劉 靜，張建會(huì)，杜詠梅，張興偉，緒 擴(kuò)，張瑞娜，肖 勇，雷云康，江 鴻，亓超凡，劉艷華*

曬晾煙煙花腺毛分泌物蔗糖酯的鑒定與評(píng)價(jià)

劉 靜1，張建會(huì)2*，杜詠梅1，張興偉1，緒 擴(kuò)1，張瑞娜3，肖 勇2，雷云康3，江 鴻2，亓超凡1，劉艷華1*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101；2.四川煙草科學(xué)研究所，成都 610094；3.中國(guó)煙草總公司四川省公司德陽(yáng)市公司，四川 德陽(yáng) 618099）

煙草蔗糖酯是煙葉香味成分的重要前體物，對(duì)卷煙的增香保潤(rùn)具有重要作用。為解析煙草曬晾煙腺毛分泌物蔗糖酯的組分構(gòu)成及含量，以80份曬晾煙資源（X1-X80）為試驗(yàn)材料，利用氣質(zhì)聯(lián)用儀（GC-MS）測(cè)定了煙花腺毛分泌物中5種不同分子量的蔗糖酯SEI-SEⅥ含量，并通過(guò)相關(guān)、聚類及主成分分析等方法對(duì)80份曬晾煙資源進(jìn)行了綜合評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，80份曬晾煙資源鮮煙花中總蔗糖酯含量范圍是198.19 ～ 4?410.45 μg/g，符合正態(tài)分布，其中SEIV含量最高，SEI含量最低；相關(guān)性分析表明，SEI與SEII呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，二者與其他類型的蔗糖酯均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。聚類分析可將80份種質(zhì)分為5個(gè)類群，各類群間蔗糖酯含量差異顯著。基于主成分分析的綜合評(píng)價(jià)表明，Havana1號(hào)（X2）、六峰毛把煙（X47）、Ha19（X75）、Criollo（X73）、卷葉曬煙（X78）、S-2（X5）、尼加拉瓜長(zhǎng)芯（X70）、E 18（X14）、塘蓬（X41）、Beinhart 1000-1（X3）等10份資源蔗糖酯含量高，可為高香氣煙草品質(zhì)育種和煙草本香的開(kāi)發(fā)提供物質(zhì)基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

曬晾煙；煙花；腺毛分泌物；蔗糖酯

糖酯是煙草表皮腺毛分泌物的主要化學(xué)成分，在腺毛體腺頭細(xì)胞中特異合成[1-2]，包括葡萄糖酯和蔗糖酯，二者均以四元酯的結(jié)構(gòu)存在，是煙草腺毛分泌物中除萜烯外含量第二豐富的成分，其中蔗糖酯的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于葡萄糖酯。蔗糖酯（Sucrose Ester，SE）是由葡萄糖或果糖的一個(gè)或多個(gè)羥基與脂肪酸、芳香酸酯化而成[3]。SEVERSON、ARRENDAL等[4-6]根據(jù)乙?；谄咸烟腔蚬黔h(huán)上取代位置的不同將煙草蔗糖酯分為三類，第一類蔗糖酯的乙?；B接在葡萄糖環(huán)的C6位置，第二類蔗糖酯的乙酰基連接在果糖環(huán)的C3位置，而第三類蔗糖酯的葡萄糖部分與第二類蔗糖酯相同，其果糖部分與第一類蔗糖酯相同。第二、第三類蔗糖酯僅在野生種和i中被檢測(cè)到，而普通煙草（）腺毛分泌物中的蔗糖酯屬于第一類，根據(jù)分子量（622, 636, 650, 664, 678, 692）的不同，第一類蔗糖酯可被分為6種類型（SEⅠ-SEⅥ）。

