孫 音，郝 軍，房義福，張 謙，姜楠南

（1山東省林業(yè)科學(xué)研究院，濟(jì)南 250014；2濟(jì)南市歷城區(qū)綠化服務(wù)中心，濟(jì)南 250100）

0 引言

兜蘭屬(Paphiopedilum)是蘭科植物中較原始的屬之一，以其唇瓣而得名，故又叫拖鞋蘭、仙履蘭等，在全世界約有80余種，接近1/3的資源在中國有分部[1]，主要產(chǎn)于廣西、云南以及貴州等省區(qū)[2]。其花期長、花型奇特，備受世界花卉愛好者的青睞。目前對(duì)兜蘭的研究主要集中于系統(tǒng)演化、生態(tài)地理、引種馴化、組培快繁、多樣性評(píng)價(jià)等方面[3-4]。

60Co-γ射線穿透力強(qiáng)，變異譜大，誘導(dǎo)的變異性狀可在當(dāng)代進(jìn)行篩選，且具有可遺傳性，能極大的縮短育種周期，目前作為一種便捷的手段被廣泛應(yīng)用多種植物中[5]。輻射誘變育種和組織培養(yǎng)相結(jié)合的育種體系是近年來研究者較為關(guān)注的育種方法，它可以提高植物在基因水平上的突變率，有利于打破性狀連鎖以及親本對(duì)后代變異類型的局限，進(jìn)而擴(kuò)大植物的變異譜，縮短育種年限，快速創(chuàng)造新材料、新種質(zhì)[6]。王晶等[7]研究了60Co-γ射線對(duì)菊花組培苗的誘變效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)在增殖階段和生根階段，誘變處理的最佳劑量在10 Gy左右，葉片和花色都發(fā)生不同程度的變異。劉麗強(qiáng)等[8]對(duì)觀賞海棠組培苗的輻射誘變中發(fā)現(xiàn)，60Co-γ射線輻射后，組培苗在形態(tài)上出現(xiàn)明顯矮化特征，葉色、葉緣、葉形變異明顯，30 Gy時(shí)誘變效果穩(wěn)定，是較為合適的輻射劑量。姜長陽等[9]利用60Co-γ射線輻射玉蘭由莖尖生長點(diǎn)誘導(dǎo)的愈傷組織，并從再生植株中選育出生長速度快、生長旺盛、抗逆性強(qiáng)等具有多種優(yōu)良性狀的玉蘭新品系。張慧琴等[10]用60Co-γ射線對(duì)草莓組培苗進(jìn)行了輻射誘變，發(fā)現(xiàn)輻射劑量對(duì)草莓組培苗的生長發(fā)育有顯著影響，品種不同，對(duì)輻射效應(yīng)的敏感性也不同。

兜蘭本身變異系數(shù)較低，主要的繁殖方式為無菌播種，選種周期長[11]，目前未見到利用組培苗進(jìn)行輻射誘變的報(bào)道，對(duì)于輻射劑量、植物材料對(duì)組培苗生長和發(fā)育的影響以及輻射后植株的變異情況尚不清楚。本研究選用不同時(shí)期的兜蘭組培苗作為材料進(jìn)行60Co-γ輻射誘變，旨在明確60Co-γ射線在種子萌發(fā)、增殖、生根及小苗移栽后生長和生理特性的影響，探討可能發(fā)生的形態(tài)變異，以確定適宜輻照劑量及對(duì)兜蘭的誘變效應(yīng)，為無菌播種、離體快繁與輻射誘變相結(jié)合的復(fù)合育種技術(shù)的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料分別選用無菌播種30天的兜蘭種子、待分化的兜蘭不定芽（高0.8～1.5 cm）、待生根的兜蘭幼苗（高2.0～2.5 cm）以及要移栽的兜蘭小苗。種子處理時(shí)選用100粒顆粒飽滿，無病蟲害種子；幼苗分化、生根以及小苗處理時(shí)選用100株葉片鮮綠、硬挺、富有光澤的小苗，每個(gè)輻照劑量設(shè)3個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)在山東省林業(yè)科學(xué)研究院遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、濟(jì)南國際鮮花港智能溫室，于2020年1月—2021年4月份進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 輻射誘變處理 輻射誘變處理劑量設(shè)0、5、10、20、30、40 Gy 6個(gè)梯度。于山東濟(jì)南長清區(qū)泉港輻照中心對(duì)植物材料進(jìn)行輻射處理，輻射劑量率為1.0Gy/min。

