嵇芳芳 金吉 梁亞

糖尿病作為一種損害機體多器官及組織的慢性內(nèi)分泌疾病，屬于全球性問題。目前我國的糖尿病患者數(shù)量位列全球首位，且發(fā)病率逐年提升[1]。視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)細胞是眼球部一種獨特的上皮細胞，其能夠直接轉運葡萄糖分子為視網(wǎng)膜神經(jīng)感覺層細胞提供能量，RPE細胞作為視網(wǎng)膜的外屏障，因此極易受到血糖水平波動的影響，進而發(fā)生病理和功能的改變[2]。長期處于高糖環(huán)境下的糖尿病患者，機體高濃度糖刺激容易誘導RPE細胞因產(chǎn)生過多氧自由基而造成氧化應激損傷，RPE 細胞功能會出現(xiàn)紊亂受損，造成視網(wǎng)膜神經(jīng)感覺層能量供給障礙進而導致多種視網(wǎng)膜病變[3]。糖尿病性視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy, DR)作為最常見的 I 和II型糖尿病微血管嚴重的并發(fā)癥，是由血糖增高導致的視網(wǎng)膜血管通透性增加導致患者出現(xiàn)糖尿病黃斑水腫(diabetic macularedema,DME)，是視力喪失的最常見病因。目前糖尿病性視網(wǎng)膜病變已經(jīng)成為全球成年人的主要致盲性眼部疾病，嚴重影響眼盲患者的日常生活[4]。盡管大量研究探索了DR的病因學及病理學，但是對DR治療方案仍有待進步，需要進一步研究創(chuàng)新性藥物和治療靶標，以期改善DR患者預后。

人臍帶間充質干細胞(human umbilical mesenchymal stem cells，hUMSCs)是具有自我更新和多向分化潛能的成體干細胞，能夠分泌各種生長因子在免疫抑制，炎癥調節(jié)和組織損傷修復中起重要作用。已有研究嘗試將hUMSCs應用于針對DR的治療中[5]。外泌體是由多種活細胞分泌到細胞外直徑約30～100 nm的小囊泡，具有雙層脂質膜性結構，可以攜帶蛋白、核酸及脂質等生物活性分子作用到靶細胞調控各種生理功能。有研究證明來源于hUMSCs的外泌體在生物表型上與來源細胞一致保持，并且可以作為細胞間運載體將所攜帶的核酸及蛋白質等生物活性物質帶到受體細胞/靶細胞中發(fā)揮調控作用，影響受體細胞/靶細胞的生理生化反應，顯示出具有治療多種疾病的潛在能力[6]。值得特別注意的是，在移植hUMSCs入人體內(nèi)后往往會發(fā)生不良分化，尤其是具有可能導致機體局部成瘤的風險，而移植時采用hUMSCs來源的外泌體則可以大大降低這種不良分化以及成瘤的風險。因此，hUMSCs來源外泌體在疾病治療方面比hUMSCs細胞治療風險更小，應用治療范圍更廣[7]。本實驗中，通過觀察hUMSCs來源的外泌體對高糖作用下的RPE細胞的抗凋亡功能及分子機制方面進行探討。

資料與方法

一、實驗材料

實驗研究。hUMSCs購自上海中喬新舟生物科技有限公司，人RPE細胞(ARPE-19)購自美國ATCC公司；干細胞培養(yǎng)基、Dulbecco Eagle 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清購自上海培元公司，去外泌體胎牛血清(Exo-FBS )購自SBI公司(美國)；相關一抗均購自Santa Cruz公司，辣根過氧化物酶( HRP ) 標記抗兔、抗鼠二抗購自美國CST公司。PVDF硝酸纖維素膜 (美國 Millipore)，DAPI (美國life)，蛋白酶、磷酸酶抑制劑(Takara)，ECL增強化學發(fā)光試劑盒 (南京諾唯贊生物技術有限公司)，CCK8檢測試劑 (上海碧云天生物技術有限公司)，低溫超速離心機(美國Beckman公司)。

