芮蓉,陳瑛,朱冰冰,曹愛麗,王浩,王利

(上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院,上海 200062)

糖尿病腎病(Diabetic nephropathy,DN)是由糖尿病引起的微血管并發(fā)癥之一,最終可導致終末期腎病。一旦早期DN發(fā)展成終末期腎病,腎功能衰竭就不可避免且不可逆轉,需要采用腎臟替代療法[1],因此早期診斷、干預和治療是逆轉或阻止DN進展的關鍵。慢性高血糖造成腎小球濾過屏障的破壞以及腎臟血流動力學的改變,引起尿蛋白分泌增加,持續(xù)性蛋白尿誘導腎臟炎癥和纖維化,造成腎功能障礙[2]。足細胞是腎小球濾過屏障的重要組成部分,研究表明,足細胞長期處于高血糖環(huán)境,會引起足細胞結構功能異常,進而影響腎小球濾過功能,持續(xù)、不可逆地產生大量蛋白尿,導致腎功能損害[3]。因此,減輕足細胞損傷被認為是預防或減緩DN進展的有效途徑。

慢性炎癥是DN的主要病理特征,DN早期即可觀察到如白細胞介素(Interleukin，IL)-6、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)等促炎因子分泌的改變,因此抑制高血糖引起的足細胞炎癥是預防足細胞損傷的有效治療策略之一[4]。研究表明,核因子-κB(Nuclear factor kappa-B,NF-κB)調節(jié)大量參與炎癥反應的基因表達,是足細胞損傷的重要靶點。Toll 樣受體 4(Toll-like receptor 4,TLR4)在DN腎小球炎癥內在途徑中也發(fā)揮著重要作用,是公認的NF-κB上游轉錄因子[5-6]。TLR4/NF-κB信號通路激活可導致促炎細胞因子和趨化因子的產生,介導DN早期炎癥損傷。

黃芪湯首載于北宋楊士瀛《仁齋直指方論》卷十七[7],原方由黃芪、茯神、瓜蔞根、麥門冬、北五味子、生地黃、炙甘草7味中藥組成。茯神藥效長于養(yǎng)心安神，茯苓則功效更長于健脾，且方中五味子、瓜蔞根斂肺益腎、益氣生津，可濟身中津液之枯，加之茯苓健脾可制胃腸激烈之燥，除燥熱之標，三藥共奏養(yǎng)陰清熱潤燥之功，故本團隊所用黃芪湯由原方去茯神加茯苓化裁而來。本團隊前期研究表明,黃芪湯及其活性成分具有腎臟保護作用,可有效保護足細胞,延緩DN進展[8-10],但黃芪湯在DN進程中減輕足細胞炎癥損傷的作用機制目前尚未闡明,因此本研究通過探討黃芪湯對高糖誘導足細胞的保護作用及可能機制,為黃芪湯的臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞

永生化人足細胞株(Human podocyte,HPC),由美國Mount Sinai醫(yī)院何慈江教授贈送。

1.2 藥物

黃芪湯方劑組成為[11]:黃芪2 kg，茯苓2 kg，麥門冬2 kg，北五味子1 kg，生地黃3 kg，瓜蔞根2 kg和炙甘草1 kg,共計13 kg。加水熱回流提取2 h后過濾,擠干濾渣內水分,再重復上述提取、過濾流程2次。合并3次提取液,減壓濃縮為稠浸膏,以95%乙醇調節(jié)含醇量為70%,靜置過夜,吸取上清液,置于減壓干燥箱中,105 ℃下減壓干燥48 h,得干粉提取物,每1 g提取物相當于7.5 g處方量。

含黃芪湯培養(yǎng)基的制備:稱取適量黃芪湯干粉提取物,經渦旋、超聲、水浴等方法使其充分溶解于RPMI-1640培養(yǎng)基后,經0.22 μm過濾器過濾并配制成所需濃度的溶液,4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑

D-葡萄糖(Biosharp公司,貨號:BS099),RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco公司,貨號:C11875500BT);TLR4抗體(Abcam公司,貨號:ab13556),NF-κB抗體(Abcam公司,貨號:ab16502),p-NF-κB抗體(CST公司,貨號:3033T),TNF-α抗體(Abcam公司,貨號:ab66579),IL-6抗體(Abcam公司,貨號:ab93356),GAPDH抗體(Abcam公司,貨號:ab22555);qPCR試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司,貨號:FP205-03],CCK-8試劑盒(日本同仁化學研究所,貨號:PG657),IL-6 ELISA試劑盒(北京博奧龍免疫技術有限公司,貨號:BDEL-0022),TNF-α ELISA試劑盒(北京博奧龍免疫技術有限公司,貨號:BDEL-0049)。

1.4 儀器

超凈工作臺(ESCO公司,型號:SVE-6A1);二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific公司,型號:HERAcell240i);電泳儀(BIO-RAD公司,型號:165-8001);酶標分析儀(BIO-RAD公司,型號:BioRad-680);化學發(fā)光成像儀(BIO-RAD公司,型號:CDT94547);熒光顯微鏡(OLMYPUS公司,型號:CKX41/U-RFLT50);qPCR儀(ABI公司,型號:ABI7300)。

1.5 CCK-8法檢測細胞增殖能力

取對數(shù)生長期的人足細胞經胰酶消化后,配制成細胞懸液,計數(shù)后按每孔1×103個的密度鋪于96孔板中,每孔加入100 μL細胞懸液,分為空白組(調零組)、對照組、黃芪湯(1、3、10、30、100、300、1 000、3 000 μg·mL-1)組,每組設6個復孔。細胞放入33 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)12 h后觀察細胞貼壁情況,根據(jù)上述分組加入相應的處理因素,繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h,培養(yǎng)結束后,每孔加入100 μL CCK-8工作液在33 ℃孵育2 h,使用酶標儀測定450 nm處吸光度(A)。細胞增殖抑制率計算公式:抑制率=(A對照組-A黃芪湯組)/(A對照組-A空白組)×100%。空白組只加CCK-8工作液;對照組只加細胞、CCK-8工作液。

1.6 實驗分組及給藥

人足細胞于33 ℃、5% CO2的條件下，在含有10%胎牛血清、1%胰島素轉鐵蛋白硒(Insulin transferrin selenium，ITS)、1%青鏈霉素(Penicillin streptomycin，PS)的RPMI-1640培養(yǎng)基中增殖,于37 ℃、5% CO2的條件下分化7 d用于實驗。實驗分為對照組(5 mmol·L-1葡萄糖)、模型組(30 mmol·L-1葡萄糖)、黃芪湯低濃度組(30 mmol·L-1葡萄糖+10 μg·mL-1黃芪湯)、黃芪湯中濃度組(30 mmol·L-1葡萄糖+30 μg·mL-1黃芪湯)、黃芪湯高濃度組(30 mmol·L-1葡萄糖+100 μg·mL-1黃芪湯)。黃芪湯在高糖刺激前2 h加入,細胞培養(yǎng)24 h后用于實驗。

1.7 劃痕實驗檢測細胞遷移能力

取對數(shù)生長期的人足細胞經胰酶消化后,配制成細胞懸液,計數(shù)后按每孔1×104密度鋪于6孔板中,放入33 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞貼壁,轉移至37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)7 d,黃芪湯組提前2 h加入含黃芪湯無血清培養(yǎng)基,使用100 μL無菌槍頭于板底劃線,PBS洗滌去除懸浮細胞,加入對應藥物進行干預,立即于顯微鏡下拍攝加藥后初始劃痕照片，將細胞放回33 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng),24 h后同一位置拍攝照片,使用Image J分析劃痕照片，計算各組細胞遷移率。遷移率=(初始距離面積-24 h距離面積)/(初始距離面積)×100%。

1.8 qPCR法檢測細胞炎癥因子表達

以10 cm細胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)細胞,黃芪湯組根據(jù)CCK-8檢測結果,設置實驗濃度為100 μg·mL-1,給予對應干預24 h后,根據(jù)試劑盒說明書進行操作。用2-ΔΔCt計算mRNA表達量。