1.2.2 指標(biāo)測(cè)定方法

式中：x為輻射劑量；y為幼苗成苗率；N為供試種子數(shù)。

用游標(biāo)卡尺測(cè)量苗高、根長等；根系活力采用TTC檢測(cè)方法，脯氨酸的測(cè)定主要采用酸性茚三酮比色法，可溶性蛋白含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法[12]，丙二醛(MDA)和可溶性糖的測(cè)定采用硫代巴比妥酸法，超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍(lán)四唑法，過氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法[13]。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 運(yùn)用Excel 2010、SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 輻射處理對(duì)兜蘭種子萌發(fā)、幼苗增殖、生根的影響

2.1.1 輻射處理對(duì)兜蘭種子萌發(fā)的影響 輻射后兜蘭種子發(fā)芽情況見表1、圖2。隨著輻射劑量的增大，種子發(fā)芽指標(biāo)呈下降趨勢(shì)。輻射劑量為5 Gy時(shí)，發(fā)芽率與對(duì)照組相比差異不顯著，但成苗率和發(fā)芽勢(shì)顯著降低，表明種子已經(jīng)受到損傷，需要一定修復(fù)，萌發(fā)時(shí)間延長，后期成苗能力減弱，在10 Gy劑量時(shí)，各萌發(fā)指標(biāo)較其他各組差異極顯著(P＜0.01)，成苗率為對(duì)照的62.45%。在20 Gy劑量時(shí)，發(fā)芽率、成苗率和發(fā)芽勢(shì)較10 Gy下降幅度最大，分別為74.84%、76.56%和74.99%，表明在此劑量輻射下，種子內(nèi)部結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重，萌發(fā)難度大。在30 Gy、40 Gy劑量時(shí)，種子各項(xiàng)發(fā)芽指標(biāo)差異不顯著，且40 Gy劑量時(shí)，種子喪失成苗力。

圖2 不同劑量輻射處理60天的兜蘭種子萌發(fā)情況

表1 不同劑量輻射處理對(duì)兜蘭種子萌發(fā)的影響

輻射后的成苗率是衡量輻射損傷效應(yīng)的重要指標(biāo)，也是計(jì)算其半致死劑量的依據(jù)，成苗率與半致死劑量成線性關(guān)系，計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。得出線性方程為y=-1.85x+62.80，R2=0.90。從直線回歸方程中可以求得：當(dāng)y=50時(shí)，x=6.92，即兜蘭種子輻射的半致死劑量LD50=6.92 Gy。

圖1 輻射劑量與成苗率的相關(guān)性分析

結(jié)合兜蘭種子輻射處理后的各項(xiàng)萌發(fā)指標(biāo)和計(jì)算的半致死劑量，得出兜蘭種子萌發(fā)階段適宜的輻射劑量為5 Gy。

