戚 怡，陳起周王藝瑾，葉子秋，吳科鋒，葉 華，羅 輝，歐陽(yáng)茜茜*

（1.廣東醫(yī)科大學(xué)海洋醫(yī)藥研究院，廣東湛江 524000；2.南方海洋科學(xué)與工程廣東省實(shí)驗(yàn)室（湛江），廣東湛江 524000；3.廣東湛江海洋醫(yī)藥研究院，廣東湛江 524000）

惡性黑色素瘤是一種源于皮膚黑素細(xì)胞的高轉(zhuǎn)移、快侵襲、高死亡率的惡性腫瘤[1-3]，發(fā)病機(jī)制尚不明確，手術(shù)、化療、放療等傳統(tǒng)治療方法存在患者耐受性差、預(yù)后差等問(wèn)題[4-5]。目前靶向治療和免疫治療已在臨床中取得一定進(jìn)展，提高了惡性黑色素瘤患者的生存率，突破了傳統(tǒng)治療局限[6-7]，但這些治療方法依然存在患者耐藥性、治療無(wú)普遍性、藥物不良反應(yīng)大等問(wèn)題[8-9]。因此，尋找低毒、高效的抗腫瘤藥物或輔助抗腫瘤藥物是惡性黑色素瘤治療的研究方向之一。水產(chǎn)品生存環(huán)境極端，其蛋白質(zhì)組成獨(dú)特，水解產(chǎn)生的生物活性肽具有特殊氨基酸[10]，具有神經(jīng)保護(hù)、鎮(zhèn)痛、抗病毒等生物活性[11]。目前對(duì)魚蝦類生物活性肽的研究較多，水生軟體動(dòng)物源的生物活性肽尚未被廣泛研究。方格星蟲（Sipunculus nudus）俗稱沙蟲或海腸子，除極地水域外，分布于全球各地；在我國(guó)，主要生長(zhǎng)于廣東、廣西、海南及福建地區(qū)[12]，它被沿海居民稱為“海洋冬蟲夏草”，具有滋陰降火、清肺補(bǔ)虛、活血強(qiáng)身的功效，滋補(bǔ)五臟，在食用和藥用方面均有廣闊的應(yīng)用前景[13]。方格星蟲中可提取出大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及天然活性產(chǎn)物，如游離氨基酸、脂肪酸、多糖、礦物元素、甾醇類、核苷類和酶類等[14-15]。方格星蟲三肽是從方格星蟲多肽中分離出的可人工合成的具有活性的低聚肽，本研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)黑色素瘤細(xì)胞A375 具有一定的抑制作用，可為后續(xù)抗癌輔助藥物的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

方格星蟲三肽（實(shí)驗(yàn)室合成，純度為99%），分子量為358.59 Da，氨基酸序列為絲氨酸-精氨酸-脯氨酸（SRP）；人黑色素瘤細(xì)胞A375 細(xì)胞株；人永生化角質(zhì)細(xì)胞HaCaT 細(xì)胞株；青霉素-鏈霉素混液、胰蛋白酶、二甲基亞砜DMSO（索萊寶公司）；胎牛血清（美國(guó)Gibco 公司）；高糖DMEM 培養(yǎng)基（Hyclone 公司）；CCK-8（碧云天公司）；活性氧（ROS）試劑盒、乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（索萊寶公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 配制含10 %胎牛血清、1 %青霉素-鏈霉素混液的DMEM 培養(yǎng)基，在5 %CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行人黑色素瘤細(xì)胞A375 細(xì)胞株的培養(yǎng)，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，取細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，空白組（方格星蟲三肽濃度為0 g/L）細(xì)胞加入不添加胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組分別添加1、1.25、1.5、1.75、2 g/L 方格星蟲三肽溶解于無(wú)血清DMEM 培養(yǎng)基。

1.2.2 CCK-8 法檢測(cè)A375 細(xì)胞活力 制備細(xì)胞懸液，將A375 細(xì)胞、HaCaT 細(xì)胞以5 000 個(gè)/孔的接種密度分別接種于96 孔板。設(shè)置空白組，每組設(shè)置6 個(gè)重復(fù)。將 96 孔平底板置于 5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞貼壁12 h 后各實(shí)驗(yàn)組分別加入藥物培養(yǎng)24 h，棄含有藥物的培養(yǎng)基，加入CCK-8 繼續(xù)培養(yǎng)3 h。采用酶標(biāo)儀在 490 nm 波長(zhǎng)檢測(cè)各組吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞活率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。細(xì)胞活率（%）=（A1/A0）×100%，其中A1 代表實(shí)驗(yàn)組吸光度值，A0 代表空白組吸光度值。

