孟 霞，王 智，鄭景怡，夏金丹，謝安琪，費(fèi)志剛，肖啟國(guó)

0 引言

淚液乳鐵蛋白(lactoferrin，Lf)含量下降是干眼的重要特征[1]，但其引起干眼損傷的確切機(jī)制尚不明確。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)干眼患者淚液乳鐵蛋白含量與眼表鐵過載及炎癥反應(yīng)呈負(fù)相關(guān)。輸血依賴型貧血患者因反復(fù)輸血可以導(dǎo)致眼表鐵沉積增加，引起眼表?yè)p傷及淚膜功能障礙[2]。這些提示眼表鐵過載可能通過促進(jìn)眼表炎癥反應(yīng)導(dǎo)致干眼發(fā)生及發(fā)展。為證實(shí)這一假說(shuō)，本研究通過腹腔注射鐵劑建立眼表鐵過載小鼠模型，觀察小鼠干眼指標(biāo)及炎癥因子的變化。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取40只SPF級(jí)健康雄性C57BL/6小鼠(取右眼為實(shí)驗(yàn)眼)，周齡6～8周，體質(zhì)量18～22g，購(gòu)于湖南SLAC實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部，實(shí)驗(yàn)前常規(guī)裂隙燈檢查以排除眼表相關(guān)疾病。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，小鼠安置于本校動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心標(biāo)準(zhǔn)的環(huán)境中統(tǒng)一飼養(yǎng)：溫度24℃～26℃，相對(duì)濕度50%～70%，燈光晝夜交替循環(huán)(每日7AM～7PM開啟)，定期添加標(biāo)準(zhǔn)鼠糧(不含鐵)和水。動(dòng)物操作及處理均符合南華大學(xué)醫(yī)學(xué)研究中心/實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部要求，經(jīng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批。

1.1.2主要試劑右旋糖酐鐵(上海麥克林生化科技有限公司)，熒光素鈉(美國(guó)Alcon公司)，酚紅棉線(天津晶明新技術(shù)開發(fā)有限公司)，組織鐵試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)，ELISA試劑盒(IL-1β、TNF-α、MMP-9)(武漢華美生物工程有限公司)，HE染色、普魯士藍(lán)染色試劑盒及各種常規(guī)化學(xué)試劑(長(zhǎng)沙維世爾生物科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1分組及鐵過載模型的建立用隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為4組：對(duì)照組10只，每次腹腔注射生理鹽水0.2mL；低劑量組、中劑量組、高劑量鐵劑組各10只為模型組，每次分別腹腔注射濃度為12.5、25、50mg/mL的右旋糖酐鐵溶液0.2mL[3]。每3d注射1次，共注射28d。

1.2.2干眼指標(biāo)及炎癥程度評(píng)估分別于注藥的第7、14、28d，在裂隙燈下觀察小鼠右眼眼前節(jié)情況并進(jìn)行評(píng)估，所有檢查均在同一地點(diǎn)、濕度、溫度及照明情況下由同一名檢查者在固定時(shí)間(PM16∶00～18∶00)完成。眼表炎癥指數(shù)采用目前通用的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(分值0/9～9/9)[4]。角膜熒光素染色檢查及評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照Pauly等[5]的標(biāo)準(zhǔn)(總分0～16分)。淚膜破裂時(shí)間(break up time, BUT)檢查：將1滴1%熒光素鈉滴入小鼠結(jié)膜囊內(nèi)，人為瞬目3次后在裂隙燈鈷藍(lán)光下觀察角膜染色區(qū)出現(xiàn)第1個(gè)黑斑的時(shí)間，重復(fù)3次取平均值[6]。淚液分泌量(Schirmer Ⅰ test, SⅠt)檢測(cè)：拉開小鼠下瞼，將酚紅棉線置于下瞼中外1/3結(jié)膜囊內(nèi)，1min后取出棉線，測(cè)量被浸濕變紅的長(zhǎng)度[7]。

1.2.3組織病理學(xué)檢查注藥28d后處死小鼠，取小鼠右眼角膜、結(jié)膜及淚腺組織，每組取一半組織用4%多聚甲醛固定、包埋、切片，其余組織置于-80℃冰箱冰凍保存用于后續(xù)檢測(cè)。按常規(guī)染色步驟用蘇木素及伊紅染液進(jìn)行HE染色，封片后顯微鏡下觀察各組織病理形態(tài)學(xué)改變；用Perls及核固紅試劑進(jìn)行普魯士藍(lán)染色，封片后顯微鏡下觀察各組織的鐵沉積情況(含鐵血黃素或三價(jià)鐵表現(xiàn)為藍(lán)色)。

