李藝養(yǎng)，羅鴻偉，田 川，馬國達，陳日玲（.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，廣東湛江 54000；.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬順德婦女兒童醫(yī)院兒科，廣東佛山 58300）

阿霉素（Dox）廣泛應(yīng)用于治療兒童白血病、淋巴瘤等多種惡性腫瘤，由于使用頻率及劑量較高，容易導(dǎo)致體內(nèi)的蓄積，可致多種毒副作用，其中最明顯的毒副作用是心臟毒性，甚至10 % 的患者在化療結(jié)束后15 a內(nèi)會出現(xiàn)癥狀性心肌病[1]。國內(nèi)外已證實外泌體對心血管疾病有損傷修復(fù)作用[2]。本研究旨在探索臍帶血間充質(zhì)干細胞源性的外泌體逆轉(zhuǎn)阿霉素誘導(dǎo)的心肌細胞損傷及其潛在的機制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

臍帶間充質(zhì)干細胞購自蘇州賽業(yè)生物科技有限公司；AnnexinV-FIFC/PI 細胞凋亡試劑盒購自美國 BD 公司；Bcl-2 antibody（C-2）（貨號sc7382）、β-actin 抗體（貨號sc-81178）、Caspase-3 antibody（H-277）（貨號：sc-7272）購自美國Santa Cruz；Bax antibody（E63）（貨號：ab32503）購自美國Abcam；Anti-CD81 antibody（貨號：A01281-2）、Anti-Tsg101 antibody（貨號：A01233-2）購自BOSTER Biological Technolog。

1.2 人臍帶間充質(zhì)干細胞外泌體的提取鑒定

于人臍帶間充質(zhì)干細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞生長至70%～80% 融合度時，更換基礎(chǔ)培養(yǎng)基為無外泌體血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72 h 后收集細胞上清，通過逐步超高速離心法得到外泌體懸浮液。將外泌體懸浮液置于銅網(wǎng)行醋酸雙氧鈾染色液負(fù)染后，透射電子顯微鏡觀察外泌體形態(tài)，納米顆粒示蹤分析儀Particle Metrix 系統(tǒng)檢測外泌體粒徑大小從而得到顆粒粒徑的數(shù)量及濃度分布信息，Western-blot 蛋白印記檢測外泌體表面標(biāo)志物等方法鑒定外泌體。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組 根據(jù)各組有無阿霉素及間充質(zhì)干細胞外泌體濃度的不同，將鼠心肌細胞 H9C2 分為四組，（1）空白對照組（未給予任何劑量Exo 及Dox）；（2）Dox組（加入0.2 mg/L 的Dox）；（3）H-Exo+Dox 組（加入30 mg/L Exo 及0.2 mg/L 的Dox）；（4）L-Exo+Dox 組（加入15 mg/L Exo 及0.2 mg/L 的Dox）。

1.3.2 AnnexinV-FIFC/PI 檢測心肌細胞凋亡率 將H9C2 均勻鋪板后放入5 % CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞生長至80%～90% 融合時，根據(jù)不同分組予以不同濃度外泌體及Dox 處理，24 h 后消化并收集各組懸浮心肌細胞，然后再加入5 μL 的 Annexin V-FITC，充分混勻后，避光孵育15 min。于上機前5 min 再加入5 μL 的PI 染色繼續(xù)避光孵育，上機時補加200 μL的1×Binding Buffer，并在1 h 內(nèi)使用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.3.3 Western-blots 檢測心肌細胞凋亡蛋白 收集各組心肌細胞并提取蛋白，配平至一致濃度后上樣，經(jīng)過電泳、電轉(zhuǎn)膜、封閉抗體、孵育一抗、孵育二抗后于凝膠成像儀分別檢測Bax、Bcl-2、active Caspase-3 凋亡蛋白的表達水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 25.0 軟件，多組間比較采用LSD 單因素方差分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 人臍帶間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)及外泌體的提取鑒定

2.1.1 臍帶間充質(zhì)干細胞的形態(tài)和外泌體形態(tài) 臍帶間充質(zhì)干細胞在顯微鏡細胞成像系統(tǒng)可見：細胞貼壁生長，大小相對一致，透光性好，高度純化，聚集性生長，呈長梭形（圖1）。透射電子顯微鏡下可見，臍帶間充質(zhì)干細胞外泌體呈圓形或橢圓形囊泡狀，大小均勻，脂質(zhì)雙層膜完整透亮，見圖 2 。

