盧波斯，崔丹丹，李志明，袁麗君，沈宏

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院，廣州 510642)

殼聚糖由D-氨基葡萄糖通過(guò)β-1，4-糖苷鍵連接而成，是自然界中唯一存在的堿性多糖，其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征使其具有特殊的生理功能[1]。低聚殼聚糖則是由殼聚糖分解成聚合度在2～20之間的低聚產(chǎn)品[2]。目前，工業(yè)化制備低聚殼聚糖的工藝主要分為化學(xué)法、物理法和生物酶解法。化學(xué)法一般采用酸解法或氧化降解法，但酸解過(guò)程需要在高溫高壓的環(huán)境中進(jìn)行，且會(huì)排放大量酸性環(huán)境污染物[3]，易造成環(huán)境污染；氧化法降解時(shí)容易引起低聚殼聚糖色澤的改變，增加產(chǎn)品提純難度。朱新鋒等[4]通過(guò)撞擊流技術(shù)制備低聚殼聚糖，使得反應(yīng)物黏度下降率達(dá)到67.6%，但通過(guò)物理技術(shù)制備的低聚糖聚合度往往較難控制，且成本相對(duì)較高。相比于其他技術(shù)，生物酶解法是指利用專(zhuān)一性或非專(zhuān)一性的酶蛋白對(duì)殼聚糖進(jìn)行水解[5]，具有非常好的應(yīng)用前景。研究表明，利用殼聚糖酶制備的低聚殼聚糖不僅保留了殼聚糖的生理活性，而且具有更好的水溶性及良好的生物相容性，已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于提高飲品澄清度[6]、改善腸道pH、食品保鮮、生產(chǎn)調(diào)味品、天然防腐劑[7]、抗氧化[8]、降甘油三酯、抗炎[9]、穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化[10]、抵御癌癥[11]等食品及醫(yī)療領(lǐng)域[12]。

殼聚糖酶(EC3.2.1.132)可以高效地水解殼聚糖[13]，其主要來(lái)源于真菌和細(xì)菌，也有少部分存在于植物和病毒中[14]。細(xì)菌類(lèi)以芽孢桿菌屬研究最為深入，真菌類(lèi)主要有曲霉菌、鏈霉菌、淡紫擬青霉、木霉菌屬等，但海洋來(lái)源的菌株相對(duì)較少。酶法制備低聚殼聚糖具有反應(yīng)效率高、產(chǎn)品純度高、后續(xù)分離純化簡(jiǎn)單、環(huán)境友好等優(yōu)勢(shì)[15]。但目前利用生物酶解法制備低聚殼聚糖同樣也面臨著高效產(chǎn)殼聚糖酶原始菌株較少、殼聚糖酶普遍活力低下、菌株產(chǎn)酶周期長(zhǎng)以及純酶價(jià)格昂貴的問(wèn)題。因此，篩選出高效產(chǎn)殼聚糖酶的原始菌株對(duì)未來(lái)大規(guī)模生產(chǎn)制備食品級(jí)低聚殼聚糖至關(guān)重要。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

濱海土壤樣品：海南三亞蝦蟹養(yǎng)殖區(qū)；粉末殼聚糖(脫乙酰度≥95%)：西安百川生物科技有限公司；膠體殼聚糖(脫乙酰度≥85%)：青島博智匯力生物科技有限公司；酵母粉、蛋白胨、瓊脂粉：賽默飛世爾科技公司；氨基葡萄糖鹽酸鹽(分析純)：阿拉丁公司；革蘭氏染色試劑盒：廣東環(huán)凱生物科技有限公司；Green Taq Mix：諾唯贊生物科技股份有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

培養(yǎng)基：富集培養(yǎng)基(g/L)：膠體殼聚糖10.0，硫酸鎂0.5，磷酸氫二鉀0.5，磷酸二氫鉀0.5，蛋白胨3.0，酵母粉0.5，氯化鈉5.0，pH 7.0；初篩培養(yǎng)基(g/L)：膠體殼聚糖10.0，硫酸鎂1.0，磷酸氫二鉀1.0，磷酸二氫鉀1.0，硫酸銨2.0，氯化鈉5.0，瓊脂15.0，pH 7.0；復(fù)篩培養(yǎng)基(g/L)：粉末殼聚糖10.0，硫酸鎂1.0，磷酸氫二鉀2.0，磷酸二氫鉀1.0，硫酸銨4.0，氯化鈉5.0，pH 6.5；種子培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉5.0，蛋白胨10.0，氯化鈉10.0，pH 7.0。