1.2.4組織鐵檢測(cè)冰凍組織解凍后加生理鹽水，冰水浴勻漿后離心取上清；設(shè)空白管、標(biāo)準(zhǔn)管、測(cè)定管并添加相應(yīng)試劑，混勻，沸水浴5min后冷卻；離心取上清，測(cè)各管OD值，計(jì)算各組織中鐵含量。

1.2.5ELISA檢測(cè)冰凍組織解凍后制成勻漿，離心取上清；倍比稀釋標(biāo)準(zhǔn)品；設(shè)待測(cè)樣本孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔，加樣混勻；封孔溫育；加生物素標(biāo)記抗體工作液；封孔溫育；加辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液；封孔溫育；加底物溶液，避光顯色；加終止液搖勻，用酶標(biāo)儀測(cè)量吸光值并記錄，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各組織中IL-1β、TNF-α、MMP-9的含量。

2 結(jié)果

2.1干眼指標(biāo)及眼表炎癥程度評(píng)估在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期內(nèi)，四組小鼠精神狀態(tài)及食欲良好，均未出現(xiàn)死亡情況。建模前四組小鼠角膜透明，結(jié)膜未見明顯充血。注藥后第7、14、28d，對(duì)照組小鼠眼表炎癥指數(shù)評(píng)分(F=0.136，P=0.873)、角膜熒光素染色評(píng)分(F=0.507，P=0.608)、BUT(F=0.905，P=0.416)、SⅠt(F=0.114，P=0.867)，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

四組小鼠眼表炎癥指數(shù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F時(shí)間=50.787，P時(shí)間<0.001；F組間=245.908，P組間<0.001；F時(shí)間×組間=5.160，P時(shí)間×組間<0.001)；角膜熒光素鈉評(píng)分比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F時(shí)間=267.627，P時(shí)間<0.001；F組間=431.875，P組間<0.001；F時(shí)間×組間=37.896，P時(shí)間×組間<0.001)；BUT比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F時(shí)間=845.253，P時(shí)間<0.001；F組間=3844.659，P組間<0.001，F(xiàn)時(shí)間×組間=95.096，P時(shí)間×組間<0.001)；SⅠt比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F時(shí)間=588.618，P時(shí)間<0.001；F組間=1396.205，P組間<0.001，F(xiàn)時(shí)間×組間=74.375，P時(shí)間×組間<0.001)。四組小鼠干眼及眼表炎癥程度評(píng)估，存在時(shí)間及組間差異，進(jìn)一步進(jìn)行各組時(shí)間及組間兩兩比較，發(fā)現(xiàn)隨右旋糖酐鐵注藥時(shí)間及藥物濃度增加，小鼠眼表炎癥指數(shù)增加，角膜熒光素染色評(píng)分增加，BUT縮短，SⅠt減少，表明隨注藥時(shí)間及濃度增加，小鼠干眼及眼表炎癥程度逐漸加重，見表1～4。

表1 四組小鼠眼表炎癥指數(shù)比較 分)

表2 四組小鼠角膜熒光素染色評(píng)分比較 分)

表3 四組小鼠BUT檢測(cè)結(jié)果

表4 四組小鼠SⅠt檢測(cè)結(jié)果

2.2組織病理學(xué)檢查及組織鐵含量檢測(cè)

2.2.1HE染色結(jié)果對(duì)照組角膜表面較光滑，上皮細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞形態(tài)較規(guī)整；結(jié)膜組織上皮細(xì)胞為一薄層細(xì)胞，表面較光滑，排列整齊，細(xì)胞形態(tài)正常；淚腺各小葉及腺泡間散在的細(xì)胞排列緊密，腺泡大小較均一，結(jié)構(gòu)完整，各組織間未見明顯鐵沉積(圖1A1、A2、A3)。低、中、高劑量組角膜淺層上皮表面欠光滑，上皮細(xì)胞排列較紊亂，可見不同程度的上皮缺損(圖1B1、C1、D1)；模型組結(jié)膜上皮不規(guī)整，細(xì)胞排列紊亂，低劑量組可見少量點(diǎn)狀鐵沉積(圖1B2)，中劑量組可見少量團(tuán)塊狀鐵沉積(圖1C2)，高劑量組可見較多團(tuán)塊狀鐵沉積(圖1D2)；低劑量組淚腺細(xì)胞排列稍不規(guī)整，腺泡大小欠均一，可見少量點(diǎn)狀鐵沉積(圖1B3)，中劑量組淚腺細(xì)胞排列紊亂，可見空泡樣變，腺泡大小不均一，可見較多點(diǎn)狀鐵沉積(圖1C3)，高劑量組淚腺細(xì)胞排列紊亂，結(jié)構(gòu)不清晰，可見大量空泡樣變，腺泡大小不均一，可見少量團(tuán)塊狀鐵沉積(圖1D3)。

