趙燁,葛凡,李子航,朱景天,薛梅

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,江蘇 南京 210023;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院·中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院,江蘇 南京 210023)

糖尿病是一種終身代謝性疾病,由多種原因引起,其特征是慢性的高血糖,已知并發(fā)癥最多。糖尿病腎病(Diabetic nephropathy,DN)是糖尿病發(fā)展過程中常見且難治性的微血管并發(fā)癥[1]。大量臨床數(shù)據(jù)都表明腎間質(zhì)纖維化是DN腎損傷的重要環(huán)節(jié)[2]。目前研究證實,腎臟纖維化調(diào)控機制涉及多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,其中關(guān)注度較高的致纖維化因子是轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β,而參與腎臟纖維化的因子主要以TGF-β1為主。TGF-β1信號傳導(dǎo)包括Smads家族中Smad2和Smad3,在大量肝臟、腎臟以及心臟纖維化研究中,TGF-β1/Smad3信號通路發(fā)揮重要作用[3]。有研究表明,miR-27a通過影響腎纖維化、線粒體功能障礙和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與DN[4]。體外研究發(fā)現(xiàn)miR-27a可通過靶向抑制PPARγ而誘導(dǎo)NRK-52E細胞纖維化,其機制可能與TGF-β1/Smad3通路的激活有關(guān)[5]。

當歸補血湯是由黃芪和當歸以5∶1組成的中醫(yī)經(jīng)典方劑,已傳承數(shù)千年,是主治氣血虛發(fā)熱癥的基礎(chǔ)要方[6]。藥理學(xué)研究證實當歸補血湯可通過提高機體免疫、改善腎臟組織慢性缺氧狀態(tài)、調(diào)節(jié)血管活性物質(zhì)及細胞因子、抑制高糖下腎組織IRE1α/JNK等通路的表達、減輕高糖下腎臟的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)、調(diào)控巨噬細胞自噬等機制而發(fā)揮對DN的治療作用[7-9],本課題組前期證明當歸補血湯主要吸收成分對GK大鼠具有保護作用,但機制尚不清楚[10]。因此,本研究通過高糖誘導(dǎo)人腎近曲小管上皮細胞(HK-2細胞)纖維化,觀察當歸補血湯含藥血清對HK-2細胞纖維化的作用,深入研究miR-27a對糖尿病腎纖維化的作用機制。

1 材料

1.1 藥物與試劑

HK-2購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心;黃芪(北京同仁堂,批號:190919001);當歸(北京同仁堂,批號:259200103);DMEM/F12(美國GIBCO公司,批號:8119395);胎牛血清(美國GIBCO公司,批號:2275129);D-葡萄糖水合物(上海源葉生物科技有限公司,批號:S18F11H108777);BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)公司,批號:102511693028);MTT(德國Biofroxx公司,批號:EZ2811F232);miRNA 1st Strand cDNA Synthesis kit(南京諾唯贊生物科技有限公司,批號:7E480H0);miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix(南京諾唯贊生物科技有限公司,批號:7E421E0);Smad3-siRNA、con-siRNA、miR-27a-inhibitor、miR-27a-inhibitor negative control(加拿大Applied Biological Materials公司,批號:K21C15MA、K21C15ME、EW8552、EW8552);DNAfectinTMPlus Transfection Reagent、RNAifectinTMTransfection Reagent(加拿大Applied Biological Materials公司,批號:69170008、0155844840003);TGF-β1(美國Proteintech Group公司,批號:0332307MG28);SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)公司,批號:P0012A);β-肌動蛋白(β-actin)抗體、波形蛋白(Vimentin)抗體、Ⅳ型膠原(COL Ⅳ)抗體、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)抗體、Smad3抗體和TGF-β1抗體(美國Proteintech Group公司,批號:10004156、00098013、000083456、000086138、10004985、10011066);p-Smad3抗體(美國Affinity Biosciences公司,批號:7019561);PVDF膜(美國Millipore公司,批號:R0EB70106)。

1.2 儀器

酶標儀(美國Thermo Scientific公司，型號：GO1510)；凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司，型號：GelDoc2000)；熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司，型號：7500)。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

HK-2細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM/F12的培養(yǎng)基中,37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),細胞融合度達80%以上后,用0.25%EDTA進行消化,2～3 d傳代1次。

2.2 細胞分組

HK-2細胞分別設(shè)為對照組、高糖組、高糖+空白血清組、高糖+含藥血清組。對照組采用DMEM/F12的培養(yǎng)基+10%胎牛血清處理;高糖組采用30 mmol·L-1葡萄糖+10%胎牛血清處理;高糖+空白血清組采用30 mmol·L-1葡萄糖+10%大鼠空白血清處理;高糖+含藥血清組采用30 mmol·L-1葡萄糖+10%大鼠當歸補血湯含藥血清處理。