1.2 主要儀器與設(shè)備

UV-2450分光光度計(jì) 日本Shimadzu公司；PCR儀 日本Takara公司；WIX-EP600凝膠電泳儀 韋克斯科技(北京)有限公司；BSD-YX(F)3200恒溫?fù)u床、BPX-82電熱恒溫培養(yǎng)箱、BJ-1CD超凈工作臺(tái) 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；HC-3618R臺(tái)式高速離心機(jī) 中科中佳科學(xué)儀器有限公司；HWS-5A恒溫水浴鍋 上海百典儀器設(shè)備有限公司。

1.3 菌株篩選

1.3.1 富集

將采自海南三亞蝦蟹養(yǎng)殖區(qū)的10 g土壤樣品與90 mL滅菌水混合后置于三角瓶中，180 r/min振蕩1 h，靜置后取1 mL上清液接種于100 mL/250 mL含富集培養(yǎng)基的三角瓶中，在28 ℃、180 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)3 d。

1.3.2 初篩

取富集后的菌液按梯度法稀釋101～107倍，吸取稀釋102～107倍后的溶液100 μL均勻涂布在含初篩固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，在28 ℃條件下恒溫培養(yǎng)3 d，觀察培養(yǎng)皿上菌落生長(zhǎng)狀況，挑取生長(zhǎng)良好、不分泌黏液且具有透明圈的單菌落，在初篩培養(yǎng)基上劃線(xiàn)純化2～3次。

1.3.3 復(fù)篩

挑選透明圈直徑/菌落直徑(D/d)最大的單菌落進(jìn)行復(fù)篩，用接菌環(huán)輕蘸菌苔后接種于100 mL/250 mL含復(fù)篩培養(yǎng)基的三角瓶中，在28 ℃、200 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)30 h。

1.3.4 保存

取復(fù)篩培養(yǎng)基中菌液1 mL接種于100 mL/250 mL含種子培養(yǎng)基的三角瓶中，培養(yǎng)6 h后保存于-80 ℃冰箱中。

1.4 菌株鑒定

1.4.1 菌株形態(tài)學(xué)特征鑒定

取保存菌株在初篩培養(yǎng)基上劃線(xiàn)，30 ℃恒溫培養(yǎng)20 h后用接菌環(huán)挑起少量菌苔于載玻片上，用無(wú)菌水稀釋一定倍數(shù)，明火干燥成膜后依照革蘭氏染色試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行染色，使用光學(xué)顯微鏡觀察菌株形態(tài)。

1.4.2 菌株分子生物學(xué)鑒定

取保存菌株在初篩培養(yǎng)基上劃線(xiàn)，30 ℃恒溫培養(yǎng)30 h后用接菌環(huán)刮取微量菌苔加入到150 μL無(wú)菌水中煮沸10 min，12000 r/min條件下離心10 min，取上清液進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用細(xì)菌16S rDNA 通用引物(正向引物 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 kb/1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。獲得的PCR產(chǎn)物利用1%的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后，交由廣州天一輝遠(yuǎn)基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果提交到NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)，利用BLAST程序搜索同源序列，選出同源性高的菌株的16S rDNA序列為參比對(duì)象，通過(guò)MEGA 7.0 軟件的Neighbor-Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[16]。

1.5 粗酶液制備

發(fā)酵液在12000 r/min、4 ℃條件下離心10 min。上清液即為粗酶液[17]。

1.6 酶活測(cè)定

采用3，5-二硝基水楊酸(DNS)法測(cè)定粗酶液的酶活[18]。取100 μL酶液和900 μL 1%殼聚糖溶液加入至25 mL比色管中，75 ℃下恒溫反應(yīng)10 min后迅速加入1.5 mL DNS溶液，冷卻至室溫后沸水浴5 min顯色，加蒸餾水定容至25 mL；在9000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，取上清液在540 nm處進(jìn)行比色，測(cè)定酶活。

1.7 產(chǎn)酶條件優(yōu)化

1.7.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在復(fù)篩培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上分析單一組分變化對(duì)SH-50菌株產(chǎn)酶活性的影響，影響因素主要包括：碳源的種類(lèi)及濃度、氮源的種類(lèi)及濃度、無(wú)機(jī)鹽的種類(lèi)及濃度、初始發(fā)酵pH、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間。

