tissues in various groups of rats

3 討論

中醫(yī)學(xué)“腎-天癸-沖任-胞宮”之性生殖鏈與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)“下丘腦-垂體-卵巢軸”極為相似?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，下丘腦、垂體、卵巢釋放的激素調(diào)節(jié)女性性周期，“天癸”可能相當(dāng)于垂體、卵巢、睪丸等性腺的內(nèi)分泌素?！澳I”主宰女性生殖機(jī)能的發(fā)育、旺盛與衰退，“腎”對(duì)女性卵巢生理功能的實(shí)現(xiàn)起著決定性作用。臨床報(bào)道及藥理研究表明，雷公藤多苷可損傷女性卵巢功能且損傷有可逆性，“以方測證”證實(shí)該模型為腎精氣虧虛卵巢功能低下模型[7]。以雷公藤多苷50 mg/kg 劑量造模，其穩(wěn)定性和可逆性均較好[7]。因此，本研究確定雷公藤多苷片50 mg/kg灌胃大鼠28 d構(gòu)建卵巢功能減退（DOR）藥效學(xué)研究動(dòng)物模型，并基于大鼠陰道上皮細(xì)胞會(huì)隨卵巢激素的周期性變化而變化的特點(diǎn)，通過陰道涂片法檢測大鼠動(dòng)情周期，直觀判斷其性腺功能是否正常[8]。本課題組前期研究表明，仙子益真膠囊能夠有效改善雷公藤多苷導(dǎo)致的大鼠卵巢功能低下的狀況，提高卵巢儲(chǔ)備功能[3]。故本研究選擇雷公藤多苷構(gòu)建DOR實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，高度模擬了女性卵巢儲(chǔ)備功能減退的狀態(tài)，結(jié)合中醫(yī)基礎(chǔ)理論，進(jìn)一步從細(xì)胞分子基因水平探討了仙子益真膠囊對(duì)DOR 的治療作用，以Bcl-2/Bax凋亡途徑為著眼點(diǎn)，闡明其治療DOR的可能機(jī)制和作用靶點(diǎn)，可為院內(nèi)制劑的新藥開發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

3.1 仙子益真膠囊對(duì)DOR大鼠卵巢Bcl-2/Bax及相關(guān)因子的影響細(xì)胞凋亡是卵巢功能下降的病理特征之一。凋亡過程受多基因調(diào)控，研究表明，凋亡信號(hào)傳導(dǎo)途徑有細(xì)胞表面死亡受體通路、線粒體通路以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路，其中，Caspase-3是最重要的細(xì)胞凋亡效應(yīng)蛋白，能夠參與多種途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，是凋亡的主要執(zhí)行者[9]。而p53基因作為轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在于卵巢組織，監(jiān)控和調(diào)節(jié)細(xì)胞的生存或凋亡，影響卵子的發(fā)育與成熟。p53基因被敲除后，顆粒細(xì)胞的凋亡率明顯降低，卵泡閉鎖的數(shù)目也顯著降低[10]。

Bcl-2 是在B 細(xì)胞濾泡性淋巴瘤染色體斷裂點(diǎn)發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制基因。而Bax 則是Bcl-2 家族中研究最為廣泛的促凋亡基因，在凋亡過程中起樞紐作用。Bcl-2 和Bax 蛋白相互作用可形成異源二聚體，抑制凋亡；而若是Bax蛋白之間相互作用則可形成同源二聚體，從而促進(jìn)凋亡[11]。Bcl-2/Bax 比率決定細(xì)胞凋亡發(fā)生與否，有“死亡開關(guān)”之稱。若細(xì)胞呈Bax 過表達(dá)，可使細(xì)胞內(nèi)Caspase 激活效應(yīng)增強(qiáng)[12]，并可拮抗Bcl-2 對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用，進(jìn)而引起細(xì)胞的凋亡。

研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2/Bax 表達(dá)對(duì)卵泡的生長發(fā)育有調(diào)控作用。卵泡在生長發(fā)育過程中的大量丟失與Bax 的持續(xù)表達(dá)相關(guān)，而當(dāng)卵泡需要進(jìn)一步增殖時(shí)，Bcl-2 選擇性表達(dá)，可與Bax 互相調(diào)節(jié)，Bc1-2＞Bax 則細(xì)胞趨于存活，Bax＞Bc1-2 則細(xì)胞趨于凋亡，使卵巢儲(chǔ)備維持在合理水平。然而，當(dāng)Bcl-2 與Bax 表達(dá)失調(diào)時(shí)，在發(fā)育過程中的卵泡開始凋亡，形成閉鎖卵泡，最終導(dǎo)致DOR[13]。

NF-κB 作為炎癥啟動(dòng)和調(diào)節(jié)過程的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[14]，在炎癥反應(yīng)中起重要作用。NF-κB 介導(dǎo)的炎癥信號(hào)通路是調(diào)控炎癥反應(yīng)的經(jīng)典信號(hào)通路，參與多囊卵巢綜合征（PCOS）患者血管內(nèi)皮損傷[15]。NF-κB對(duì)細(xì)胞凋亡存在雙向調(diào)節(jié)作用，既可以促進(jìn)凋亡也可以抑制凋亡。NF-κB 過度活化，一方面可激活Caspase-3、Bcl-2 使兩者的表達(dá)增加，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；一方面可以激活同處一個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)中位于其下游基因的Bcl-2，過度表達(dá)的Bcl-2發(fā)揮其自身的抑凋亡作用，或與NF-κB在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)形成Bcl-2-NF-κB 復(fù)合物，發(fā)揮抑凋亡的作用[16-17]。

本研究結(jié)果表明，仙子益真膠囊可通過上調(diào)Bcl-2、下調(diào)Bax 及相關(guān)凋亡因子的表達(dá)來減少DOR 大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，從而改善卵巢儲(chǔ)備功能，保護(hù)卵巢。亦提示NF-κB p65活化使Bcl-2過表達(dá)或者形成復(fù)合物而發(fā)揮其抑凋亡作用可能是仙子益真膠囊治療DOR 的作用機(jī)制之一，此為中藥復(fù)方多靶點(diǎn)多通路作用的起效模式的論證提供了科學(xué)依據(jù)。

3.2 仙子益真膠囊對(duì)DOR大鼠子宮內(nèi)膜ERα、PR蛋白表達(dá)的影響雌激素（E2）、孕激素（P）以及雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）是形成良好內(nèi)膜容受性的重要因素，其中任一因素表達(dá)失常將導(dǎo)致著床失敗[18]。本研究結(jié)果顯示：雷公藤多苷誘導(dǎo)的DOR模型大鼠子宮內(nèi)膜PR、ERα蛋白表達(dá)明顯下降；中藥低、中、高劑量組大鼠子宮內(nèi)膜PR、ERα 蛋白表達(dá)較模型組呈劑量依賴升高。表明仙子益真膠囊可改善DOR 大鼠卵巢儲(chǔ)備功能，還可改善子宮內(nèi)膜容受性。

綜上所述，仙子益真膠囊可抑制卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，改善卵巢儲(chǔ)備功能，保護(hù)卵巢，還可改善子宮內(nèi)膜容受性，從而有利于胚泡的植入，以提高DOR 患者胚胎著床率。本研究結(jié)果可有助于進(jìn)一步完善生殖生理體系內(nèi)容，豐富“腎主生殖”理論，亦顯示仙子益真膠囊治療DOR 具有良好的應(yīng)用前景。