圖1 hUCMSCs 細胞形態(tài)學(xué)

圖2 透射電子顯微鏡觀察臍帶間充質(zhì)干細胞外泌體形態(tài)

2.1.2 臍帶間充質(zhì)干細胞外泌體粒徑大小與表面標(biāo)志物 粒徑范圍集中于50～250 nm，平均粒徑大小為136.1 nm，重懸液顆粒濃度為 6.5×107Particles/mL（見圖3）；濃度最高的顆粒的粒徑為127.8 nm，其對應(yīng)的濃度為 3.3×106Particles/mL。以細胞蛋白為對照組，Western-blot 檢測外泌體表面標(biāo)記蛋白CD81、TSG101呈陽性表達。

圖3 外泌體粒粒徑大小分布圖注釋

2.1.3 臍帶間充質(zhì)干細胞外泌體表面標(biāo)志物 以細胞蛋白為對照組，Western-blot 檢測外泌體表面標(biāo)記蛋白CD81、TSG101 呈陽性表達，如圖4 所示。

圖4 Western-blot 檢測外泌體表面蛋白

2.2 各組心肌細胞的凋亡率

Dox 組細胞凋亡率最高為（27.0±1.9）%，L-Exo+Dox 組、H-Exo+Dox 組、空白對照組細胞凋亡率逐漸降低[分別為（15.6±1.2）%、（9.6±0.1）%、（4.6±1.3）% ]，組間兩兩比較均P＜0.05。圖5 為各組心肌細胞形態(tài)改變。

圖5 各組心肌細胞形態(tài)

2.3 各組心肌細胞的凋亡蛋白變化水平

Dox 誘導(dǎo)心肌細胞凋亡后，Dox 組的促凋亡蛋白Bax 及Caspase-3 表達量最高，抑凋亡蛋白Bcl-2 表達量則最低，反映細胞抗凋亡能力的Bcl-2/Bax 比值也處于最低水平，而 L-Exo+Dox 組Bax 及Caspase-3 表達量較前者下調(diào)，Bcl-2 表達量則上升，Bcl-2/Bax 比值也上升；H-Exo+Dox 組Bax 及Caspase-3 則下降更加明顯，而Bcl-2 則進一步上調(diào)，Bcl-2/Bax 比值也隨之上升；Bax、Caspase-3、Bcl-2 及Bcl-2/Bax 比值在Dox組與L-Exo+Dox 組的表達差異具統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），同時四者在L-Exo+Dox 組與H-Exo+Dox 組的表達差異具統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。如表1 所示。

表1 各組心肌細胞凋亡蛋白表達差異 (，n=3)

表1 各組心肌細胞凋亡蛋白表達差異 (，n=3)

與 L-Exo+Dox 組比較：aP＜0.05;與空白對照組比較：bP＜0.05

3 討論

阿霉素等蒽環(huán)類藥物是治療多種血液腫瘤的首選藥物之一，但其臨床應(yīng)用受到劑量依賴性以及延遲性心臟毒性的限制。阿霉素導(dǎo)致的心臟損傷往往為不可逆性，主要表現(xiàn)為惡性心律失常、擴張性心肌病、心力衰竭等[3]。目前尚無有效的方法減少蒽環(huán)類藥物心臟毒性，因此，需尋找有效的抗心肌損害藥物。

阿霉素導(dǎo)致心肌細胞氧化應(yīng)激增加凋亡被認(rèn)為是導(dǎo)致心臟損害的重要機制之一，具體凋亡途徑尚不明確。其中Bcl-2 蛋白家族依賴性的內(nèi)在途徑的特征在于通過線粒體外膜的透化作用和線粒體中可溶性因子的釋放發(fā)揮氧化應(yīng)激凋亡，分為BH3-only 蛋白、促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白[4-6]。BH3-only 蛋白當(dāng)受有害刺激物激活，促凋亡蛋白Bax 和 Bak 開始形成寡聚體，在線粒體外膜上形成孔道，經(jīng)此釋放線粒體膜空間蛋白，以細胞色素C 最重要，進入細胞質(zhì)，可瞬時結(jié)合關(guān)鍵的胱天蛋白酶（Caspase）接頭分子凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1），觸發(fā)Apaf-1 構(gòu)象廣泛變化，寡聚化為七聚體輪狀結(jié)構(gòu)，使得Caspase 活化，Apaf-1 與啟動子Caspase-9 結(jié)合形成凋亡小體，在凋亡小體內(nèi)Caspase-9的二聚化導(dǎo)致其被激活，繼而裂解促凋亡直接執(zhí)行者 Caspase-3 和Caspase-7，使細胞快速凋亡[4，7-8]?？沟蛲龅鞍譈cl-2 則通過在Bcl-2 或Bcl-xL 與 Bax 之間形成異二聚體，阻止Bax 和Bak 的激活和聚合，以及關(guān)閉線粒體離子通道以降低線粒體膜的通透性，從而抑制細胞凋亡[5，9]。