1.7.2 Plackett-Burman(PB)試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在獲得單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)PB試驗(yàn)，設(shè)計(jì)影響SH-50菌株產(chǎn)酶活性的7個(gè)因素，每個(gè)因素分為高水平(1)和低水平(-1)，挑選置信度≥95%且影響最大的3個(gè)因素進(jìn)行爬坡試驗(yàn)，找到菌株產(chǎn)酶活性的拐點(diǎn)。PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 PB試驗(yàn)不同因素及水平設(shè)計(jì)Table 1 Design of different factors and levels of PB test

1.7.3 Box-Behnken Design(BBD)試驗(yàn)設(shè)計(jì)

設(shè)計(jì)BBD試驗(yàn)(見(jiàn)表2)，并將結(jié)果輸入Design Expert V8.0.6軟件構(gòu)建回歸模型，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差及可信度分析，根據(jù)所得最優(yōu)產(chǎn)酶活性的編碼水平進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，驗(yàn)證回歸模型與實(shí)際產(chǎn)酶活性之間的相關(guān)性。

表2 BBD試驗(yàn)不同因素及水平設(shè)計(jì)Table 2 Design of different factors and levels of BBD test

2 結(jié)果和分析

2.1 菌株形態(tài)學(xué)鑒定

圖1 SH-50菌株的形態(tài)學(xué)鑒定Fig.1 Morphological identification of SH-50 strain

土壤樣品在28 ℃條件下?lián)u瓶富集3 d后，經(jīng)篩選得到一株產(chǎn)殼聚糖酶菌株，由圖1中a可知，菌落呈乳白色，能夠降解殼聚糖，將其標(biāo)記為SH-50。挑取圖1中a的SH-50單菌落在唯一碳源為殼聚糖的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)生長(zhǎng)2 d，由圖1中b可知，菌落為邊緣規(guī)則的圓形，菌苔呈乳白色，微隆起，表面光滑，易挑起，有明顯的殼聚糖水解圈。刮取微量圖1中b的菌苔進(jìn)行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察，結(jié)果見(jiàn)圖1中c，細(xì)菌呈短棒狀，革蘭氏染色結(jié)果為陰性。

2.2 菌株的生理生化特征

將SH-50菌株與模式菌株M.chitosanitabida3001的生理生化特性進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 SH-50菌株的生理生化性質(zhì)Table 3 Physiological and biochemical properties of SH-50 strain

由表3可知，SH-50菌株的生理生化特征與模式菌株基本相同，但適宜生長(zhǎng)溫度、pH及檸檬酸試驗(yàn)存在一定差異，可能是因?yàn)樯L(zhǎng)環(huán)境不同，菌株生理生化性質(zhì)有所改變，同時(shí)也表明SH-50菌株可能是松江菌屬潛在的新種。

2.3 分子生物學(xué)鑒定

利用16S rDNA通用引物對(duì)SH-50菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，對(duì)6個(gè)重復(fù)樣進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)，產(chǎn)物長(zhǎng)度約為1500 bp，結(jié)果見(jiàn)圖2。

將PCR產(chǎn)物送至廣州天一輝遠(yuǎn)基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，將得到的序列在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)上進(jìn)行BLAST比對(duì)后發(fā)現(xiàn)SH-50與Mitsuariasp.菌株同源性最高。其系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)見(jiàn)圖3，根據(jù)16S rDNA序列，可以將Mitsuariasp.分為4簇，其中SH-50與Mitsuariastrain II3親緣關(guān)系最近，位于同一簇的不同分支，因此將其命名為Mitsuariasp. SH-50，菌株16S rDNA上傳至GenBank，編號(hào)為MW911724。

