李丹丹，劉 戈，鄒麗鑫，羅 杰

0 引言

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)常見的微血管并發(fā)癥，也是導致成年人失明的重要原因[1-2]。DR分為非增生性糖尿病視網膜病變(nonproliferative diabetic retinopathy，NPDR)和增生性糖尿病視網膜病變(proliferative diabetic relatinopathy，PDR)。PDR是視網膜缺血引起的新生血管形成以及纖維化，甚至視網膜脫離[3-4]，進展到高危PDR階段的患者可能繼發(fā)玻璃體出血或牽引性視網膜脫離而出現(xiàn)嚴重的視力喪失[5]。因此尋找能簡單、有效判斷PDR的生物學指標對于患者的早期診治具有重要意義。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是由200多個核苷酸組成的非編碼RNA，缺乏蛋白質編碼能力，主要通過調節(jié)致癌和腫瘤抑制途徑在腫瘤的發(fā)生、進展和轉移中發(fā)揮關鍵作用[6]。近來，有研究表明LncRNA在眼部相關疾病中存在差異性表達，并對不同類型的眼部疾病有調控作用，提示LncRNA可作為診斷以及治療眼部疾病的新靶點[7-8]。LncRNA缺氧誘導因子-1α-反義鏈1(hypoxia-inducible factor 1 alpha antisense RNA 1，HIF1A-AS1)位于人14號染色體缺氧誘導因子1α的反義鏈上，成熟體長度為652nt[9-10]。相關研究表明，HIF1A-AS1可以用于癌癥、腫瘤以及心血管系統(tǒng)等疾病的診斷。此外，HIF1A-AS1在血管平滑肌細胞的體外增殖和凋亡中也起到關鍵作用[11]。而其與PDR的關系尚不清楚。因此，本研究旨在通過檢測LncRNA HIF1A-AS1在PDR患者中的表達情況，分析LncRNA HIF1A-AS1在病程發(fā)展中的作用及臨床意義。

1 對象和方法

1.1對象選取2019-07/2021-07本院收治的160例患者為研究對象，根據視網膜病變程度分為PDR組(80例)，男45例，女35例，年齡51～72(平均58.60±6.50)歲，NPDR組(80例)，男41例，女39例，年齡49～70(平均57.89±5.80)歲。納入標準：(1)符合DR患者診斷標準，按照2014年中國眼底病學組制定的DR分期標準分為PDR組和NPDR組[12-13]；(2)無精神病病史。排除標準：(1)有既往其他眼部疾病如青光眼、葡萄膜炎、角膜混濁、角膜潰瘍等；(2)有高血壓疾病病史者；(3)有眼外傷及內眼手術史；(4)有惡性腫瘤、免疫疾病等患者；(5)臨床資料不完整者。選取同期來本院的健康體檢者100例為對照組，男56例，女44例，年齡50～71(平均57.60±5.71)歲。本研究經我院道德倫理委員會批準通過，所有樣品采集均取得受試者知情同意。

1.2方法

1.2.1標本采集所有受試者于就診當日采集空腹肘靜脈血10mL，置于EP管中室溫靜置15min，放入離心機在3000r/min下離心處理10min，取上層血清置于EP管內，置于-80℃保存，備用。

1.2.2臨床資料收集及生化指標測定收集所有研究對象的臨床資料，分別記錄年齡、性別、病程、體質量，檢查血壓(入院24h動態(tài)血壓監(jiān)測的收縮壓和舒張壓平均值)；采用糖化血紅蛋白分析儀檢測糖化血紅蛋白(HbA1c)水平；常規(guī)血糖儀檢測空腹血糖(FBG)；采用全自動生化儀檢測甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平。

1.2.3qRT-PCR法檢測血清中LncRNAHIF1A-AS1水平采用TRIzol試劑(賽默飛公司)提取血清中總RNA，Nano Drop 2000超微量分光光度計(深圳市宇德立生物科技公司)檢測濃度以及純度后，利用PrimeScript RT-聚合酶(科邦興業(yè)科技有限公司)將2μg總RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA作為進行常規(guī)聚合酶鏈反應的模板，于qRT-PCR儀(美國Bio-Rad公司)進行擴增。循環(huán)參數(shù)為：95℃，30s，然后再95℃，5s，60℃，30s。共設40個循環(huán)。GAPDH作為內參基因，使用Primer 5.0引物設計軟件，設計本研究所用引物，序列見表1。所有條件均按照檢測系統(tǒng)嚴格進行，采用2-ΔΔCT法對血清LncRNA HIF1A-AS1表達水平進行定量分析。

表1 qRT-PCR引物序列

2 結果

2.1一般資料比較三組年齡、性別、體質量、收縮壓、舒張壓水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。PDR組的糖尿病病程高于NPDR組(P<0.05)，PDR組、NPDR組中HbA1c、FBG、TC、TG、LDL-C水平顯著高于對照組，且PDR組高于NPDR組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。PDR組中HDL-C水平顯著低于對照組和NPDR組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 三組一般資料比較