2.1.2 輻射處理對(duì)兜蘭不定芽增殖的影響 輻射后兜蘭不定芽增殖情況見表2、圖3。隨著輻射劑量的增大，不定芽增殖率、增殖時(shí)間、苗高均呈下降的趨勢(shì)。處理90天、120天時(shí)，5 Gy劑量下的增殖率、苗高與對(duì)照相比差異極顯著(P＜0.01)；150天時(shí)，增殖率與對(duì)照組相比差異不大，但少數(shù)分化苗葉片濃綠，變厚，植株低矮。10 Gy劑量下3個(gè)階段增殖率較其他組差異極顯著(P＜0.01)，處理90天時(shí)，苗高與5 Gy劑量差異極顯著(P＜0.01)，隨著時(shí)間延長，苗子長勢(shì)加快，120天和150天時(shí)與5 Gy劑量下差異較小。到150天時(shí)，20 Gy、30 Gy劑量下的增殖率差異不顯著，分別為對(duì)照組的43.90%、32.92%；分化苗出現(xiàn)花色、細(xì)長、卷曲等特征，株型矮化，說明輻射對(duì)植株細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，誘發(fā)表型變異。但30 Gy時(shí)，小苗長勢(shì)較弱。40 Gy時(shí)，增殖率和苗高較其他組差異極顯著，分化能力幾乎喪失，小苗部分褐化死亡。結(jié)合增殖率和表型變異情況，得出兜蘭不定芽增殖階段適宜的輻射劑量為20 Gy。

表2 不同劑量輻射處理對(duì)兜蘭分化的影響

圖3 不同劑量輻射處理150天后的兜蘭分化苗

2.1.3 輻射處理對(duì)兜蘭不定根分化的影響 輻射后兜蘭不定根分化情況見表3、圖4。隨著輻射劑量的增大，不定根分化時(shí)間變長，生根率顯著下降。兜蘭不定根分化階段對(duì)輻射處理敏感性較強(qiáng)，輻射后120天、150天，隨著輻射劑量的增大根系活力呈下降趨勢(shì)，180天時(shí)，隨著輻射劑量的增大根系活力先略升后下降。5 Gy劑量下，120天時(shí)生根率為對(duì)照的69.55%，根長為對(duì)照的64.71%，180天時(shí)生根率為對(duì)照的77.10%，根長與對(duì)照組差異不顯著，說明隨著時(shí)間的推移兜蘭對(duì)低劑量輻射造成的傷害有一定的修復(fù)能力。同時(shí)處理180天時(shí)根系活力較對(duì)照組提高了4.05%，說明低劑量的輻射對(duì)根系活力有一定促進(jìn)作用。10 Gy劑量下，處理180天后的各項(xiàng)指標(biāo)較5Gy劑量下降幅度大，同時(shí)，10、20 Gy劑量下，部分小苗株型矮化、葉片卷曲、開裂，白化、且生長緩慢。30～40 Gy劑量下生根率為0，說明兜蘭不定根分化階段對(duì)輻射處理敏感性較強(qiáng)。以此得出，兜蘭不定根分化階段，適宜的輻射劑量為5Gy。

圖4 不同輻射處理150天的下兜蘭生根情況

表3 不同劑量輻射處理對(duì)兜蘭不定根分化的影響

2.2 輻射處理對(duì)兜蘭小苗的影響

2.2.1 輻射處理對(duì)兜蘭小苗生長的影響 將輻射后的兜蘭小苗移栽到溫室中培養(yǎng)，紀(jì)錄輻射后生長情況，見表4。與對(duì)照組相比，5 Gy劑量下的株高和根系生長量與對(duì)照組差異不顯著，葉片鮮綠，長勢(shì)好，未見明顯的變異。10 Gy劑量下，少數(shù)出現(xiàn)葉形變異。20 Gy～30 Gy劑量下，株高和根系生長量較對(duì)照差異極顯著(P＜0.01)，株型、葉形和葉色都出現(xiàn)明顯變異。但30Gy劑量下，小苗長勢(shì)較差。40 Gy劑量下，植株長勢(shì)極弱，畸形嚴(yán)重，難以維持繼續(xù)生長，結(jié)合生長和表型變異情況，得出兜蘭小苗階段適宜的輻射劑量為20 Gy。