蔗糖酯（SE）是煙草香氣成分的重要前體物，在卷煙燃吸時(shí)，熱裂解產(chǎn)生的異丁酸、甲基丁酸、甲基戊酸等物質(zhì)，可提高卷煙的香氣，并且蔗糖酯可在煙葉表面形成一層水油相隔的保護(hù)膜，常被作為復(fù)合添加劑添加到煙絲中起到保濕、保潤(rùn)的效果，對(duì)煙葉增香保潤(rùn)具有重要貢獻(xiàn)[7-10]。一直以來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究者開(kāi)展了以培育高蔗糖酯品種為目標(biāo)的煙草育種及蔗糖酯人工合成的相關(guān)研究[11-13]，但由于煙草蔗糖酯結(jié)構(gòu)復(fù)雜，目前具有天然活性蔗糖酯合成的報(bào)道較少。我國(guó)煙草種質(zhì)資源豐富，共保存各類煙草種質(zhì)6000余份，其中曬晾煙資源3000余份，且遺傳多樣性豐富。到目前為止，對(duì)曬晾煙資源進(jìn)行蔗糖酯含量及組成的系統(tǒng)鑒定未見(jiàn)報(bào)道，高蔗糖酯含量的育種親本依然匱乏。鑒于此，本研究以80份曬晾煙種質(zhì)資源的煙花為試驗(yàn)材料，利用氣質(zhì)聯(lián)用儀（GC-MS）對(duì)煙花腺毛分泌物中不同分子量的蔗糖酯進(jìn)行檢測(cè)，明確不同曬晾煙資源腺毛分泌物中蔗糖酯的含量及組成，篩選出高蔗糖酯含量的優(yōu)異資源，可為煙草高香氣品質(zhì)育種提供優(yōu)異親本，對(duì)煙草蔗糖酯多用途的開(kāi)發(fā)與利用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 供試材料 80份曬晾煙種質(zhì)資源由國(guó)家煙草種質(zhì)資源中期庫(kù)提供，編號(hào)X1-X80，見(jiàn)表1。

表1 供試煙草種質(zhì)資源

表1 續(xù)

1.1.2 試劑 蔗糖八乙酸酯（純度 98%，美國(guó) Sigma 公司），N,O-雙三甲基三氟乙酰胺（純度98%，美國(guó) AcrosOrganics 公司），二甲基甲酰胺、95%乙醇、無(wú)水硫酸鈉（分析純，國(guó)藥集團(tuán)），乙腈（色譜純，Merck 公司），超純水。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 7890A-5975C氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Agilent公司生產(chǎn)；WD-12水浴氮吹儀，杭州奧盛儀器有限公司生產(chǎn)；DHG-9240A恒溫烘箱，杭州藍(lán)天化藥儀器廠生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 80份種質(zhì)于2019—2020年在四川什邡雪茄科研試驗(yàn)基地種植，試驗(yàn)地選擇有代表性、中等肥力且肥力均勻一致的平坦田塊。2月上旬播種，4月中旬移栽。株距45 cm，行距110 cm，每份資源種植3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)2行，每行25株。

1.2.2 樣品采集和前處理 每份資源每個(gè)重復(fù)從5～10株煙草花序中取20朵含苞未放的花朵，稱量后每10朵用50 mL 95%乙醇渦旋振蕩提取1.5 min，每個(gè)重復(fù)2管，合并。

蔗糖酯檢測(cè)參考蔡莉莉等[14]和解勝男等[15]方法。分別取上述提取液6 mL，50 ℃水浴，氮?dú)獯蹈桑尤牒姓崽前艘宜狨サ囊宜嵋阴?nèi)標(biāo)溶液（0.06 mg/mL）50 μL，氮?dú)獯蹈?。加?00 μL二甲基甲酰胺和N,O-雙三甲基三氟乙酰胺混合液（體積比1∶1），在75 ℃加熱（衍生化）1 h，冷卻后，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，GC/MS測(cè)定，以蔗糖八乙酸酯為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行半定量分析。