二、蛋白提取及蛋白質免疫印記(Western blot)

收集細胞，冷PBS 洗兩遍后離心細胞沉淀，去上清加入適量的RIPA裂解液 (使用前加入蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑)，放置于冰上反應10～20 min，期間斡旋震蕩10～15 s以完成細胞裂解。12000 g，4 ℃離心10 min，取適量上清移至新的離心管；用 BCA 蛋白濃度測定法檢測上清蛋白濃度，將6X上樣緩沖液和上清適量混合均勻，95 ℃加熱5 min后進行SDS電泳分離；當溴酚藍泳至膠板底部附近時停止，取下凝膠進行轉膜(電壓100 V 50 min)，結束后輕輕取出 PVDF 膜用2%BSA封閉1 h后進行一抗孵育過夜(4 ℃)。PVDF 膜用PBST清洗3次后孵育HRP連接二抗稀釋液1 h，最后用ECL檢測液顯影。

三、外泌體提取分離

收集hUMSCs的培養(yǎng)上清液，進行一系列梯度離心去除細胞碎片(300 g，5 min；2000 g，20 min)；去除大囊泡(12000 g離心40 min)。把上清液通過0.22 μm的過濾器(Millipore)，100000 g 4 ℃超速離心3 h(L-80XP超速離心機)。用PBS重懸沉淀，再次在100000 g超速離心3 h(4 ℃)，將沉淀顆粒重新懸浮在PBS中用于后續(xù)實驗。

四、透射電鏡(TEM)

將外泌體用2.5%的戊二醛在0.1M的緩沖液中重新懸浮，并在室溫下固定在碳涂層的銅網(wǎng)格上30 min，然后用2%的鈾酰鹽負染1～2 min，用清水洗一次室溫晾干。使用透射電子顯微鏡(JEM-2100)獲取圖像。

五、納米顆粒追蹤分析檢測(NTA)

使用納米顆粒跟蹤分析儀器(ZetaView，德國)對外泌體的數(shù)量和尺寸大小進行檢測。簡言之：將溶液中的外泌體用PBS稀釋后上機檢測，根據(jù)稀釋系數(shù)確定其相對濃度。用NTA 2.2軟件進行數(shù)據(jù)分析。每個樣品進行至少4個單獨的計數(shù)，并對計數(shù)進行平均。

六、細胞增殖檢測(CCK-8)

將ARPE-19細胞接種在96孔板貼壁24 h后，根據(jù)實驗設置分別進行5.6 mmol/L、30 mmol/L、30 mmol/L+外泌體處理后，分別孵育24 h、48 h和72 h后按照操作說明在每孔中加入10 μl的CCK-8試劑，將96孔板放回37 ℃培養(yǎng)箱中孵育4 h后，用酶標儀在450 nm處進行測定，后根據(jù)公式計算細胞的活力。

七、EdU試驗、流式細胞術檢測細胞增殖

取狀態(tài)良好的ARPE-19細胞，以不同濃度葡萄糖培養(yǎng)，分組分別為：5.6 mmol/L處理組，30 mmol/L處理組，30 mmol/L+外泌體處理組；每組設置3個重復，24 h后收集細胞，用流式細胞儀檢測并分析細胞周期變化；參考銳博EdU試劑盒說明書對細胞進行孵育、固定、通透等處理，染色完成后加PBS緩沖液避光保存，在熒光顯微鏡下觀察。

八、統(tǒng)計學分析方法

結 果

一、 hUMSCs外泌體的分離及鑒定

培養(yǎng)hUMSCs并收集其上清進行差速離心去除hUMSCs的碎片及細胞外大囊泡后，利用超速離心分離得到細胞外泌體。透射電鏡下可見hUMSCs來源外泌體為直徑在30～100 nm之間圓形或橢圓形具有明顯膜結構的小囊泡，囊泡腔內(nèi)可見低電子密度成分(圖1A)，納米顆粒追蹤分析(NTA)也證實了提取的hUMSCs外泌體形態(tài)和粒徑大小符合外泌體特征(圖.1B)。另外，運用蛋白質免疫印記( Westernblot )檢測發(fā)現(xiàn)：間充質干細胞外泌體表達外泌體特異蛋白Alix、CD63及CD9，提示超速離心法能夠獲得純度較高的hUMSCs外泌體。