表4 不同劑量輻射處理對(duì)兜蘭小苗生長的影響

2.2.2 輻射處理對(duì)兜蘭小苗電導(dǎo)率和丙二醛的影響 隨著輻射劑量的增大，相對(duì)電導(dǎo)率表現(xiàn)出逐漸先升高后下降的趨勢(shì)，見圖5。0～20 Gy處理下，各組之間差異極顯著(P＜0.01)。劑量為20 Gy時(shí)，達(dá)到最大值，與對(duì)照相比增加163.33%，差異極顯著(P＜0.01)，20、30、40 Gy劑量下，相對(duì)電導(dǎo)率略有下降，差異不顯著。

圖5 不同劑量輻射處理對(duì)兜蘭電導(dǎo)率和丙二醛的影響

隨著輻射劑量的增大，MDA含量呈現(xiàn)逐步增加的趨勢(shì)，見圖5。輻射劑量為10 Gy時(shí)，MDA較前一劑量值增加67.73%，變化幅度較大。當(dāng)輻射劑量為30 Gy時(shí)，MDA達(dá)到最大值，較對(duì)照組增加268.67%，差異極顯著(P＜0.01)。30、40 Gy劑量時(shí)，MDA變化差異不大，說明已接近峰值。

2.2.3 輻射處理對(duì)兜蘭小苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響 隨著輻射劑量的增大，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)呈現(xiàn)出先升高再降低的趨勢(shì)，見表5。可溶性糖、可溶性蛋白在輻射劑量為20 Gy時(shí)，含量最高，分別較對(duì)照組增加188.54%和221.85%。與其他組差異極顯著(P＜0.01)。脯氨酸在輻射劑量為30 Gy時(shí)達(dá)到峰值，較對(duì)照組增加了157.39%。20 Gy和30 Gy劑量下差異不顯著。輻射劑量為40 Gy時(shí)，可溶性蛋白的含量較對(duì)照組減少8.06%，說明輻射劑量達(dá)到一定閾值，可溶性蛋白質(zhì)合成受到嚴(yán)重抑制，輻射對(duì)小苗的損傷嚴(yán)重。

表5 不同劑量輻射處理下兜蘭3種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的變化情況

2.2.4 輻射處理對(duì)兜蘭小苗抗氧化酶活性的影響 隨著輻射劑量的增大，超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)活性表現(xiàn)為先升高再降低的趨勢(shì)，見表6。輻射劑量為10 Gy時(shí)，SOD和POD酶活性最高，與對(duì)照組相比分別增加190.03%、45.18%，差異極顯著(P＜0.01)。輻射劑量為5 Gy、30 Gy時(shí)，SOD和POD活性差異不大，較對(duì)照組分別增加109.67%、15.32%。在輻射劑量為40 Gy時(shí)，SOD和POD酶的活性均低于對(duì)照，說明輻射處理對(duì)兜蘭葉片抗氧化酶活性具有一定的促進(jìn)作用，但當(dāng)輻射劑量過高時(shí)，會(huì)減少其活性增加量甚至降低活性值。

表6 不同劑量輻射處理下兜蘭抗氧化酶活性的影響

綜合小苗的生長和各項(xiàng)生理生化指標(biāo)，得出兜蘭小苗階段適宜的輻射劑量為20 Gy。

3 討論與結(jié)論

不同輻射劑量對(duì)植物不同發(fā)育時(shí)期、不同組織部位產(chǎn)生的影響各不相同，輻射劑量較低，難以獲得預(yù)期的誘變效果，但隨著輻射劑量的增加，植株變異率增加，植株死亡率也隨之提高，因此合適的輻射劑量的選擇對(duì)提高輻照育種效率具有指導(dǎo)意義[14]。目前對(duì)植物輻射育種的研究發(fā)現(xiàn)不同照射材料對(duì)射線的敏感性不一，對(duì)射線的敏感性大小依次為試管苗＞田間苗＞根芽＞插條＞種子[15]。但試管苗具體發(fā)育時(shí)期的適宜輻射劑量并沒有詳細(xì)報(bào)道。本研究首次采用60Co-γ射線對(duì)兜蘭不同發(fā)育時(shí)期的植株進(jìn)行輻射誘變，通過輻射后植株形態(tài)和生理生化指標(biāo)的變化，篩選適宜的輻射劑量，期望獲得多種變異類型的新材料。

