廖桂彬,唐舒婷,廖曉意,蘭紹陽,胡玲,陳斌,樊冬梅,李培武,陳昫

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,廣東 廣州 510405;2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,廣東 廣州 510405;3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新中心,廣東 廣州 510405)

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,Hp)相關(guān)性胃病是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對于Hp感染所引起胃黏膜病變的簡稱,包括慢性非萎縮性胃炎(Chronic non-atrophic gastritis,CNAG)、慢性萎縮性胃炎(Chronic atrophic gastritis,CAG)以及胃癌(Gastric cancer,GC)[1-2]。近年來，許多中醫(yī)學(xué)者對Hp相關(guān)性胃病“病-證”關(guān)系進(jìn)行了相關(guān)研究[3]，李京堯、陳瑤等多項(xiàng)研究提示Hp相關(guān)性胃病實(shí)證常見脾胃濕熱證及肝胃不和證,以脾胃濕熱證為主，熱、濕是其主要病理因素,而脾氣虛證是Hp相關(guān)性胃病中出現(xiàn)頻率較高的虛證證型,提示脾胃濕熱、脾氣虛與Hp相關(guān)性胃病的發(fā)病具有一定相關(guān)性[4-5]。

胃內(nèi)微生態(tài)可直觀地顯示胃內(nèi)菌群的組成及結(jié)構(gòu)特征,越來越多的研究發(fā)現(xiàn),胃內(nèi)微生態(tài)失衡可能是Hp相關(guān)性胃病的重要致病因素之一[6-8]。課題組前期研究顯示,慢性胃炎脾胃濕熱證組Hp感染率與脾氣虛證組相當(dāng),但感染程度高于脾氣虛證組[9],此外,前期研究發(fā)現(xiàn)脾胃濕熱證組白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白介素-8(Interleukin-8,IL-8)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)等mRNA及蛋白均處于高表達(dá)狀態(tài)[10-11],而IL-1β的強(qiáng)效抑酸作用可升高胃內(nèi)pH值,有利于胃內(nèi)細(xì)菌繁殖,提示Hp相關(guān)性胃病脾胃濕熱證的發(fā)生可能與胃內(nèi)微生態(tài)失衡存在一定聯(lián)系。但目前鮮有關(guān)于Hp相關(guān)性胃病中醫(yī)證型胃內(nèi)微生態(tài)的研究,因此，本研究擬通過探究Hp相關(guān)性胃病脾胃濕熱證、脾氣虛證患者與健康受試者之間胃黏膜菌群特征以及炎癥因子的表達(dá)差異,為Hp相關(guān)性胃病中醫(yī)證型形成的機(jī)制研究提供思路。

1 臨床資料

1.1 一般資料

選取2019年11月至2020年10月在廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院脾胃病科內(nèi)窺鏡室和胃腸外科就診,且病理確診為Hp相關(guān)性胃病的患者107例(包含CNAG患者49例,CAG患者45例,GC患者13例),其中脾胃濕熱證患者70例,脾氣虛證患者37例,同時(shí)招募平和體質(zhì)健康受試者10例作為正常對照組。3組年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),3組性別比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。脾胃濕熱證組和脾氣虛證組的Hp相關(guān)性胃病不同病種比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),詳見表2,具有可比性。本研究經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(倫理批號(hào):ZYYECK〔2019〕095)。

表1 Hp相關(guān)性胃病不同證候患者性別、年齡比較Table 1 Comparison of sex and age of different evidence of

表2 Hp相關(guān)性胃病不同證候患者病種比較Table 2 Comparison of disease types between different evidence of Hp-related gastropathy

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照2017年中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化病分會(huì)發(fā)布的《中國慢性胃炎共識(shí)意見》[12]中CNAG和CAG的診斷標(biāo)準(zhǔn):取4塊標(biāo)本(胃竇距幽門2～3 cm大彎、小彎、前壁和后壁各1塊),CNAG內(nèi)鏡下可見黏膜紅斑、黏膜出血點(diǎn)或斑塊、黏膜粗糙伴或不伴水腫、充血滲出等基本表現(xiàn)。CAG內(nèi)鏡下可見黏膜紅白相間,以白相為主,皺襞變平甚至消失,部分黏膜血管顯露;可伴有黏膜顆?；蚪Y(jié)節(jié)狀等表現(xiàn)。慢性胃炎患者胃鏡病理活檢若提示固有腺體有萎縮即可診斷為CAG,若無則為CNAG。胃癌的診斷通過內(nèi)鏡下胃黏膜組織活檢病理結(jié)果或手術(shù)室標(biāo)本病理結(jié)果確定最終診斷。

1.2.2 中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn) 脾胃濕熱證和脾氣虛證的診斷標(biāo)準(zhǔn)均參照2002年《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則(試行)》[13]。