2.4 菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)酶曲線(xiàn)的測(cè)定

取保存的SH-50菌株接入種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，按1%的接種量轉(zhuǎn)接至100 mL/250 mL含復(fù)篩培養(yǎng)基的三角瓶中，在28 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)，每隔3 h取樣測(cè)定菌液OD600、菌液酶活，結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4可知，SH-50菌株在生長(zhǎng)6 h左右時(shí)逐漸從對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)入穩(wěn)定期，繼續(xù)生長(zhǎng)至12～24 h時(shí)，OD600繼續(xù)增加，此時(shí)菌體分泌大量代謝產(chǎn)物，在24～30 h時(shí)OD600開(kāi)始下降，表明培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不足，菌體密度下降。SH-50菌株的產(chǎn)酶曲線(xiàn)與生長(zhǎng)曲線(xiàn)呈一定程度上的正相關(guān)，從OD540對(duì)應(yīng)的產(chǎn)酶曲線(xiàn)可以看出，產(chǎn)酶活性在12 h時(shí)達(dá)到最高值，但隨著時(shí)間增加，酶液活性逐漸開(kāi)始下降。因此，選取12 h作為該菌株最佳的發(fā)酵產(chǎn)酶時(shí)間。

2.5 培養(yǎng)基單因素變化對(duì)SH-50菌株產(chǎn)酶的影響

2.5.1 碳源對(duì)SH-50菌株產(chǎn)酶活性的影響

碳源主要在微生物生長(zhǎng)代謝時(shí)為其提供細(xì)胞碳架，提供微生物生命活動(dòng)所需的能量，同時(shí)為合成產(chǎn)物提供碳架，是細(xì)胞正常生長(zhǎng)以及分裂的物質(zhì)基礎(chǔ)。該研究分別以殼聚糖、蔗糖、葡萄糖、淀粉、纖維素作為SH-50菌株的唯一碳源，探究不同碳源對(duì)該菌株產(chǎn)殼聚糖酶活性的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 不同碳源及殼聚糖濃度對(duì)SH-50菌株產(chǎn)酶活性的影響Fig.5 Effects of different carbon sources and chitosanase concentrations on enzyme production activity of SH-50 strain

由圖5中a可知，SH-50菌株在碳源為殼聚糖時(shí)產(chǎn)酶活性較高，碳源為其他糖類(lèi)時(shí)該菌株幾乎不產(chǎn)殼聚糖酶。為明確殼聚糖濃度對(duì)SH-50菌株產(chǎn)酶活性的影響，分別設(shè)置粉末殼聚糖濃度為3，5，7，9，11，13 g/L，由圖5中b可知，隨著殼聚糖濃度的增加，SH-50菌株產(chǎn)殼聚糖酶活性呈先上升后下降的趨勢(shì)，在殼聚糖濃度較低時(shí)，酶活性上升趨勢(shì)明顯，當(dāng)殼聚糖濃度達(dá)到9 g/L時(shí)，酶活性明顯下降。最適的殼聚糖濃度應(yīng)在7～8 g/L，因此，選取中間值7.5 g/L作為SH-50菌株發(fā)酵的殼聚糖濃度。

2.5.2 氮源對(duì)SH-50菌株產(chǎn)酶活性的影響

氮源主要用于菌體細(xì)胞物質(zhì)(氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸等)和含氮代謝物的合成，同樣也是微生物生長(zhǎng)不可或缺的物質(zhì)，許多功能微生物也常常被用于水體氮污染的凈化。在設(shè)置等量氮的前提下，該研究分別選用蛋白胨、酵母粉、硫酸銨、尿素、硝酸鉀、牛肉浸膏作為SH-50菌株的唯一氮源，然后進(jìn)一步確定最佳氮源的添加濃度，結(jié)果見(jiàn)圖6。

由圖6中a可知，在不同氮源培養(yǎng)條件下，SH-50菌株的唯一氮源為硫酸銨和酵母粉時(shí)菌株產(chǎn)酶活性較高，然而硫酸銨在培養(yǎng)基中易造成粉末殼聚糖析出，因此選用酵母粉作為SH-50菌株的最適氮源。由圖6中b可知，不同濃度的酵母粉對(duì)SH-50菌株所產(chǎn)殼聚糖酶的酶活性具有一定影響，酵母粉濃度小于1 g/L時(shí)，菌株產(chǎn)酶活性隨濃度增加而增加，酵母粉濃度在1～2 g/L時(shí)菌株產(chǎn)酶活性變化不大，綜合經(jīng)濟(jì)因素，選取1 g/L作為SH-50菌株發(fā)酵的酵母粉濃度。

圖6 不同氮源及酵母粉濃度對(duì)SH-50菌株產(chǎn)酶活性的影響Fig.6 Effects of different nitrogen sources and yeast powder concentrations on enzyme production activity of SH-50 strain