引物設計與合成由上海捷瑞生物工程有限公司提供,序列如表1所示。

表1 細胞炎癥因子引物序列Table 1 Cellular inflammatory factor primer sequence

1.9 ELISA法檢測細胞上清炎癥因子水平

收取各組細胞培養(yǎng)24 h后的上清液,按照試劑盒說明進行操作,檢測細胞上清液中TNF-α、IL-6水平。

1.10 Western blot法檢測細胞蛋白表達水平

各組細胞培養(yǎng)24 h后提取蛋白,BCA法測定蛋白濃度。進行SDS-PAGE凝膠電泳,將蛋白轉移至PVDF膜,5%BSA封閉1 h,加入對應一抗,4 ℃搖床孵育過夜。次日用TBST洗膜3次,每次5 min,加入對應二抗室溫孵育1 h,TBST洗膜3次,每次5 min,ECL避光顯影,使用Image J軟件分析條帶,計算各組目的蛋白與GAPDH比值,得出各組蛋白相對表達量。上述實驗均重復3次。

1.11 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 黃芪湯對足細胞增殖活性的影響

CCK-8檢測結果顯示,與黃芪湯1 μg·mL-1組相比,黃芪湯濃度為3、10、30、100 μg·mL-1時對細胞增殖活性無明顯影響(P>0.05),結果見表2。因此,本實驗選取10、30、100 μg·mL-1三個濃度觀察黃芪湯對高糖誘導足細胞損傷的影響。

表2 不同濃度黃芪湯對足細胞增殖抑制率的影響Table 2 Effect of different concentration of Huangqi Decoction on podocyte proliferation

2.2 黃芪湯對高糖誘導足細胞遷移及黏附能力的影響

結果顯示,與對照組相比,模型組細胞劃痕愈合率明顯降低(P<0.01),說明高糖抑制了足細胞遷移和黏附作用;與模型組相比,予10、30、100 μg·mL-1黃芪湯干預后,各組細胞劃痕愈合率明顯升高(P<0.01),表明黃芪湯改善了高糖對足細胞遷移、黏附能力的作用,結果見圖1。

注:與對照組比較,##P<0.01;與模型組比較,圖1 黃芪湯對足細胞遷移能力的影響Fig.1 Effect of Huangqi Decoction on the migration ability of podocyte

2.3 黃芪湯對足細胞炎癥因子mRNA表達的影響

與對照組相比,模型組中IL-6、TNF-α、CCL24 mRNA表達顯著上調(P<0.05,P<0.01);與模型組相比,高濃度黃芪湯干預后,足細胞中IL-6和TNF-α mRNA表達明顯減少(P<0.01),表明黃芪湯可抑制高糖誘導的足細胞炎癥反應,結果見圖2。

注:與對照組比較,#P<0.05,##P<0.01;與模型組比較,圖2 黃芪湯對足細胞炎癥因子mRNA表達的影響Fig.2 Effect of Huangqi Decoction on the mRNA fold change of podocyte inflammatory cytokine

2.4 黃芪湯對高糖誘導的足細胞上清液中IL-6和TNF-α水平的影響

ELISA結果顯示,與對照組相比,模型組細胞炎癥因子IL-6和TNF-α水平明顯升高(P<0.01);黃芪湯干預明顯降低了上清液中IL-6和TNF-α的水平(P<0.01),表明黃芪湯能夠減少高糖誘導的足細胞中炎癥因子IL-6、TNF-α的分泌,抑制足細胞炎癥反應,結果見圖3。

注:與對照組比較,##P<0.01;與模型組比較,圖3 黃芪湯對足細胞上清液中炎癥因子水平的影響Fig.3 Effect of Huangqi Decoction on the levels of inflammatory cytokine in the supernatant of podocyte

2.5 黃芪湯對高糖誘導的足細胞IL-6和TNF-α蛋白表達的影響

通過Western blot進一步驗證黃芪湯對高糖誘導的足細胞炎癥的抑制作用。與ELISA結果基本一致,模型組IL-6和TNF-α的蛋白表達水平顯著高于對照組(P<0.01); 黃芪湯干預下調了IL-6和TNF-α的蛋白表達(P<0.05,P<0.01),表明黃芪湯可阻礙高糖誘導的足細胞炎癥反應,結果見圖4。