1.2.3 GC-MS試驗(yàn)條件 參考解勝男等[15]方法。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理；利用SPSS 23.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析（Person）；利用Heatmapper 程序進(jìn)行聚類分析；利用SIMCA-P 14.1 進(jìn)行PCA分析；利用SPSS 23.0進(jìn)行主成分分析和綜合評(píng)價(jià)。綜合指標(biāo)的隸屬函數(shù)分析參考文獻(xiàn)[16-20]的方法。

2 結(jié) 果

2.1 不同分子量蔗糖酯含量檢測(cè)

利用氣質(zhì)聯(lián)用儀對(duì)80份曬晾煙資源煙花腺毛分泌物中5種不同分子量的蔗糖酯含量進(jìn)行檢測(cè)，數(shù)據(jù)特征見(jiàn)表2，頻次分布見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，80份曬晾煙煙花腺毛分泌物中總蔗糖酯（SE）含量范圍為198.19～4?410.45 μg/g，變異系數(shù)為37.74%，且符合正態(tài)分布。5種不同分子量的蔗糖酯中，SEIII、SEIV、SEV含量顯著高于SEI和SEII，含量范圍分別為80.46～1156.72，29.17～1678.69及9.85～1373.18 μg/g，且三者含量均符合正態(tài)分布，其中SEIV含量最高，變異系數(shù)僅次于SEV。SEI含量最低，含量范圍最小，為0～41.1 μg/g，且SEI和SEII均不符合正態(tài)分布。

表2 80份曬晾煙資源煙花腺毛分泌物蔗糖酯數(shù)據(jù)特征

注：SEI、SEII、SEIII、SEIV、SEV分別表示不同分子量（622、636、650、664、678）的蔗糖酯。下同。

Note: SEI, SEII, SE(III), SE(IV), SE(V) separately signaling Sucrose-esters with different molecular weights(622, 636, 650, 664, 678). The same below.

圖1 80份曬晾煙種質(zhì)資源中5類蔗糖酯的總含量分布

Fig. 1 Total contents distribution of 5 classes and total Sucrose-esters in 80 sun/air-cured tobaccos resources

2.2 不同分子量蔗糖酯的相關(guān)性分析

采用SPSS 23.0軟件對(duì)80份曬晾煙資源5種不同分子量蔗糖酯含量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可以看出，SEI和SEII呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（=0.852），且二者與SEIII、SEIV、SEV均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，其中SEI與SEV達(dá)顯著水平，SEII與SEIV、SEV分別達(dá)顯著、極顯著水平。

2.3 80份種質(zhì)聚類與主成分分析

根據(jù)80份曬晾煙資源5種不同分子量蔗糖酯含量的檢測(cè)數(shù)據(jù)，利用R語(yǔ)言工具繪制熱圖（圖2），由圖2、表4可以看出，80份曬晾煙資源可分為5個(gè)類群，不同類群之間蔗糖酯的含量與組成差異顯著。類群I包含種質(zhì)資源份數(shù)最少，僅有4份，該類群SEII和SEIII含量較高，SEI含量最低；類群II包含10份種質(zhì)資源，該類群的特點(diǎn)是SEI、SEII含量最高，而其他分子量的蔗糖酯含量最低，其中X24的SEI、SEII含量最高，分別為411.1和990.3 μg/g；類群III包含23份種質(zhì)資源，該類群材料SEIV含量最高，其余分子量蔗糖酯含量低，其中X12、X14的SEIV含量最高，分別為1578.9、1678.7 μg/g；類群IV包含17份種質(zhì)資源，該類群SEIII、SEIV含量較高，其余蔗糖酯含量較低，其中X67的SEIII、SEIV含量最高，分別為966.1和914.8 μg/g；類群V包含種質(zhì)資源份數(shù)最多，共26份，該類群SEIV、SEV含量較高，其余蔗糖酯含量較低，其中X47的SEIV、SEV含量最高，分別為1?390.1和1?245.1 μg/g，X46次之，分別為1?128.3和1?373.2 μg/g。且第III類群和第IV類群大部分為引進(jìn)曬晾煙資源，而第V類群大部分為地方曬晾煙資源。

表3 不同類型蔗糖酯相關(guān)系數(shù)

注：“*”表示在0.05水平上差異顯著；“**”表示在0.01水平上差異顯著。

Note: *, the difference was significant at 0.05 level; **, the difference was significant at 0.01 level.