2.5.3 無(wú)機(jī)鹽對(duì)SH-50菌株產(chǎn)酶活性的影響

無(wú)機(jī)鹽中的各類(lèi)離子同樣是菌體細(xì)胞的組成成分之一，同時(shí)也可以作為酶的組成部分、酶的激活劑或抑制劑[19]，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透壓、pH、氧化還原電位等功能。該研究主要分析常規(guī)無(wú)機(jī)鹽氯化鈉及磷酸氫二鉀的濃度對(duì)SH-50菌株產(chǎn)酶活性的影響，結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 不同無(wú)機(jī)鹽及其濃度對(duì)SH-50菌株產(chǎn)酶活性的影響Fig.7 Effects of different inorganic salts and their concentrations on enzyme production activity of SH-50 strain

由圖7中a可知，隨著氯化鈉濃度的增加，SH-50菌株產(chǎn)殼聚糖酶活性呈先上升后下降的趨勢(shì)，這表明在一定濃度范圍內(nèi)，氯化鈉的濃度對(duì)菌株產(chǎn)酶具有一定激活效應(yīng)。由圖7中b可知，隨著磷酸氫二鉀濃度的增加，SH-50菌株所產(chǎn)殼聚糖酶的酶活性呈先上升后平穩(wěn)的趨勢(shì)，表明磷酸根離子和鉀離子在一定濃度范圍內(nèi)可以促進(jìn)SH-50菌株產(chǎn)酶，但隨著離子濃度的增加，酶活性無(wú)明顯變化。由圖7中c可知，硫酸鎂濃度低于1 g/L時(shí)對(duì)菌株產(chǎn)酶具有一定正激活效應(yīng)，但隨著濃度的繼續(xù)增加，菌株產(chǎn)酶活性逐漸降低。

2.5.4 初始pH及發(fā)酵溫度對(duì)SH-50菌株產(chǎn)酶活性的影響

該研究分析了發(fā)酵液初始pH和溫度對(duì)SH-50菌株產(chǎn)酶活性的影響，結(jié)果見(jiàn)圖8。

圖8 不同初始pH和溫度對(duì)SH-50菌株產(chǎn)酶活性的影響Fig.8 Effects of different initial pH values and temperatures on enzyme production activity of SH-50 strain

由圖8中a可知，初始pH在5.0～6.5范圍內(nèi)時(shí)，SH-50菌株產(chǎn)殼聚糖酶活性隨pH的增大而增大，pH在6.5以上時(shí)，SH-50菌株產(chǎn)酶活性逐漸開(kāi)始降低，故選取pH為6.5作為該菌株初始發(fā)酵pH。由圖8中b可知，發(fā)酵溫度在25～30 ℃范圍內(nèi)時(shí)，SH-50菌株產(chǎn)殼聚糖酶活性隨溫度升高而增加，在30 ℃以上時(shí)，SH-50菌株產(chǎn)酶活性開(kāi)始顯著下降，故選取30 ℃作為該菌株的發(fā)酵溫度。

2.6 響應(yīng)面優(yōu)化產(chǎn)酶試驗(yàn)

2.6.1 PB試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

PB試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4，試驗(yàn)回歸及方差分析見(jiàn)表5。

表4 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Plackett-Burman experiment design and results

表5 Plackett-Burman試驗(yàn)回歸及方差分析Table 5 Plackett-Burman test regression and variance analysis

由表5可知，(A)初始pH、(B)發(fā)酵溫度、(C)殼聚糖濃度、(G)發(fā)酵時(shí)間4個(gè)因素的P<0.05，表明這4個(gè)因素對(duì)SH-50菌株產(chǎn)酶活性具有顯著的影響，效應(yīng)大小依次為A>B>C>G，因此選取A(初始pH)、B(發(fā)酵溫度)、C(殼聚糖濃度)3個(gè)因素做最陡爬坡試驗(yàn)。

2.6.2 最陡爬坡試驗(yàn)

根據(jù)3個(gè)因素的效應(yīng)值合理設(shè)計(jì)原點(diǎn)及步長(zhǎng)，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 Design and results of steepest climbing test