圖1 A：提取分離hUMSCs外泌體，固定負染后進行電鏡成像 (比例尺：100 nm) B：NTA檢測hUMSCs外泌體數(shù)量和尺寸大小分布 C：hUMSCs外泌體進行western bolt鑒定外泌體標志蛋白Alix, CD63,CD9 圖2 A：對貼壁ARPE-19細胞進行5.6 mmol/L，30 mmol/L，30 mmol/L+外泌體分別處理0 h、24 h、48 h和72 h后，用CCK 8試劑盒檢測細胞在450 nm處吸光值，每個處理至少進行3次生物學重復取平均值 B：貼壁ARPE-19細胞進行5.6 mmol/L，30 mmol/L，30 mmol/L+外泌體處理48 h后加入稀釋好的EdU試劑，PBS清洗3次后固定，DAPI染細胞核，熒光顯微鏡下獲取細胞圖片(比例尺：200 μm) C：對5.6 mmol/L，30 mmol/L，30 mmol/L+外泌體處理的ARPE-19細胞提取蛋白，用western bolt檢測細胞周期蛋白E和D1

二、hUMSCs外泌體對高糖培養(yǎng)下ARPE-19細胞的增殖影響。

首先，通過CCK-8實驗檢測不同糖濃度(5.6 mmol/L，30 mmol/L，30 mmol/L+外泌體)處理相應時間后，發(fā)現(xiàn)高糖培養(yǎng)顯著抑制RPE細胞的增殖，而高糖+外泌體處理組細胞增殖能力恢復到正常水平，外泌體的添加緩解了高糖培養(yǎng)誘導的ARPE-19細胞損傷(圖2A)。同時，EdU實驗表明高糖造成的增殖抑制同樣能被間充質干細胞外泌體逆轉(圖2B)。另外，如圖2C所示，當細胞增殖被高糖環(huán)境抑制時，周期蛋白E、D1顯著減少；間充質干細胞外泌體恢復高糖降低的ARPE-19細胞周期蛋白E、D1到正常水平?？偨Y來說，hUMSCs外泌體能夠促進ARPE-19細胞的增殖從而降低高糖培養(yǎng)造成的細胞損傷。

三、hUMSCs外泌體對高糖培養(yǎng)下ARPE-19細胞的抗凋亡作用

在高糖培養(yǎng)條件下，我們發(fā)現(xiàn)，ARPE-19細胞內(nèi)的caspase3發(fā)生切割，Bcl-2受高糖影響減少，而hUMSCs外泌體能抑制caspase3切割體的產(chǎn)生，阻止Bcl-2的減少，降低了高糖培養(yǎng)誘導的細胞凋亡(圖3A)。同樣，流式細胞儀檢測證明hUMSCs外泌體顯著降低高糖誘導的細胞凋亡率(20～30%)(圖3B)。表明hUMSCs外泌體能夠保護人RPE細胞抵抗高糖誘導的細胞凋亡。

圖3 A：提取分別用5.6 mmol/L，30 mmol/L，30 mmol/L+外泌體處理的ARPE-19細胞蛋白，通過蛋白質免疫印跡檢測caspase3/cleaved-caspase3/Bax/Bcl-2蛋白的變化 B：收集5.6 mmol/L，30 mmol/L，30 mmol/L+外泌體處理48 h的ARPE-19細胞，用流式細胞儀檢測細胞凋亡率