研究發(fā)現(xiàn)兜蘭不同發(fā)育時(shí)期對(duì)輻射的敏感性差別較大。種子階段和不定根分化階段對(duì)60Co-γ的敏感性較高，而不定芽分化和小苗階段的敏感性相對(duì)較低。目前沒有明確報(bào)道試管苗不同時(shí)期對(duì)輻射敏感性的差異，因此后續(xù)需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

隨著輻射劑量的增加，兜蘭種子萌發(fā)率、成苗率、發(fā)芽勢(shì)均呈下降趨勢(shì)。成苗率明顯小于發(fā)芽率，這是因?yàn)檩椛鋵?duì)種子內(nèi)部結(jié)構(gòu)造成損傷，種子雖能發(fā)芽，但生長的抑制作用逐漸表現(xiàn)出來，后期成苗能力降低，這與馮琪等[16]在研究60Co-γ對(duì)花葵種子萌發(fā)的影響中的結(jié)果一致。隨著輻射劑量的增加，兜蘭不定芽增殖率受到顯著抑制，增殖時(shí)間延長，說明輻射后細(xì)胞修復(fù)需要一定時(shí)間，這與王晶等[7]在研究60Co-γ對(duì)菊花組培苗誘變效應(yīng)中的結(jié)果一致。對(duì)植物進(jìn)行輻射育種的研究發(fā)現(xiàn)，一定劑量的輻射對(duì)植物的生長有促進(jìn)作用[17]，彭夢(mèng)婕等[18]在通過研究60Co-γ對(duì)紫薇幼苗的輻射效應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，0～60 Gy劑量下，幼苗的葉綠素含量升高，對(duì)生長有促進(jìn)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，5 Gy時(shí)，兜蘭分化苗葉片濃綠，變厚，生長健壯，與紫薇的報(bào)道類似，但是否有助于提高光合速率，利于光合反應(yīng)，還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。輻射劑量超過30 Gy時(shí)，增殖率和苗高較對(duì)照下降顯著，幼苗出現(xiàn)黃葉、花葉等的變異，長勢(shì)弱，推測(cè)葉綠體結(jié)構(gòu)遭到破壞，葉綠素含量降低，不利于生長，這與在扁穗雀[19]、大花秋葵和錦葵[20]中的研究結(jié)果一致。李瑜等[21]對(duì)桂花幼苗的研究發(fā)現(xiàn)，低劑量的γ射線會(huì)使根長和根系活力有一個(gè)較小的上升趨勢(shì)，本研究中5 Gy劑量下的根系活力較對(duì)照組高，與李瑜的報(bào)道一致，但根長短于對(duì)照組，可能物種差異，導(dǎo)致輻射效應(yīng)不同。一定劑量的60Co-γ輻射會(huì)使植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化，進(jìn)而引起外部形態(tài)的改變[22-23]。本研究中，兜蘭植株在輻射后出現(xiàn)低矮、花葉，卷曲或裂葉等變異，誘變效應(yīng)顯著。同樣，60Co-γ輻射對(duì)植株外部形態(tài)的改變?cè)诰栈ā⒂^賞海棠、水仙、君子蘭、、月季、等[7-8,24-26]都有報(bào)道。