圖1 各組小鼠角膜、結(jié)膜、淚腺組織HE染色 A:對(duì)照組；B:低劑量組；C:中劑量組；D:高劑量組。

2.2.2普魯士藍(lán)染色結(jié)果對(duì)照組角膜、結(jié)膜及淚腺組織可見極少量藍(lán)色顆粒(圖2A1、A2、A3)，表明正常眼表組織存在少量的鐵沉積。模型組角膜組織可見少量藍(lán)色鐵顆粒(圖2B1、C1、D1)；低劑量組結(jié)膜及淚腺組織可見少量散在被染成藍(lán)色的鐵顆粒(圖2B2、B3)，中劑量組結(jié)膜及淚腺組織可見被染成藍(lán)色的鐵顆?；驁F(tuán)塊，呈梭形或不規(guī)則形(圖2C2、C3)，高劑量組結(jié)膜組織部分視野布滿被染成藍(lán)色的鐵團(tuán)塊(圖2D2)，淚腺組織間可見較多藍(lán)色鐵團(tuán)塊(圖2D3)。

圖2 各組小鼠角膜、結(jié)膜、淚腺組織普魯士藍(lán)染色 A:對(duì)照組；B:低劑量組；C:中劑量組；D:高劑量組。

2.2.3組織鐵含量檢測(cè)結(jié)果對(duì)照組小鼠角膜、結(jié)膜及淚腺組織均含有少量鐵，模型組小鼠各組織鐵含量較對(duì)照組明顯增高，出現(xiàn)鐵過載，且鐵過載程度隨右旋糖酐鐵濃度增加呈逐漸加重趨勢(shì)，與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F角膜=87.489，P角膜<0.001；F結(jié)膜=69.044，P結(jié)膜<0.001；F淚腺=52.054，P淚腺<0.001)，見表5。其中淚腺組織中鐵含量較角膜及結(jié)膜組織中略高，一直呈領(lǐng)先趨勢(shì)，結(jié)膜組織中鐵含量在低劑量組較角膜中高，在中劑量組兩組數(shù)據(jù)接近，在高劑量組中被角膜組織反超?？傊?，正常眼表組織中有一定含量的鐵，通過腹腔注射右旋糖酐鐵，小鼠眼表組織鐵含量明顯逐漸增加，與右旋糖酐鐵濃度呈正相關(guān)，表明眼表鐵過載小鼠模型建立成功。

（2）使用建筑和裝修去完成一體化的設(shè)計(jì)，以及施工，理其在想狀態(tài)下可以說(shuō)是裝修能夠伴隨著主體施工去同步完成的；

表5 各組小鼠角膜、結(jié)膜、淚腺組織鐵含量 (μmol/gprot)

2.3炎癥因子IL-1β和TNF-α及MMP-9的含量ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組角膜、結(jié)膜及淚腺組織中炎癥因子IL-1β含量均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F角膜=48.405，P角膜<0.001；F結(jié)膜=29.466，P結(jié)膜<0.001；F淚腺=112.724，P淚腺<0.001)，見表6；與對(duì)照組相比，模型組各組織中炎癥因子TNF-α含量均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F角膜=57.548，P角膜<0.001；F結(jié)膜=35.345，P結(jié)膜<0.001；F淚腺=97.727，P淚腺<0.001)見表7；與對(duì)照組相比，模型組各組織中炎癥因子MMP-9含量均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F角膜=74.754，P角膜<0.001；F結(jié)膜=58.096，P結(jié)膜<0.001；F淚腺=293.010，P淚腺<0.001)，見表8。IL-1β、TNF-α及MMP-9變化趨勢(shì)與干眼指標(biāo)及炎癥程度的變化趨勢(shì)一致，與右旋糖酐鐵濃度呈正相關(guān)，表明鐵過載狀態(tài)下眼表炎癥反應(yīng)加重。

表6 各組小鼠角膜、結(jié)膜及淚腺組織中IL-1β的含量 (pg/mL)

表7 各組小鼠角膜、結(jié)膜及淚腺組織中TNF-α的含量 (pg/mL)

表8 各組小鼠角膜、結(jié)膜及淚腺組織中MMP-9的含量 (pg/mL)