續(xù) 表

由表6可知，隨著殼聚糖濃度的增加、初始pH的增加、溫度的降低，SH-50菌株所產(chǎn)酶活性先升高后降低，其中項(xiàng)目4達(dá)到最高值，為爬坡試驗(yàn)的拐點(diǎn)，因此將試驗(yàn)項(xiàng)目4作為BBD試驗(yàn)的中心值，進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.6.3 響應(yīng)面結(jié)果及方差分析

在最陡爬坡試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以(A)初始pH、(B)發(fā)酵溫度、(C)殼聚糖濃度作為3個(gè)因素，殼聚糖酶活作為響應(yīng)值設(shè)計(jì)響應(yīng)面分析，利用Design Expert V8.0.6軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表7，構(gòu)建的響應(yīng)面回歸模型為：Y=24.08+0.36A+2.41B+0.25C-0.67AC-0.88BC-10.01A2-7.02B2-6.44C2。

表7 Box-Behnken試驗(yàn)數(shù)據(jù)及結(jié)果Table 7 Box-Behnken test data and results

分別對(duì)模型的方差和顯著性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 Box-Behnken試驗(yàn)回歸模型方差分析Table 8 Variance analysis of Box-Behnken test regression model

續(xù) 表

回歸模型P<0.0001，表明回歸方程擬合顯著，失擬項(xiàng)的P不顯著，說(shuō)明模型誤差較小。模型的決定系數(shù)R2=0.9955，修正系數(shù)RAdj2=0.9896，說(shuō)明試驗(yàn)數(shù)據(jù)變化可以用該模型來(lái)解釋且模型顯著性較好。

2.6.4 響應(yīng)面因素之間的交互作用

運(yùn)用響應(yīng)面Design Expert V8.0.6軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合，得到影響SH-50菌株產(chǎn)酶活性?xún)梢蛩刂g的等高線(xiàn)圖及三維立體圖，并由此判斷交互影響程度，結(jié)果見(jiàn)圖9。

圖9 發(fā)酵溫度、初始pH、殼聚糖濃度兩兩因素對(duì)SH-50菌株 產(chǎn)酶影響的等高線(xiàn)圖及響應(yīng)面三維圖Fig.9 Contours and response surface 3D diagrams of the effects of interaction of fermentation temperature, initial pH and chitosan concentration on enzyme production of SH-50 strain

由圖9中a的等高線(xiàn)圖可知，(B)發(fā)酵溫度和(A)初始pH兩因素交互作用并不明顯，由圖9中a的三維立體圖可知，隨著發(fā)酵溫度和初始pH的增高，SH-50菌株所產(chǎn)殼聚糖酶的酶活先升高后降低，存在中心最大值，中心點(diǎn)即兩因素之間的最適條件。由圖9中b的等高線(xiàn)圖可知，(A)初始pH和(C)殼聚糖濃度兩因素之間交互作用不明顯，同樣存在條件中心點(diǎn)。由圖9中c的等高線(xiàn)圖可知，(B)發(fā)酵溫度和(C)殼聚糖濃度兩因素存在明顯交互作用，同樣存在條件中心點(diǎn)。綜上可知，在pH 6.5～7.0、溫度30～31 ℃、殼聚糖濃度7.5～8 g/L的范圍內(nèi)，存在3個(gè)因素間最優(yōu)產(chǎn)酶條件。

2.6.5 回歸模型的驗(yàn)證

響應(yīng)面預(yù)測(cè)SH-50菌株產(chǎn)酶活性最高的條件為：初始pH 6.77，發(fā)酵溫度30.52 ℃，殼聚糖濃度7.52 g/L，預(yù)測(cè)酶活為24.29 U/mL。實(shí)際試驗(yàn)中設(shè)置初始pH 6.75，發(fā)酵溫度30.5 ℃，殼聚糖濃度7.52 g/L，重復(fù)3次試驗(yàn)測(cè)得平均酶活為26.6 U/mL，與預(yù)測(cè)值較為接近，說(shuō)明該模型具有較高可信度。

3 結(jié)果與討論

殼聚糖酶的概念是由Shimosaka等在1973年首次提出，于2004年被國(guó)際生物化學(xué)酶學(xué)委員會(huì)命名為殼聚糖酶(EC3.2.1.132殼聚糖N-乙酰氨基葡萄糖水解酶)。該研究從海南三亞蝦蟹養(yǎng)殖區(qū)土壤中篩選到一株高效產(chǎn)殼聚糖酶的菌株SH-50，結(jié)合菌株的生理生化特性及16S rDNA序列，初步鑒定該菌株為松江菌屬，Mitsuariasp.是2005年建立的一個(gè)新屬，歸屬β-變形菌門(mén)[20]，最早在日本松江市被發(fā)現(xiàn)。