植物受到冷害、鹽漬、輻射等逆境時(shí)，首先表現(xiàn)在對(duì)生物膜系統(tǒng)的傷害，細(xì)胞膜透性和選擇性發(fā)生改變或破壞，細(xì)胞間的物質(zhì)轉(zhuǎn)移發(fā)生紊亂[27-28]。另一方面，生成自由基與活性氧，產(chǎn)生對(duì)細(xì)胞有毒害作用的物質(zhì)[29-30]。60Co-γ射線輻射育種研究中，輻射后植物材料的生理生化指標(biāo)的變化可作為判斷輻射育種效果的依據(jù)。本研究中5～20 Gy的劑量下，兜蘭小苗的電導(dǎo)率、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)等增加，MDA含量升高，說明低劑量輻射兜蘭小苗積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來增強(qiáng)對(duì)逆境的抵抗作用。當(dāng)輻射劑量為20～30 Gy時(shí)，部分滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)如可溶性糖、可溶性蛋白含量較峰值略有下降，表明此時(shí)兜蘭抵御逆境的機(jī)制仍在發(fā)揮作用，但合成效率降低，對(duì)輻射的抵御效果減弱。

當(dāng)輻射劑量為30～40 Gy時(shí)，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量下降顯著，可能是高劑量的輻射處理對(duì)蛋白合成相關(guān)基因的表達(dá)產(chǎn)生抑制作用。而MDA含量持續(xù)升高，到40 Gy時(shí)含量接近平穩(wěn)，說明造成了膜質(zhì)過氧化損傷，致使機(jī)體活性氧與自由基積累增加，從而導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)的完整性被破壞，這與水仙、百合、萵苣[24,31-32]中的結(jié)果一致，但在扁穗雀麥、桂花、苜蓿[19,21,33]等植物中MDA呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。這與本研究有一定的印證作用，但也有不同之處，可能與材料差異有關(guān)。

SOD、POD等抗氧化物酶能夠清除植物在逆境脅迫下產(chǎn)生的活性氧與自由基，但對(duì)植物毒害的調(diào)節(jié)保護(hù)作用存在一定的限度[34]。本研究中，兜蘭的POD、SOD活性，均表現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)，10 Gy時(shí)達(dá)到最大值，類似結(jié)果在紫薇[18]、藍(lán)莓[34]、刺梨[35]中也有報(bào)道。但在露地菊的輻射研究中發(fā)現(xiàn)SOD活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，而POD活性則持續(xù)上升[36]。40 Gy時(shí)，二者活性均低于對(duì)照組。推測(cè)低劑量的射線處理能夠促進(jìn)一系列修復(fù)酶的活性，緩解植物受損程度，而高劑量的射線對(duì)組織細(xì)胞損傷增加，當(dāng)活性氧的產(chǎn)生積累超過植株個(gè)體的損傷閾值時(shí)，酶系統(tǒng)逐漸被破壞致使酶活性降低。

本研究首次探討了60Co-γ對(duì)兜蘭不同發(fā)育時(shí)期的誘變效應(yīng)，篩選適宜輻射劑量。研究發(fā)現(xiàn)不同時(shí)期的兜蘭組培苗對(duì)60Co-γ射線的耐受性不同，輻射處理對(duì)兜蘭種子萌發(fā)、不定芽增殖、不定根分化以及小苗生長具有顯著影響，誘導(dǎo)的變異性狀明顯。種子萌發(fā)階段、不定根分化階段對(duì)輻射的敏感度較高，適宜的輻射劑量分別為5 Gy。以誘變后成苗率與輻射劑量之間的相關(guān)性建立線性回歸方程，得出兜蘭種子半致死劑量為6.92 Gy。不定芽增殖率和小苗移栽階段耐受性相對(duì)較高，適宜的輻射劑量為20 Gy。下一步擬對(duì)輻射誘變產(chǎn)生的變異苗進(jìn)行培養(yǎng)，觀察變異的穩(wěn)定性，并進(jìn)一步從中篩選兜蘭新品種。本研究為兜蘭輻射育種和種質(zhì)創(chuàng)新提供了理論依據(jù)。