2.3 當歸補血湯及含藥血清的制備

按方劑稱取黃芪100 g,當歸20 g,置圓底燒瓶中,加8倍體積純水,室溫浸泡60 min,煮沸30 min。然后用紗布過濾,濾渣加入6倍體積的純凈水,煮30 min。過濾后,合并2次濾液,放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中,60 ℃旋轉(zhuǎn)濃縮濾液。將濃縮液(100 mL,1.2 g·mL-1)冷凍干燥24 h，制成凍干粉，凍干粉得率(凍干粉量/生藥量)為41.52%，凍干粉迅速轉(zhuǎn)移至自封袋中并置于低溫干燥避光處保存?zhèn)溆谩Ｊ褂脮r取凍干粉適量于燒杯中，加入80 ℃熱水溶解，配成相當于20 g·kg-1的灌胃湯劑。10只雄性Wistar大鼠,稱質(zhì)量,灌胃當歸補血湯(20 g·kg-1),連續(xù)3 d,每日2次,第3天灌胃1 h后,眼眶采血,靜置1 h后,4 ℃，3 000 r·min-1離心15 min,取上層血清為含藥血清,置于-80 ℃冰箱保存。10只雄性Wistar大鼠灌胃生理鹽水,連續(xù)3 d,每日2次,第3天灌胃1 h后,眼眶采血,后取上層血清為空白血清。

2.4 細胞處理和轉(zhuǎn)染

將細胞接種于6孔板中,37 ℃,5%CO2培養(yǎng)48 h,隨后不加TGF-β1或用5、10 ng·mL-1的TGF-β1處理細胞48 h,收集細胞用于后續(xù)實驗。

轉(zhuǎn)染前18～24 h,以一定密度接種細胞,使它們處于最佳培養(yǎng)條件。實驗分為對照組、miR-27a抑制劑組(加入miR-27a-inhibitor)、miR-27a抑制劑陰性對照組(加入miR-27a-inhibitor negative control)、Smad3-siRNA組(加入Smad3-siRNA)、Smad3-siRNA陰性對照組(加入Con-siRNA)。

轉(zhuǎn)染miR-27a抑制劑：在125 μL無血清、無抗生素培養(yǎng)基中稀釋8 μL的RNAifectin試劑,加入miR-27a-inhibitor或miR-27a-inhibitor negative control使每孔終濃度為50 nmol·mL-1,室溫孵育20 min后每孔加入0.8 mL無血清、無抗生素的培養(yǎng)基,5～8 h后換液為含血清和抗生素的培養(yǎng)基，并加入外源性TGF-β1刺激細胞，48～72 h后提取蛋白質(zhì)。

轉(zhuǎn)染Smad3-siRNA：將6.0 μL DNAfectin Plus添加到含2 μg Smad3-siRNA或Con-siRNA的200 μL無血清、無抗生素培養(yǎng)基中,室溫下穩(wěn)定3～5 h后轉(zhuǎn)移至6孔板中,12 h后更換培養(yǎng)基，加入外源性TGF-β1刺激細胞，48 h后提取蛋白質(zhì)。

2.5 MTT法檢測細胞增殖率

混懸細胞密度為5×104mL-1,96孔板每孔加入200 μL。5%CO2,37 ℃孵育,細胞貼壁后,按“2.2”項下細胞分組分別處理細胞12、24、48 h。每孔加入20 μL MTT溶液,孵育4 h,每孔加入150 μL二甲基亞砜,然后置于搖床低速震蕩10 min,在490 nm處測量吸光度,細胞增殖率=(OD實驗組-OD調(diào)零組)/(OD對照組-OD調(diào)零組)×100%。

2.6 Western blot法檢測纖維化相關(guān)蛋白的表達

給藥48 h后,HK-2細胞用RIPA緩沖液裂解,BCA法測蛋白濃度。通過SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜,用5%BSA封閉,與一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜,TBST洗膜3次后,孵育二抗(1∶5 000)并通過ECL檢測蛋白質(zhì)條帶,使用Image J軟件分析。

2.7 qPCR檢測纖維化相關(guān)mRNA表達

給藥48 h后,用TRIzol試劑從HK-2細胞中提取總RNA。根據(jù)qPCR試劑盒進行轉(zhuǎn)錄及擴增。引物序列由鎮(zhèn)江愛必夢生物科技有限公司合成,相應(yīng)的引物序列顯示在表1。相對定量采用2-ΔΔCt法，U6或β-actin作為內(nèi)參。

表1 qPCR引物序列Table 1 Primer sequences for qPCR

2.8 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 當歸補血湯含藥血清對HK-2細胞增殖率的影響

分別給藥12、24、48 h,結(jié)果表明,與對照組相比,高糖組細胞增殖率顯著下降(P<0.01),當歸補血湯含藥血清共培養(yǎng)后增殖率顯著升高(P<0.05),且48 h效果最顯著(P<0.001)。見表2。