1.2.3 transwell 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 將小室放入24 孔板，并在小室上層加入300 μL 混有1×105 個(gè)細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基（加藥），放入培養(yǎng)箱孵育4～6 h，在小室下層加入750 μL 10 %FBS 培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育24 h。棄小室上層培養(yǎng)基，PBS 洗2 次，3.7 %多聚甲醛室溫固定細(xì)胞15 min，棄多聚甲醛，PBS 清洗2 次，結(jié)晶紫避光染色15 min，洗去結(jié)晶紫，棉棒擦去小室上層未遷移的細(xì)胞，顯微鏡下拍照，隨機(jī)選取3～5 個(gè)視野計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.4 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A375 細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液并梯度稀釋至300 個(gè)/孔，加入6 孔板吹打分散培養(yǎng)，貼壁后加入藥物培養(yǎng)基處理24 h，棄去藥物培養(yǎng)基后繼續(xù)加入有血清培養(yǎng)基，待培養(yǎng)至群落肉眼可見(jiàn)，整個(gè)過(guò)程2～3 周。棄上清液，PBS 浸洗2次，4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，棄固定液，加入稀釋為0.1 %的結(jié)晶紫染色60 min，PBS 沖洗，風(fēng)干，計(jì)數(shù)拍照后用10%的冰乙酸溶解，492 nm 測(cè)定吸光值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.5 ROS 檢測(cè) A375 細(xì)胞分組處理后，棄藥物，加入含10 μmol/L DCFH-DA 的無(wú)血清培養(yǎng)基孵育20 min，用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3 次，多功能微孔板檢測(cè)系統(tǒng)（BIOTEL CYTATION5）拍照并檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

1.2.6 LDH 檢測(cè) A375 細(xì)胞分組處理后，收集細(xì)胞，按照ELISA 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，檢測(cè)LDH活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用Graph-pad prism5.0 及image J 軟件分析數(shù)據(jù)和圖像處理，計(jì)量資料采用單因素方差分析及q 檢驗(yàn)，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 方格星蟲三肽對(duì)A375 細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)

使用CCK-8 法檢測(cè)方格星蟲三肽對(duì)A375 細(xì)胞的毒性影響，發(fā)現(xiàn)所設(shè)5 個(gè)濃度均對(duì)A375 細(xì)胞有明顯的抑制作用（P＜0.01），且與空白組相比，隨著濃度的升高A375 細(xì)胞活率降低，IC50 值為1.955 g/L 。見(jiàn)圖1。

圖1 方格星蟲三肽對(duì)人黑色素瘤細(xì)胞A375 的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

2.2 方格星蟲三肽對(duì)正常細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)

與空白組相比，方格星蟲三肽在濃度為1 g/L 時(shí)有較明顯的促角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用（P＜0.05）；1.25、1.5 g/L 時(shí)，對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯影響；2 g/L 時(shí)有明顯的抑制作用（P＜0.01）。IC50 值為2.611 g/L。見(jiàn)圖2。

圖2 方格星蟲三肽對(duì)人角質(zhì)層細(xì)胞HaCaT 的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

2.3 克隆形成實(shí)驗(yàn)

不同濃度的方格星蟲三肽（1、1.25、1.5、1.75、2 g/L）處理細(xì)胞后，其克隆形成能力受到抑制，當(dāng)給藥濃度為2 g/L 時(shí)，與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），說(shuō)明2 g/L 方格星蟲三肽可有效抑制A375細(xì)胞的增殖。見(jiàn)圖3。

圖3 方格星蟲三肽對(duì)人黑色素瘤細(xì)胞A375 的克隆形成實(shí)驗(yàn)

2.4 方格星蟲三肽對(duì)A375 細(xì)胞的遷移影響

細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，方格星蟲三肽處理24 h后與空白組相比，不同濃度的方格星蟲三肽均有抑制黑色素瘤細(xì)胞遷移的作用，且其遷移能力隨著方格星蟲三肽的濃度升高而降低，其中1.5、1.75、2 g/L 方格星蟲三肽處理后細(xì)胞遷移水平與空白組相比顯著減少（P＜0.05）。見(jiàn)圖4。

圖4 方格星蟲三肽對(duì)人黑色素瘤細(xì)胞A375 的細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