3 討論

鐵作為人體必需的微量元素之一，參與許多代謝過程并起核心作用[8]。但人體缺乏明確的鐵排泄機(jī)制，隨著年齡的增長(zhǎng)，鐵會(huì)在組織內(nèi)逐漸積累，機(jī)體鐵含量越來(lái)越高。當(dāng)機(jī)體內(nèi)的游離鐵超負(fù)荷(鐵過載)時(shí)，過多的鐵離子通過芬頓反應(yīng)[9]誘發(fā)自由基反應(yīng)，破壞細(xì)胞功能造成機(jī)體損傷；鐵過載形成鐵沉積后，會(huì)造成溶酶體膜破裂，細(xì)胞出現(xiàn)“自殘”現(xiàn)象[10]，因此鐵代謝異常會(huì)引起多種病變的發(fā)生。

既往研究表明，鐵過載會(huì)加重甚至導(dǎo)致年齡相關(guān)性黃斑變性、糖尿病視網(wǎng)膜病變等眼底疾病的發(fā)生[11-12]，而較少有鐵過載與眼表疾病關(guān)系研究的相關(guān)報(bào)道。一項(xiàng)橫斷面對(duì)照研究表明[13]，多次輸血治療的地中海貧血患者中有68.5%出現(xiàn)眼部異常表現(xiàn)，其中干眼占33.3%，且眼部異常與輸血次數(shù)的呈正相關(guān)且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。持續(xù)的輸血治療可以緩解貧血，但會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)鐵的大量沉積，鐵沉積的增加對(duì)眼表及淚腺組織產(chǎn)生毒性效應(yīng)，損傷眼表組織，破壞淚膜穩(wěn)定性，損傷分泌功能，導(dǎo)致淚液分泌減少。

本研究通過定期定量給小鼠腹腔注射右旋糖酐鐵[3,14]，建立鐵過載小鼠模型。注藥后模型組小鼠出現(xiàn)角膜上皮損傷、淚膜穩(wěn)定性變差、SⅠt減少等一系列干眼癥狀，角膜、結(jié)膜及淚腺組織均受到不同程度的損傷。普魯士藍(lán)染色發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠眼表鐵沉積較對(duì)照組小鼠明顯增加，與組織鐵含量檢測(cè)結(jié)果一致。提示腹腔注射右旋糖酐鐵后可造成眼表鐵過載，導(dǎo)致干眼的形成，且隨注藥的濃度及時(shí)間增加，干眼程度逐漸加重。

Handa等[15]研究表明鐵過載可促進(jìn)IL-1β、TNF-α等炎癥因子的表達(dá)，加重炎癥反應(yīng)，而炎癥是干眼發(fā)病的核心機(jī)制。為探尋眼表鐵過載引起干眼的損傷機(jī)制，我們對(duì)炎癥指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠眼表炎癥指數(shù)增加，炎癥程度加重，眼表組織炎癥因子表達(dá)與鐵過載程度呈正相關(guān)，這提示鐵過載引起的干眼損傷機(jī)制可能是鐵沉積增加后引起眼表炎癥反應(yīng)，但其確切的信號(hào)通路尚有待于進(jìn)一步研究。

淚液乳鐵蛋白是淚液蛋白的重要成分之一，研究表明，干眼患者淚液乳鐵蛋白含量明顯下降，與淚液分泌試驗(yàn)和BUT呈正相關(guān)。淚液乳鐵蛋白屬于運(yùn)鐵蛋白，是一種鐵螯合劑，可通過清除眼表游離鐵，抑制炎癥因子分泌，并抑制NF-κB信號(hào)通路，以降低炎癥反應(yīng)，對(duì)維持眼表組織的完整性有重要意義[16]。因此，我們推測(cè)，眼表鐵過載可能通過NF-κB信號(hào)通路加重干眼眼表炎癥反應(yīng)。

綜上所述，我們的研究表明小鼠腹腔注射右旋糖酐鐵，可以引起眼表鐵過載，加重小鼠眼表炎癥，導(dǎo)致小鼠干眼發(fā)生。此研究不僅為貧血患者長(zhǎng)期進(jìn)行輸血治療后出現(xiàn)干眼癥狀提供了合理的解釋，為淚液乳鐵蛋白含量下降引起干眼的損傷機(jī)制及干眼的治療提供了新思路，而且為進(jìn)一步研究鐵過載對(duì)眼表組織造成損害的機(jī)制提供了穩(wěn)定的模型。本研究表明眼表鐵過載可加重干眼眼表炎癥反應(yīng)，但確切的作用機(jī)制及信號(hào)通路需進(jìn)一步研究。