表2 當歸補血湯含藥血清對HK-2細胞增殖率的影響Table 2 Effect of Danggui Buxue Decoction (DBD) containing serum on HK-2 proliferative

3.2 當歸補血湯含藥血清對HK-2細胞纖維化相關(guān)蛋白表達的影響

給藥48 h后,與對照組相比,高糖組Vimentin、α-SMA、COL Ⅳ、TGF-β1、p-Smad3/Smad3蛋白表達升高(P<0.05,P<0.01,P<0.001),當歸補血湯含藥血清可明顯降低纖維化蛋白的表達(P<0.05，P<0.01)。說明當歸補血湯含藥血清可能通過TGF-β1/Smad3通路抑制高糖誘導(dǎo)的纖維化。見圖1和表3。

表3 當歸補血湯對HK-2細胞纖維化相關(guān)蛋白表達的影響Table 3 Effect of DBD containing serum on the expression of fibrosis-related proteins in HK-2 cells

3.3 當歸補血湯含藥血清對HK-2細胞miR-27a及纖維化相關(guān)mRNA表達的影響

與對照組相比,高糖組miR-27a的表達升高(P<0.01),當歸補血湯含藥血清可降低miR-27a的表達(P<0.01)。高糖組各纖維化相關(guān)因子mRNA的表達升高(P<0.05，P<0.001),當歸補血湯含藥血清可明顯降低這些mRNA的表達(P<0.05，P<0.01)。提示當歸補血湯含藥血清可能是通過miR-27a抑制細胞纖維化的。見表4。

注:A.對照組；B.高糖組；C.高糖+空白血清組；D.高糖+含藥血清組圖1 當歸補血湯含藥血清處理HK-2細胞48 h纖維化相關(guān)蛋白表達的條帶Fig.1 Electrophoresis bands of fibrosis-related proteins in HK-2 cells treated with DBD containing serum for 48 h

表4 當歸補血湯對HK-2細胞纖維化相關(guān)mRNA表達的影響Table 4 Effect of DBD containing serum on the expression of fibrosis-related mRNA in HK-2 cells

3.4 TGF-β1及當歸補血湯處理HK-2細胞對miR-27a表達的影響

向培養(yǎng)基中不加TGF-β1或加入5、10 ng·mL-1的TGF-β1,觀察miR-27a表達的變化。結(jié)果表明,miR-27a呈劑量依賴式遞增(P<0.05,P<0.01)，說明5、10 ng·mL-1TGF-β1誘導(dǎo)了HK-2細胞的纖維化,且隨著細胞纖維化的加劇,miR-27a的表達增加。見表5。

表5 TGF-β1處理HK-2細胞對miR-27a表達的影響Table 5 The effect of TGF-β1 treatment on the expression of miR-27a in HK-2 cells

向培養(yǎng)基中加入5 ng·mL-1TGF-β1,對照組加入10%空白血清,當歸補血湯組加入10%含藥血清。與對照組相比,當歸補血湯組miR-27a表達降低(P<0.001),說明當歸補血湯可降低TGF-β1誘導(dǎo)的纖維化細胞中miR-27a的表達。見表6。

表6 TGF-β1及當歸補血湯含藥血清處理HK-2細胞對miR-27a表達的影響Table 6 The effect of TGF-β1 and DBD containing serum on the expression of miR-27a in HK-2 cells

3.5 轉(zhuǎn)染Smad3-siRNA及miR-27a抑制劑對TGF-β1處理后HK-2細胞纖維化相關(guān)蛋白表達的影響

結(jié)果表明,與對照組(不加TGF-β1)相比,采用5 ng·mL-1的TGF-β1處理HK-2細胞后,細胞纖維化蛋白Vimentin、α-SMA、COL Ⅳ和p-Smad3/Smad3表達的升高(P<0.01,P<0.001),轉(zhuǎn)染miR-27a抑制劑后可明顯降低TGF-β1誘導(dǎo)的纖維化相關(guān)蛋白表達的升高(P<0.05,P<0.01),轉(zhuǎn)染Smad3-siRNA也表現(xiàn)出同樣的效果(P<0.05,P<0.01),說明抑制miR-27a和Smad3的表達可抑制細胞纖維化,值得注意的是,miR-27a抑制劑可明顯降低p-Smad3/Smad3的表達(P<0.01)。結(jié)果表明,當歸補血湯含藥血清是通過下調(diào)miR-27a/TGF-β1/Smad3的表達抑制HK-2細胞纖維化的。見圖2。