脾胃濕熱證：主癥包括胃脘痛或脹痛，大便黏滯不爽，納呆食少，舌苔黃膩;次癥包括脘痞惡心，口苦而黏，肢體困重，渴而少飲。具備舌苔黃膩并同時(shí)具備其余主癥2項(xiàng)，或主癥1項(xiàng)及次癥2項(xiàng)，或次癥3項(xiàng),即可診斷。

脾氣虛證：主癥包括食少納呆，體倦乏力，食后腹脹，大便異常(溏、爛、先硬后溏、時(shí)溏時(shí)硬);次癥包括神疲懶言，口淡不渴，腹痛綿綿，惡心嘔吐，脘悶，腸鳴，面色萎黃，浮腫，排便無力，舌質(zhì)淡，舌體胖或有齒印，苔薄白，脈細(xì)弱或沉弱。具備主癥2項(xiàng)和次癥1項(xiàng),即可診斷。

1.2.3 健康受試者納入標(biāo)準(zhǔn) ①內(nèi)鏡下提示僅慢性淺表性胃炎,無活動(dòng)性炎癥;②Hp檢測結(jié)果陰性;③無呼吸、循環(huán)、消化、泌尿、神經(jīng)系統(tǒng)等疾病,無臨床其他不適癥狀；④由2位主任醫(yī)師對其體質(zhì)辨識(shí)為平和體質(zhì)者；⑤所有受試對象均簽署試驗(yàn)知情文件。

1.3 Hp相關(guān)性胃病納入標(biāo)準(zhǔn)

①符合CNAG、CAG或GC的病理診斷,且中醫(yī)證候符合脾胃濕熱證或脾氣虛證辨證標(biāo)準(zhǔn);②年齡在18～70歲之間;③Hp感染史，且近1個(gè)月未行Hp根除療法，未使用抗生素、益生菌、鉍劑、H2受體拮抗劑和質(zhì)子泵抑制劑(Proton pump inhibitor,PPI)者;④所有受試對象均簽署試驗(yàn)知情文件。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)

①合并有嚴(yán)重心、腦、肺、肝、腎及神經(jīng)系統(tǒng)疾病者;②近期有消化道出血病史者;③孕婦、哺乳期婦女。

2 方法

2.1 胃黏膜樣本采集

所有Hp相關(guān)性胃病受試者及健康受試者均行電子胃鏡檢查,并于胃竇距幽門口2～3 cm處的大、小彎或前、后壁鉗取4塊直徑約0.2～0.3 cm的胃黏膜組織進(jìn)行檢測,其中1塊行病理學(xué)組織檢測；1塊行免疫組化蛋白檢測；1塊放入裝有RNA保存液的凍存管中,隨后立即投入液氮瓶并轉(zhuǎn)移至-80 ℃低溫冰箱保存以備16S rDNA測序；另留取1塊樣本備用。胃癌標(biāo)本則剪取手術(shù)切除的腫物組織、距離腫物2～3 cm的組織、遠(yuǎn)癌組織各4塊直徑約0.2～0.3 cm胃黏膜組織,處理同前。將-80 ℃低溫冰箱保存的樣本送至廣州華銀健康科技有限公司行16S rDNA測序。

2.2 胃黏膜菌群檢測

提取胃黏膜樣本中的總DNA,利用16S rDNA技術(shù)對V3～V4區(qū)的DNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增,然后通過Illumina Miseq測序平臺(tái)進(jìn)行測序,構(gòu)建DNA文庫,測序獲得的原始數(shù)據(jù)(Raw reads)進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾和優(yōu)化后進(jìn)行下游分析,使用VSEARCH(v2.3.4)軟件按照相似度>97%的原則將原始數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類,得到OTU代表序列。使用RDP classifer(v2.2)軟件將OTU代表序列與Silva數(shù)據(jù)庫比對進(jìn)行物種注釋分析[14]。主要采用R軟件(v3.5.1)、QIIME(v1.80)軟件和mothur(v1.39.5)軟件進(jìn)行菌群生物信息分析,包括α多樣性分析和線性判別分析(LDA Effect size分析,LEfSe分析)等。

2.3 胃黏膜NLRP3和IL-1β蛋白表達(dá)水平檢測

采用二步免疫組織化學(xué)標(biāo)記法檢測胃黏膜NLRP3和IL-1β蛋白表達(dá)水平,試劑盒購自Servicebio公司,貨號(hào)分別為:GB11086、GB23303,具體操作步驟按試劑盒說明進(jìn)行。顯微鏡(型號(hào):XSP-C204)進(jìn)行鏡檢、圖像采集分析。根據(jù)細(xì)胞的染色程度進(jìn)行評分:細(xì)胞不染色計(jì)為0分;染色程度為淡黃色、棕黃色、棕褐色分別計(jì)為1分、2分、3分。另根據(jù)染色細(xì)胞占據(jù)視野細(xì)胞總數(shù)的百分比來進(jìn)行評分,隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(200×)。陽性細(xì)胞百分比<1%計(jì)0分；1%≤，<25%記1分；25%≤，<50%記2分；50%≤，<75%記3分；75%≤，≤100%記4分。陽性細(xì)胞染色程度得分與陽性細(xì)胞所占百分比得分的乘積即為免疫組織化學(xué)法總分,其中0分為陰性，記(-)；1～4分為輕度，記(+)；5～8分為中度，記(++)；9分及以上為重度，記(+++)。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 胃黏膜菌群α多樣性分析