注:與對照組比較,##P<0.01;與模型組比較,圖4 黃芪湯對足細胞中炎癥因子蛋白表達的影響Fig.4 Effect of Huangqi Decoction on the protein expression of podocyte inflammatory cytokine

2.6 黃芪湯對高糖誘導足細胞TLR4/NF-κB信號通路的影響

通過Western blot進一步分析黃芪湯對高糖誘導的足細胞中TLR4/NF-κB信號通路的影響，結果表明TLR4和p-NF-κB/NF-κB蛋白表達水平在高糖處理的足細胞中均顯著升高(P<0.01)，黃芪湯處理后，足細胞中TLR4和p-NF-κB/NF-κB蛋白的表達顯著降低(P<0.01),表明黃芪湯可抑制高糖誘導的足細胞中TLR4/NF-κB信號通路的激活,結果見圖5。

注:與對照組比較,##P<0.01;與模型組比較,圖5 黃芪湯對足細胞中TLR4、NF-κB蛋白表達的影響Fig.5 Effect of Huangqi Decoction on the protein expression of TLR4 and NF-κB in podocyte

3 討論

黃芪湯具有廣泛的藥理活性,已被證明可通過改善多種病理變化延緩DN進展。本團隊之前通過液相色譜-質譜法(Liquid chromatograph mass spectrometer,LC-MS)分析鑒定黃芪湯的主要活性成分[12]包括黃芪甲苷,落新婦苷、毛蕊花糖苷、甘草酸、五味子素、魯斯可皂苷元、梓醇、甘草苷。現(xiàn)代藥理學研究表明,黃芪湯中活性成分可抑制細胞炎癥通路的激活[13-15],降低炎癥因子TNF-α、IL-6產生[16],增強細胞抗炎、抗氧化能力,改善細胞凋亡[16-19],減弱高糖引起的腎臟結構和功能損傷[16,20],有效保護腎臟功能。足細胞是腎小球濾過屏障的重要組成部分,受到損傷后會發(fā)生一系列變化,從肥大、脫離、自噬到細胞凋亡,導致蛋白尿形成,是DN發(fā)病機制中的一個重要早期事件,因此足細胞數(shù)量和功能變化是進行性DN的最強預測因子[21]。本團隊前期在臨床工作中發(fā)現(xiàn)，黃芪湯明顯降低了DN Ⅲ期患者的蛋白尿水平[22],由此我們推測黃芪湯可能具有足細胞保護作用。細胞遷移是正常細胞的基本功能之一,是機體正常生長發(fā)育的生理過程。足細胞遷移緩慢說明足細胞黏附作用受損,足細胞黏附性下降導致足細胞大量丟失,足細胞數(shù)量減少。足細胞數(shù)量下降是腎小球濾過屏障結構異常乃至產生蛋白尿的重要原因[23]。我們在足細胞劃痕實驗中發(fā)現(xiàn),高糖刺激24 h后模型組的細胞劃痕愈合率明顯低于對照組,黃芪湯干預后各組劃痕愈合率較模型組明顯改善,證明黃芪湯能夠抑制高糖誘導的足細胞遷移、黏附能力的改變,維持足細胞數(shù)量和功能的穩(wěn)定,改善高糖環(huán)境下足細胞損傷,保護腎小球濾過屏障,從而減少DN蛋白尿。