2.5 ROS 檢測(cè)

不同濃度的方格星蟲三肽處理A375 黑色素瘤細(xì)胞后可發(fā)現(xiàn)，1、1.25、1.5、1.75 g/L 的藥物可使黑色素瘤細(xì)胞內(nèi)ROS 含量明顯增加（P＜0.05 或0.01），表明方格星蟲三肽抑制A375 黑色素瘤細(xì)胞增殖的作用與細(xì)胞內(nèi)ROS 水平有關(guān)。見(jiàn)圖5。

圖5 方格星蟲三肽對(duì)人黑色素瘤細(xì)胞A375 ROS 的影響

2.6 LDH 檢測(cè)

不同濃度的方格星蟲三肽處理A375 黑色素瘤細(xì)胞后，LDH 的變化趨勢(shì)均減少，與空白組相比LDH 酶活性明顯降低（P＜0.01）。見(jiàn)圖6。

圖6 方格星蟲三肽對(duì)人黑色素瘤細(xì)胞A375 的LDH 影響

3 討論

本研究通過(guò)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)說(shuō)明經(jīng)方格星蟲分離、酶解、人工合成的方格星蟲三肽能在一定濃度內(nèi)抑制惡性黑色素瘤細(xì)胞A375 的增殖；同時(shí)，通過(guò)對(duì)人永生化角質(zhì)細(xì)胞HaCaT 進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)方格星蟲三肽不會(huì)對(duì)正常細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，說(shuō)明該食物源生物活性肽比常規(guī)抗癌藥物具有更高的安全性。transwell 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)考察方格星蟲三肽處理后惡性黑色素瘤細(xì)胞A375 的細(xì)胞遷移情況，結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)一定濃度的（1.5、2 g/L）方格星蟲三肽處理后，腫瘤細(xì)胞的遷移數(shù)明顯減少，表明方格星蟲三肽可在一定濃度下抑制惡性黑色素瘤細(xì)胞A375 的遷移能力，進(jìn)一步減少其增殖。本研究對(duì)方格星蟲三肽處理后惡性黑色素瘤細(xì)胞A375 的ROS 變化及LDH 進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示當(dāng)方格星蟲三肽藥物濃度較高時(shí)，ROS 含量與空白組比較明顯升高，與之前的CCK-8 結(jié)果相對(duì)應(yīng)，這是由于腫瘤細(xì)胞的快速生長(zhǎng)使得腫瘤內(nèi)部處于缺氧環(huán)境[16-18]。在低到中等水平上，ROS 可通過(guò)誘導(dǎo)DNA突變和基因組不穩(wěn)定性來(lái)作為加速腫瘤細(xì)胞增殖、生存和轉(zhuǎn)移的信號(hào)分子促進(jìn)腫瘤的發(fā)展[19-20]；另一方面，腫瘤細(xì)胞中ROS 的增加可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬、凋亡等，從而抑制其增殖及逆轉(zhuǎn)耐藥[21]。本研究中，不同濃度的方格星蟲三肽作用于惡性黑色素瘤細(xì)胞后，抑制了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)速度，從而使ROS 在給藥細(xì)胞中的表達(dá)高于空白組；但是可能由于方格星蟲三肽藥物濃度過(guò)高，A375 細(xì)胞受滲透壓影響，當(dāng)藥物濃度高達(dá)2 g/L 時(shí)，藥物對(duì)給藥腫瘤細(xì)胞的ROS 表達(dá)影響不明顯。同時(shí)，腫瘤細(xì)胞的特點(diǎn)之一是其能量代謝發(fā)生改變，對(duì)于惡性腫瘤細(xì)胞來(lái)說(shuō)，在日常代謝中更傾向于通過(guò)糖酵解獲取能量[22]，從而滿足腫瘤細(xì)胞快速增長(zhǎng)繁殖的需求。其在代謝中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物乳酸又有利于腫瘤生長(zhǎng)微環(huán)境的形成，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的進(jìn)展和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。LDH 作為參與腫瘤細(xì)胞代謝的一種酶，被發(fā)現(xiàn)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)[23]。本研究中使用不同濃度的方格星蟲三肽處理惡性黑色素瘤細(xì)胞后，腫瘤細(xì)胞的增殖受到抑制，經(jīng)過(guò)進(jìn)一步檢測(cè)LDH 發(fā)現(xiàn)，不同濃度的方格星蟲三肽抑制了腫瘤細(xì)胞LDH 的釋放。

綜上所述，方格星蟲三肽體外抗腫瘤活性較好，其抑制A375 細(xì)胞增殖的作用機(jī)制可能與抑制腫瘤細(xì)胞的能量代謝有關(guān)。方格星蟲三肽可作為一種輔助的抗腫瘤藥物繼續(xù)深入研究。