圖2 基于曬晾煙資源蔗糖酯含量聚類分析

表4 不同類群間5種蔗糖酯成分含量比較

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)字母表示鄧肯氏新復(fù)極差法測(cè)驗(yàn)差異顯著(<0.05)。

Note: different lowercase letters after the data indicate significant differences in Duncan's new complex range test (<0.05).

利用SIMCA-P14.1 軟件對(duì)80份曬晾煙種質(zhì)的5種不同分子量蔗糖酯進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可以看出，該方法將80份曬晾煙資源亦分成5大類，與熱圖聚類方法結(jié)果基本一致。第一類群樣本量最少，主要分布于第一、四象限；第二類群主要分布于第一象限；第三類群主要分布于第二、四象限；第四類群主要分布于第一、四象限；第五類群樣本量最多，主要分布于第二、三象限。各類群的樣本雖有少量重疊，但整體區(qū)分度較好，可綜合反映80份種質(zhì)資源蔗糖酯組成及含量的不同。

圖3 曬晾煙種質(zhì)資源基于蔗糖酯成分含量的PCA散點(diǎn)圖

2.4 不同曬晾煙資源綜合評(píng)價(jià)

對(duì)煙草蔗糖酯進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)，總蔗糖酯含量?jī)H反映不同種質(zhì)蔗糖酯的高低，而對(duì)其組成不能進(jìn)行全面的評(píng)價(jià)，為實(shí)現(xiàn)對(duì)不同分子量的蔗糖酯進(jìn)行全面、系統(tǒng)、科學(xué)的評(píng)價(jià)，本研究利用SPSS 25.0軟件對(duì)80份曬晾煙資源的煙花腺毛分泌物中5種不同分子量的蔗糖酯含量進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見(jiàn)表5、表6。根據(jù)特征值大于1的原則，可提取2個(gè)主成分，其累計(jì)貢獻(xiàn)率為88.937%，第一主成分（PC1）的貢獻(xiàn)率為57.1%，主要反應(yīng)了SEIII、SEIV、SEV的指標(biāo)信息，第二主成分（PC2）貢獻(xiàn)率為31.84%，主要反應(yīng)了SEI、SEII的指標(biāo)信息。

按照2個(gè)主成分隸屬函數(shù)值的大小依次排序，可以直觀地判斷出每個(gè)因子在各品種中的重要性。根據(jù)各主成分的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率及隸屬函數(shù)值，計(jì)算80份曬晾煙資源的綜合得分，結(jié)果見(jiàn)表7。

由表7綜合指標(biāo)值可以看出，80份種質(zhì)曬晾煙資源PC1綜合指標(biāo)值最高的前3位曬晾煙資源依次為X2、X47、X75，說(shuō)明這3份資源SEIII、SEIV、SEV含量較高，PC2綜合指標(biāo)得分最高的前3位種質(zhì)依次為X24、X4、X2，表明這3份資源SEI、SEII含量較高。最后根據(jù)2個(gè)主成分綜合指標(biāo)的隸屬函數(shù)值和各指標(biāo)的權(quán)重，計(jì)算80份種質(zhì)資源的綜合評(píng)價(jià)值，并根據(jù)綜合評(píng)價(jià)值對(duì)資源進(jìn)行排序，綜合排名從1到10的資源依次為X2、X47、X75、X73、X78、X5、X70、X14、X41、X3，其蔗糖酯組成及含量見(jiàn)表8。

表5 主成分特征值及方差貢獻(xiàn)率

表6 因子載荷

表7 不同曬晾煙資源蔗糖酯評(píng)價(jià)綜合指標(biāo)值、權(quán)重、隸屬函數(shù)值、綜合評(píng)價(jià)值及品質(zhì)排序