炎癥是DN發(fā)展重要的病理基礎,炎性細胞浸潤可促進腎臟纖維化,加重腎組織病理損傷。DN腎組織炎癥狀態(tài)下,炎癥因子的分泌增多,免疫細胞被募集到腎組織中積累和浸潤,進一步釋放促炎因子,從而加重炎癥并損害腎臟組織[24]。既往研究發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠腎臟中炎癥細胞因子mRNA表達顯著上調,包括CCL2、CCL3、CCL8、CCL20、CCL24、CXCR1、CXCR5、IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-11、TNF-α以及Spp1[25]。本研究通過qPCR檢測高糖環(huán)境下人足細胞中上述炎癥因子的表達,與對照組相比,模型組中TNF-α、IL-6、CCL24的mRNA表達明顯增加,其他炎癥因子的表達無顯著差異,黃芪湯的干預明顯降低了高糖誘導的足細胞中TNF-α、IL-6 mRNA表達。趨化因子大致分為4個亞家族——CC、C、CXC和CX3C，CC趨化因子家族可反映DN中腎小管炎癥損傷的水平[26]。最近研究也表明，CCL24可以通過減輕足細胞炎癥來保護腎臟功能[27],CXCR家族CXCR1和CXCR5則參與誘導腎小球內皮細胞損傷[26,28]。此外炎癥細胞因子不會單獨作用,而是相互調節(jié),因此本研究模型組其他炎癥因子表達無顯著差異,可能是由于細胞因子之間的相互作用沒有達到顯著的閾值。另一方面,DN病程相對較長,炎癥因子的表達或許與足細胞DN模型的高糖刺激時間相關,此處尚不能排除刺激時間對炎癥因子表達的影響。有研究顯示,蛋白尿水平的升高伴隨著炎癥因子IL-6、TNF-α表達的增加[29],本團隊前期臨床研究發(fā)現(xiàn),黃芪湯能減少DN患者尿微量白蛋白、24 h尿蛋白定量,降低尿白蛋白排泄率,有效降低DN患者血清中炎癥因子IL-6、TNF-α水平,改善腎單位內環(huán)境,減輕高糖造成的腎功能損傷,延緩DN進展[22]。本研究中,我們通過ELISA和Western blot進一步驗證黃芪湯對高糖誘導的足細胞炎癥反應有抑制作用,證實黃芪湯具有足細胞保護作用。

眾所周知,TLR4/NF-κB信號通路是啟動內源性炎癥信號轉導的經典途徑,TNF-α和IL-6是TLR4/NF-κB信號通路激活的產物[30]。TLR4是炎癥通路的上游因子,轉錄因子NF-κB與炎癥反應密切相關,高糖刺激會顯著促進TLR4的表達和激活,激活的TLR4在腎臟中誘導足細胞中NF-κB的活化,而促進炎癥因子TNF-α、IL-6的釋放,加重足細胞的炎癥損傷[31]。現(xiàn)代藥理學研究證明,黃芪湯中多種成分具有調節(jié)TLR4/NF-κB信號通路的作用，如：黃芪有效成分黃芪多糖可通過調節(jié)TLR4/NF-κB信號通路,抑制IL-6、TNF-α的表達,改善CVB3誘導的心肌損傷和炎癥反應[32];茯苓多糖可調節(jié)TLR4/TRAF6/NF-κB信號通路,發(fā)揮抗氧化和抗凋亡的作用[33];地黃提取物梓醇可抑制TLR4/NF-κB通路，減弱脂多糖誘導的炎癥反應[34];麥冬的多糖提取物具有抑制IκB激酶(IκB kinase,IKK)-NF-κB通路、改善胰腺β細胞炎癥、增加胰島素分泌的作用[35];五味子乙素能改善血管緊張素Ⅱ引起的慢性炎癥和氧化應激,保護血管功能,也與抑制NF-κB的活化有關[36]。因此,我們猜測黃芪湯可能通過調節(jié)經典的TLR4/NF-κB信號通路的活性，抑制炎癥反應,發(fā)揮保護足細胞的作用。實驗結果證實黃芪湯抑制高糖誘導的TLR4/NF-κB信號通路的激活,從而改善高糖誘導的足細胞炎癥損傷。

綜上所述,本研究證明黃芪湯可通過抑制TLR4/NF-κB信號通路活性改善高糖誘導的足細胞炎癥,減少足細胞損傷,延緩DN的進展,為黃芪湯的臨床實踐提供了更多的參考數(shù)據(jù)。本實驗尚未涉及黃芪湯調節(jié)NF-κB表達的具體靶點,后續(xù)研究將進一步驗證黃芪湯是否通過抑制IKK表達和NF-κB抑制劑(Inhibitor of NF-κB, IκB)磷酸化,從而抑制NF-κB的易位進入細胞核和激活DN炎癥反應,改善足細胞損傷。