2.2三組血清中LncRNAHIF1A-AS1水平比較PDR組患者血清中LncRNA HIF1A-AS1水平(2.25±0.54)高于NPDR組(1.78±0.45)和對照組(1.56±0.32)，NPDR組高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(F=56.385，P<0.01)。

2.3PDR患者血清中LncRNAHIF1A-AS1水平與相關指標的相關性分析PDR患者血清LncRNA HIF1A-AS1水平與糖尿病病程、HbA1c、TC、TG、LDL-C、FBG呈正相關(r=0.478、0.278、0.391、0.361、0.356、0.276，均P<0.05)，與HDL-C呈負相關(r=-0.250，P=0.025)。

2.4ROC曲線分析LncRNAHIF1A-AS1水平預測PDR的診斷價值ROC結果顯示，LncRNA HIF1A-AS1水平預測PDR發(fā)生的曲線下面積(area under the ROC curve，AUC)為0.766(95%CI：0.692～0.829)，對應的敏感度為66.25%，特異度為78.75%，見圖1。

圖1 LncRNA HIF1A-AS1水平預測PDR的ROC曲線。

2.5影響PDR發(fā)生的危險因素分析以是否發(fā)生PDR為因變量，單因素分析有意義的因素為自變量進行多因素Logistic回歸分析，結果顯示，LncRNA HIF1A-AS1、病程、FBG、HbA1c、TC、TG、LDL-C均是PDR發(fā)生的危險因素(P<0.05)，見表3。

表3 影響PDR發(fā)生的多因素Logistic回歸分析

3 結論

近年，DM已成為全球公共衛(wèi)生的負擔[14]，研究表明幾乎所有1型糖尿病患者和超過50%的2型糖尿病患者都會發(fā)生DR，且隨著疾病的進展可能導致視網膜缺血并發(fā)展為威脅視力的PDR[15]。

本研究中LncRNA HIF1A-AS1水平在PDR患者血清中上調，表達水平高于NPDR患者和健康人群，王微等[20]研究表明高水平的LncRNA HIF1A-AS1提示機體處于氧化應激狀態(tài)，這與本研究結果相符，結果提示LncRNAHIF1A-AS1表達水平升高可能會加速DR的進程，與PDR的發(fā)生有關，且與病變嚴重程度存在明顯關聯(lián)；而PDR組患者糖尿病病程高于NPDR組，PDR組、NPDR組患者HbA1c、TC、TG、LDL-C、FBG水平顯著高于對照組，且PDR組HDL-C水平顯著低于對照組，表明隨著患者的病程進展，患者體內的代謝紊亂更加嚴重，且疾病的嚴重程度與血糖、血脂水平增高密切相關，這也與以往研究結果相一致[21]。研究發(fā)現(xiàn)LncRNA HIF1A-AS1在PDR患者中的表達與糖尿病病程、HbA1c、TC、TG、LDL-C、FBG呈正相關，與HDL-C呈負相關，提示病程越長、DR增生型病變越嚴重，患者LncRNA HIF1A-AS1相對表達量越高，LncRNA HIF1A-AS1可能通過影響糖脂代謝指標，進一步加重糖代謝紊亂，最終導致PDR的發(fā)生，可能作為診斷疾病嚴重程度的潛在標志；本研究Logistic回歸分析結果顯示，LncRNA HIF1A-AS1、病程、FBG、HbA1c、TC、TG、LDL-C均是PDR發(fā)生的危險因素，提示臨床應重視患者的自我管理，把血糖、血壓、血脂控制到最佳水平，將有效降低PDR的發(fā)生率，對于LncRNA HIF1A-AS1表達升高的患者可給予恰當治療；ROC結果顯示，LncRNA HIF1A-AS1水平預測PDR發(fā)生的AUC為0.766(95%CI：0.692～0.829)，對應的敏感度為66.25%，特異度為78.75%，提示LncRNA HIF1A-AS1相對表達量可作為診斷PDR的潛在生物標志物，具有重要的臨床價值。

綜上所述，在PDR患者血清中LncRNA HIF1A-AS1水平上調，與患者病程密切相關，糖尿病病程、HbA1c、TC、TG、LDL-C、FBG、HDL-C均影響LncRNA HIF1A-AS1的表達，推測LncRNA HIF1A-AS1可能通過調控有糖代謝等途徑參與PDR的發(fā)病及進展過程，LncRNA HIF1A-AS1可作為預測PDR發(fā)生的潛在指標，有望成為PDR防治研究的新方向，具有重要的臨床意義，但其中存在的相關作用機制本研究尚未明確，尚需通過動物實驗進行后續(xù)研究。

1周垂仁, 黃衛(wèi), 江玲. 糖尿病視網膜病變血清miR-146a與核轉錄因子-κB和VEGF的相關性. 國際眼科雜志 2018;18(8):1440-1442