外泌體是一種帶有生物活性的細胞外囊泡，囊泡內(nèi)含有多種功能性生物分子，如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、mRNA、miRNA、細胞因子等，通過將這些生物分子實現(xiàn)細胞間通訊作用[10]。研究表明，脂肪間充質(zhì)干細胞、心臟祖細胞來源外泌體可減少阿霉素所致的心肌細胞凋亡[3，11]。本實驗選取人臍帶間充質(zhì)干細胞外泌體（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs）進行研究，免疫原性低而少有免疫排斥反應(yīng)，且具備更高的傳代及向多個胚層分化的能力[12]。

本實驗中Dox 濃度、外泌體的濃度梯度是本課題組前期進行Dox 誘導(dǎo)心肌損傷模型預(yù)實驗得出來的。以阿霉素誘導(dǎo)損害的心肌細胞為研究對象，觀察不同濃度臍帶間充質(zhì)干細胞外泌體處理后各組心肌細胞的的凋亡率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)適量的臍帶間充質(zhì)干細胞外泌體可在一定程度上降低阿霉素誘導(dǎo)的心肌細胞的凋亡率，且隨著外泌體濃度增高，降低凋亡率的程度增強，差異有顯著性，提示臍帶間充質(zhì)干細胞外泌體可降低阿霉素誘導(dǎo)心肌細胞的凋亡作用，且一定范圍外泌體濃度增強，其抗心肌細胞凋亡能力增強。

為進一步研究外泌體降低阿霉素誘導(dǎo)的心肌細胞的凋亡作用的機制，本研究檢測各組阿霉素誘導(dǎo)損傷的心肌細胞經(jīng)不同濃度臍帶間充質(zhì)干細胞外泌體處理后的Bax、Caspase-3、Bcl-2 表達水平。研究結(jié)果示，Dox 組 Bax 及Caspase-3 蛋白高表達，而Bcl-2 低表達，我們推測阿霉素誘導(dǎo)心肌細胞損害可能經(jīng)Bcl-2 蛋白家族依賴性的內(nèi)在途徑，最終使心肌細胞快速凋亡。并且研究結(jié)果顯示，與Dox 組相比，L-Exo+Dox 組、H-Exo+Dox 組Bax 及Caspase-3 表達降低，而Bcl-2 表達量升高，反映細胞抗凋亡能力的Bcl-2/Bax 比值也隨之升高，且隨著外泌體濃度增高，Bax 及Caspase-3 表達量降低更明顯，Bcl-2 表達量增加更明顯（P＜0.05），說明經(jīng)臍帶間充質(zhì)干細胞外泌體處理后心肌細胞凋亡率降低可能與Bcl-2 蛋白家族依賴性的內(nèi)在途徑的Bax及Caspase-3 表達量降低、Bcl-2 表達量增加有關(guān)，從分子學(xué)水平解釋了外泌體降低阿霉素誘導(dǎo)的心肌細胞的凋亡作用，且一定范圍外泌體濃度增強，其抗心肌細胞凋亡能力增強。Zhang 等[13]、Jing 等[14]研究也證實此分子水平變化。

另外，也有學(xué)者指出間充質(zhì)干細胞外泌體可通過聯(lián)合多種機制改善心臟損害。Ma 等[15]研究發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細胞外泌體可通過遞送miR-132 促進新血管生成以改善心肌梗塞；Arslan 等[16]在動物實驗中發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細胞來源的外泌體可增加ATP 水平，降低氧化應(yīng)激并激活PI3K/ Akt 途徑，從而增強心肌活力并防止心肌缺血再灌注損傷的重塑。因此，間充質(zhì)干細胞外泌體對心肌功能的改善并非是單一的通路機制，可能是多種途徑聯(lián)合的綜合結(jié)果，但這仍需進一步的研究。