響應(yīng)面分析法(RSM)是一種優(yōu)化生物發(fā)酵過(guò)程的綜合技術(shù)，能夠?qū)ξ⑸锇l(fā)酵影響因素及水平的交互作用進(jìn)行較好的優(yōu)化和評(píng)價(jià)[21]，本研究通過(guò)響應(yīng)面法對(duì)該菌株產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，得到的最佳發(fā)酵條件為：殼聚糖濃度7.52 g/L，氯化鈉4.0 g/L，硫酸鎂1.0 g/L，磷酸氫二鉀4.0 g/L，溫度30.5 ℃，初始pH 6.75，裝液量100 mL/250 mL，接種量1%，在180 r/min條件下發(fā)酵12 h，粗酶液酶活為26.6 U/mL，優(yōu)化后的產(chǎn)酶活性較初始產(chǎn)酶活性提高了5.3倍。目前Mitsuariasp.菌屬的菌株主要應(yīng)用在生物防治及生物修復(fù)等領(lǐng)域，在殼聚糖酶領(lǐng)域的研究并不多，胡遠(yuǎn)亮等[22]對(duì)Mitsuariasp. 141-2菌株的突變株進(jìn)行產(chǎn)酶優(yōu)化后，得到的殼聚糖酶活性為3.631 U/mL。張馨月等[23]通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化了一株產(chǎn)殼聚糖酶的淡紫紫孢菌的發(fā)酵條件，得到其發(fā)酵5.5 d時(shí)的殼聚糖酶活為16.80 U/mL。孫玉英等[24]通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化Cellulophagasp. M5菌株的產(chǎn)酶條件，使其在發(fā)酵84 h后產(chǎn)酶活性達(dá)到6.67 U/mL。相比其他菌株，該研究中的SH-50菌株產(chǎn)酶活性達(dá)到26.6 U/mL，且產(chǎn)酶周期僅為12 h，產(chǎn)酶效率高。值得注意的是，大多數(shù)殼聚糖酶屬于誘導(dǎo)酶，所以將殼聚糖作為碳源時(shí)需合理考慮其使用濃度，黏度過(guò)高易產(chǎn)生大量氣泡從而成為大規(guī)模發(fā)酵中的限制因素，SH-50菌株產(chǎn)酶培養(yǎng)基中殼聚糖的濃度僅為7.52 g/L，酵母粉僅為1.0 g/L，不僅培養(yǎng)基黏度低，而且所需原料成本低。其次，SH-50菌株最適產(chǎn)酶溫度為30.5 ℃，pH為6.75，發(fā)酵條件溫和且易實(shí)現(xiàn)。因此，SH-50菌株已經(jīng)具有工業(yè)化的應(yīng)用能力。

生物酶解法制備低聚殼聚糖的過(guò)程既不存在環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)也不會(huì)引入對(duì)人體有害的物質(zhì)，是工業(yè)化生產(chǎn)食品級(jí)低聚殼聚糖的首選。馮林慧等[25]將殼聚糖作為一種天然防腐劑對(duì)食品中容易滋生的李斯特菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、白色假絲酵母及黑曲霉進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)一定濃度的殼聚糖具有良好的抑菌效果，且對(duì)綠膿桿菌的抑制效果最為明顯。劉安等[26]使用殼聚糖作為羅漢果及陳皮浸提液的脫色劑，發(fā)現(xiàn)低濃度的殼聚糖具有良好的脫色功能，可以顯著提高浸提液的透光率及色度。蘇維發(fā)等[27]發(fā)現(xiàn)在豬飼料中添加微量的低聚殼聚糖可以提高豬機(jī)體的免疫力、抗氧化功能、腸道黏膜形態(tài)，進(jìn)而改善豬肉品質(zhì)。盡管低聚殼聚糖的聚合度、分子量、水溶性、生物活性均優(yōu)于殼聚糖[28]，但目前仍不能確定其中單一組分的具體功能。新型生物酶制劑的開(kāi)發(fā)研究有望為日后生產(chǎn)特定功能的食品添加劑提供一定的理論依據(jù)。