表7 續(xù)

表8 優(yōu)異資源蔗糖酯含量

3 討 論

煙草蔗糖酯不但對(duì)卷煙的香氣品質(zhì)有重要的貢獻(xiàn)，還具有殺蟲(chóng)、抑菌、抗氧化等生物活性，在防御昆蟲(chóng)、抵御植物病原菌及抗氧化等方面發(fā)揮著重要作用[4,8]，因此，有關(guān)蔗糖酯的研究一直成為許多行業(yè)關(guān)注和研究的熱點(diǎn)。但不同煙草種質(zhì)蔗糖酯的含量及組成均存在較大差異[11]，且不同類型蔗糖酯的生物活性和香味特征亦不同，SEVERSON等[8]研究表明，SEI和SEII型蔗糖酯由乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、甲基丁酸、戊酸、甲基戊酸等低級(jí)脂肪酸構(gòu)成，SEIII、SEIV型蔗糖酯除了以上幾種低級(jí)脂肪酸還包括己酸和甲基己酸，而SEV和SEVI型蔗糖酯則包括庚酸和甲基庚酸，但缺乏丙酸、丁酸和戊酸。另外，ORESTES等[21]研究表明，己酸蔗糖酯對(duì)煙草蚜蟲(chóng)的殺滅活性極低，對(duì)甘薯粉虱的殺滅率可達(dá)80%，而庚酸蔗糖酯對(duì)煙草蚜蟲(chóng)和甘薯粉虱的殺滅率均可達(dá)95%。因此，對(duì)于卷煙加香而言，SEI和SEII含量高的資源，熱裂解后產(chǎn)生的低級(jí)脂肪酸含量高，對(duì)卷煙的香氣品質(zhì)貢獻(xiàn)大，加香效果好，而SEIII、SEIV、SEV含量高的資源其殺蟲(chóng)活性較好。本研究利用主成分分析將5種不同類型的蔗糖酯聚為兩類，其中由低級(jí)脂肪酸構(gòu)成的SEI和SEII聚為一類，由低級(jí)、高級(jí)脂肪酸構(gòu)成的SEIII、SEIV、SEV聚為一類，且兩類蔗糖酯呈負(fù)相關(guān)。因此，煙草資源蔗糖酯的組成不同，其應(yīng)用前景亦不同。SEI、SEII含量高的煙草種質(zhì)X24、X4在卷煙加香和高香氣育種方面具有重要的利用價(jià)值，而SEIII、SEIV、SEV含量高的煙草資源X2、X47、X75在植物源殺蟲(chóng)劑的開(kāi)發(fā)方面具有重要的應(yīng)用前景。

蔗糖酯在煙葉中的含量較低，目前通過(guò)從煙葉表面分離的方法獲得蔗糖酯的數(shù)量有限，不能滿足煙草生產(chǎn)和工業(yè)上對(duì)蔗糖酯的需求。由于蔗糖酯結(jié)構(gòu)復(fù)雜，到目前為止天然活性蔗糖酯結(jié)構(gòu)的合成報(bào)道較少，且合成的蔗糖酯的結(jié)構(gòu)與天然蔗糖酯的結(jié)構(gòu)有差別，其活性也有很大不同。因此，從植物中挖掘蔗糖酯高效資源將會(huì)是一種經(jīng)濟(jì)有效的手段。本研究對(duì)80份曬晾煙煙花腺毛分泌物5種不同分子量的蔗糖酯含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，種質(zhì)資源之間蔗糖酯含量差異顯著，不同類型蔗糖酯變異系數(shù)均大于30%，高、低蔗糖酯含量的資源相差14至140倍。在5類蔗糖酯中，SEI、SEII含量較低，SEIII、SEIV、SEV含量較高，其中地方曬晾煙資源SEIII和SEIV含量較高，引進(jìn)資源SEIV和SEV含量較高，與蔡麗麗等[14]的研究結(jié)果一致。本研究中篩選出的總蔗糖酯含量高或某類型蔗糖酯含量高的10份優(yōu)異種質(zhì)資源可直接應(yīng)用于煙草育種及蔗糖酯的提取，超低蔗糖酯含量的資源X43和X50亦可為蔗糖酯代謝通路的研究和優(yōu)異基因的挖掘提供遺傳材料。