討 論

處于視網(wǎng)膜最外單層的RPE細胞，它不僅可以吸收陽光，提供給視網(wǎng)膜外層營養(yǎng)，還可以維持光感受器的新陳代謝功能，除此之外，還參與視覺循環(huán)和細胞因子的分泌。因此,RPE對視網(wǎng)膜光感受器的維持至關重要。一些糖尿病患者由于長期處于高糖環(huán)境下，會誘發(fā)RPE出現(xiàn)缺血、炎癥激活及氧化應激等病理改變,最終導致DR[1，8]。

由于DR的發(fā)病率和流行率在全球范圍內(nèi)不斷上升，有效的治療藥物研發(fā)及其調控機制研究迫在眉睫。間充質干細胞(MSCs)一類具有多方向分化潛能的干細胞，多存在于骨髓和脂肪等多種組織中的。其中，源于人臍帶的華通氏膠組織的hUMSCs，制備產(chǎn)量高，其具有抗炎、調節(jié)免疫、免疫反應低、容易體外分離和細胞可連續(xù)傳代培養(yǎng)等優(yōu)點，是有希望用于治療各種疾病的一類活細胞工具[7]。但有些研究結果表明，hUMSCs移植后會分化為癌相關成纖維細胞，易增強腫瘤細胞生長和侵襲力，甚至能夠促進癌細胞增殖成瘤和遷移，另外還可促血管生成，誘導細胞抗凋亡和耐藥性的產(chǎn)生[7][9]。來源于hUMSCs的外泌體不具有其母源細胞特點，還可以降低由于MSCs移植帶來的不良分化致瘤等風險，具有開發(fā)為治療疾病的潛力。另外，在體外進行培養(yǎng)MSCs過程中，其外泌體分泌與其他相比量多，易于提取和儲存[10，11]。因此本實驗選擇了優(yōu)點較多的hUMSCs來提取外泌體。在此研究中，我們首先成功的從hUMSCs細胞培養(yǎng)上清液中提取了外泌體，并經(jīng)過NTA和電鏡檢測提取的外泌體形態(tài)和體積符合其定義[12]，并通過western blot對外泌體標記物CD63、CD9和Alix進行鑒定，證實外泌體提取成功，其成分可靠。目前認為差異超速離心法是在提取外泌體實驗中最常用的方法，具有提取樣品容量大，提取成本低等優(yōu)點。

源于hUMSCs的外泌體包含有蛋白質、脂類、mRNA、microRNA等成分，可將遺傳信息傳遞給受體細胞，從而改變受體細胞內(nèi)遺傳物質的轉錄和翻譯的過程,調整細胞內(nèi)蛋白質的修飾和定位，調控信號通路等方式來影響細胞的生理生化功能。Xiao Li等[13]將來源于人臍帶間充質干細胞的外泌體應用于治療體內(nèi)及體外嚴重燒傷誘導的過度炎癥實驗研究，揭示了hUMSCs外泌體通過抑制TLR4和NF-κB信號通路從而抑制了炎癥應答，緩解了嚴重燒傷導致的過度炎癥。Ruenn等[14]研究結果表明，間充質干細胞來源的外泌體通過利用補充蛋白質來緩解心臟再灌注損傷，緩解缺血性心臟病癥。在本實驗的功能和機制研究中,我們發(fā)現(xiàn)，與正常葡萄糖濃度組(5.6 mmol/L)以及高糖組(30 mmol/L)相比，在高糖損傷環(huán)境下，hUMSCs來源的外泌體可顯著提高細胞ARPE-19的活性，且能夠促進cyclin E和cyclin D1在高糖作用下的表達；同時，這種外泌體可顯著降低高糖損傷環(huán)境下ARPE-19細胞凋亡率，抑制高糖所誘導的凋亡蛋白如cleaved-caspase3及Bax的產(chǎn)生。我們的結果表明,hUMSCs來源的外泌體在治療DR方面具備一定的潛在價值,具備成為未來治療DR的一種新的手段。接下來的工作需要對hUMSCs來源的外泌體所包含的發(fā)揮特定效應的分子進行鑒定和研究。