注:anti-miR-27a.miR-27a抑制劑組;miR-Ctrl.miR-27a抑制劑陰性對照組;Smad3-siRNA.Smad3-siRNA組;Con-siRNA.Smad3-siRNA陰性對照組。組間比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。圖2 轉(zhuǎn)染Smad3-siRNA及miR-27a抑制劑對TGF-β1處理后HK-2細胞纖維化相關(guān)蛋白表達的影響Fig.2 Transfection of Smad3-siRNA and miR-27a inhibitor on the expression of fibrosis-related proteins in HK-2 cells after TGF-β1 treatment

4 討論

DN的主要起始機制是高血糖引起的血管功能障礙,但其進展是由氧化應(yīng)激、炎癥和纖維化等不同的病理機制引起的[11]。目前已認識到纖維化在DN進展中的作用似乎對于DN最終進展為腎功能衰竭至關(guān)重要[12]。一般來說,DN的獨特病理變化包括系膜細胞增殖、系膜增寬和細胞外基質(zhì)(ECM)異常積聚,導(dǎo)致腎小管間質(zhì)纖維化,最終導(dǎo)致慢性腎功能衰竭,降低患者的生活質(zhì)量和危及患者生命[13]。因此,探究DN腎纖維化的作用機制及其治療對策具有重要意義。當歸補血湯在改善纖維化,如肺纖維化、肝纖維化等方面已有多種報道[14-15]。有證據(jù)表明,當歸補血湯可通過抑制單側(cè)輸尿管梗阻大鼠模型中的NLRP3炎性小體減輕腎小管間質(zhì)纖維化[16]。多項研究指出,miRNAs在腎纖維化中發(fā)揮重要作用,如miR-21a、miR-23b和miR-27a等[17-19]。但當歸補血湯是否會通過miR-27a及TGF-β1/Smad3通路發(fā)揮抗腎纖維化作用還未知。本研究結(jié)果表明,當歸補血湯含藥血清可促進高糖條件下HK-2細胞的增殖，抑制高糖條件下腎纖維化相關(guān)標志物α-SMA、Vimentin和COL Ⅳ蛋白及mRNA表達。據(jù)報道,大多數(shù)研究將纖維化進展中的關(guān)鍵作用歸因于TGF-β,它通過激活下游Smad信號通路來執(zhí)行其生物學(xué)功能[20]，并且有數(shù)據(jù)表明Smad3在纖維化發(fā)展中具有致病作用。因此，本研究檢測了TGF-β1及p-Smad3/Smad3的表達，結(jié)果表明,TGF-β1及p-Smad3/Smad3在高糖中被上調(diào),細胞纖維化加重,當歸補血湯含藥血清可下調(diào)TGF-β1及p-Smad3/Smad3的表達,改善細胞纖維化,提示當歸補血湯可能是通過TGF-β1/Smad3通路改善腎纖維化的。據(jù)報道，miR-27a在糖尿病腎小管間質(zhì)纖維化中發(fā)揮作用[21]。因此我們檢測了miR-27a在HK-2細胞中的表達情況。結(jié)果表明高糖條件下miR-27a的表達升高,當歸補血湯含藥血清可抑制miR-27a的表達,提示當歸補血湯可能是通過調(diào)節(jié)miR-27a來改善纖維化的。

TGF-β與多種miRNA相互調(diào)節(jié),正向或負向調(diào)節(jié)腎纖維化的進程[22-23]，所以我們采用不同濃度的TGF-β1處理HK-2細胞,以刺激細胞纖維化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TGF-β1可以促進細胞纖維化,從而上調(diào)HK-2細胞中miR-27a的表達,而當歸補血湯可以改善這些作用，表明miR-27a可能是TGF-β1在促進腎小管上皮細胞纖維化表型轉(zhuǎn)變中的重要介質(zhì)。

Smad轉(zhuǎn)錄因子位于TGF-β信號通路的中心,已有研究證實在纖維化動物模型及慢性腎病人中TGF-β1通路激活以及Smad2、Smad3蛋白表達升高[20]。有證據(jù)表明,Smad3 KO小鼠腎小管間質(zhì)纖維化程度明顯減輕[24],使用Smad3 KO動物等觀察到,COL Ⅳ基因表達的調(diào)節(jié)在腎小球內(nèi)皮細胞中是Smad3依賴性的[25]。重要的是,通過轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后機制調(diào)節(jié)miRNA表達可能涉及Smad蛋白。最近的研究表明,Smad3介導(dǎo)的miR-21上調(diào)可促進腎纖維化[26]。因此我們在先前的研究基礎(chǔ)上,采用Smad3-siRNA、miR-27a抑制劑及5 ng·mL-1的TGF-β1處理細胞,結(jié)果表明Smad3的缺失以及miR-27a抑制劑均會降低TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細胞纖維化。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn),細胞中低表達miR-27a可抑制HK-2細胞纖維化,因此當歸補血湯通過miR-27a/TGF-β1/Smad3通路可改善高糖誘導(dǎo)的HK-2細胞纖維化。