4 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)80份曬晾煙資源煙花腺毛分泌物中5種不同分子量的蔗糖酯進(jìn)行檢測(cè)分析表明，我國(guó)曬晾煙資源蔗糖酯含量豐富，SEI和SEII含量較低，分布范圍窄；SEIII、SEIV、SEV含量較高，分布范圍廣。相關(guān)關(guān)系分析表明，SEI與SEII呈極顯著正相關(guān)，二者與SEIII、SEIV及SEV均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系?；谥鞒煞值木垲惪蓪?種蔗糖酯聚為2類，SEI和SEII聚為一類，SEIII、SEIV、SEV聚為一類。并將80份曬晾煙資源分為5個(gè)類群，不同類群其蔗糖酯的組分構(gòu)成和含量差異顯著。綜合評(píng)價(jià)篩選出的10份優(yōu)異資源可為不同用途的開(kāi)發(fā)和利用提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

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Identification and Evaluation of Sucrose-Esters in Glandular Trichome Secretion of Sun/Air-Cured Tobacco Germplasms

LIU Jing1, ZHANG Jianhui2*, DU Yongmei1, ZHANG Xingwei1, XU Kuo1, ZHANG Ruina3, XIAO Yong2, LEI Yunkang3, JIANG Hong2, QI Chaofan1, LIU Yanhua1*

(1. Tobacco Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Qingdao 266101, China; 2. Sichuan Institute of Tobacco Science, Chengdu 610094, China; 3. Sichuan Deyang Tobacco Company of CNTC, Deyang, Sichuan 618099, China)

Tobacco sucrose-esters are important precursors of tobacco aroma components and play an important role in enhancing the aroma and moisturizing of cigarettes. In order to analyze the composition and content of sucrose-esters (SE) in the glandular trichome secretion of sun/air-cured tobacco germplasms, the content of 5 SEs with different molecular-weight in the flowers of 80 sun/air-cured tobacco germplasms were determined by gas chromatography-mass spectrometer (GC-MS). The data were analyzed by correlation analysis, cluster analysis, and principal component analysis. The SE contents of the 80 sun/air-cured tobacco germplasms were 198.19-4410.45 μg/g (fresh mass), showing a normal distribution. The SE with the highest content is SEIV, and the one with the lowest content is SE (I). The correlation analysis revealed that there is a significant positive correlation between SEI and SEII, and that both SEI and SEII are negatively correlated with SEIII, SEIV, and SEV. The 80 sun/air-cured tobacco germplasm were clustered into 5 groups, and the difference of SE content among 5 groups was significant. Based on principal component analysis, 10 germplasms (i.e., X2, X47, X75, X73, X78, X5, X70, X14, X41, X3) with high level of sucrose-esters were identified. These results could provide materials for developing tobacco cultivars with high-aroma quality and exploiting the natural aroma of cigarettes.

air sun-cured tobacco gemplasm; tobacco flower; glandular trichome secretion; sucrose ester

S572

A

1007-5119（2022）03-0087-09

10.13496/j.issn.1007-5119.2022.03.013

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（ASTIP-TRIC05）；中國(guó)煙草總公司四川省公司重點(diǎn)科技項(xiàng)目（SCYC202013）

劉 靜（1996-），女，在讀碩士，研究方向?yàn)椋汗δ苁称放c生物活性物質(zhì)。E-mail：m17853480108@163.com

，E-mail：張建會(huì)，787598921@qq.com；劉艷華，liuyanhua@caas.cn

2021-09-27

2022-04-19