所有樣本共計(jì)得到5 350 839條序列,平均每個(gè)樣本45 733條。物種累積曲線圖中可見曲線先迅速上升,后趨于平緩,說明樣本量已足夠滿足檢測需求,詳見圖1。

圖1 物種累計(jì)曲線Fig.1 Species accumulation curves

非參數(shù)檢驗(yàn)分析胃黏膜菌群α多樣性指數(shù),結(jié)果提示，與正常對照組比較,脾胃濕熱證組菌群多樣性指數(shù)(Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù))差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),Chao指數(shù)和Ace指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),詳見表3。與正常對照組比較,脾氣虛證組Simpson指數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),Shannon指數(shù)、Chao指數(shù)和Ace指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),詳見表4。

表3 Hp相關(guān)性胃病脾胃濕熱證胃黏膜菌群的α多樣性分析[M(P25,P75)]Table 3 α diversity analysis of gastric mucosa microflora in Hp-related gastropathy with spleen-stomach damp-heat syndrome [M(P25, P75)]

表4 Hp相關(guān)性胃病脾氣虛證胃黏膜菌群的α多樣性分析[M(P25,P75)]Table 4 α diversity analysis of gastric mucosa microflora in Hp-related gastropathy with spleen-qi deficiency syndrome [M(P25, P75)]

3.2 胃黏膜菌群β多樣性分析

基于Unweighted UniFrac距離,不考慮序列豐度,只考慮序列數(shù)量,采用主坐標(biāo)分析(Principal coordinates analysis,PCoA)的方法研究各組樣品間差異。研究發(fā)現(xiàn)3組樣本均呈現(xiàn)不同程度的重疊,組間差異不顯著,詳見圖2。

圖2 脾胃濕熱證組、脾氣虛證組和正常對照組胃黏膜菌群的多樣性PCoA圖Fig.2 PCoA diagram of diversity of gastric mucosa microflora in spleen and stomach damp-heat syndrome group, spleen-qi deficiency syndrome group and normal control group

3.3 胃黏膜菌群結(jié)構(gòu)及組成分析

通過分析各組優(yōu)勢菌門(相對豐度>1%)結(jié)果發(fā)現(xiàn):門水平,與正常對照組比較,脾胃濕熱證患者胃黏膜的放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)相對豐度顯著減少(P<0.05,P<0.01),脾氣虛證組患者未見明顯優(yōu)勢菌群。屬水平,與正常對照組比較,脾胃濕熱證組胃黏膜的幽門螺桿菌屬(Helicobacter)相對豐度顯著增加(P<0.01),奈瑟氏菌屬(Neisseria)相對豐度減少(P<0.05),脾氣虛證組幽門螺桿菌屬相對豐度顯著增加(P<0.01)，詳見圖3，表5～6。

圖3 脾胃濕熱證組、脾氣虛證組和正常對照組在門(A)、屬(B)水平的物種豐度組成Fig.3 Species abundance at phylum (A) and genus (B) level in spleen and stomach damp-heat syndrome group, spleen-qi deficiency group and normal control group

表5 Hp相關(guān)性胃病脾胃濕熱證門、屬水平差異菌群Table 5 Differential flora in Hp-related gastropathy with spleen and stomach damp-heat syndrome at the phylum and genus level

表6 Hp相關(guān)性胃病脾氣虛證屬水平差異菌群Table 6 Differential flora in Hp-related gastropathy with spleen-qi deficiency syndrome at the genus level

3.4 Hp相關(guān)性胃病脾胃濕熱證、脾氣虛證患者胃黏膜的標(biāo)志菌群

為進(jìn)一步探索Hp相關(guān)性胃病脾胃濕熱證、脾氣虛證組的胃黏膜標(biāo)志菌群,本研究采用LEfSe分析[15],標(biāo)志菌群需滿足閾值P<0.05且LDA score值≥3.0(或≤-3.0)。脾胃濕熱證組和正常對照組比較，在屬水平，脾胃濕熱證組的胃黏膜優(yōu)勢菌群為幽門螺桿菌屬(Helicobacter)，正常對照組的胃黏膜優(yōu)勢菌群為奈瑟氏菌屬(Neisseria)，詳見圖4。脾氣虛證組與正常對照組比較，在屬水平，脾氣虛證組胃黏膜優(yōu)勢菌群為幽門螺桿菌屬(Helicobacter)，正常對照組無優(yōu)勢菌群，詳見圖5。

圖4 Hp相關(guān)性胃病脾胃濕熱證優(yōu)勢菌群Fig.4 The dominant flora of Hp-related gastropathy with spleen-stomach damp-heat syndrome

圖5 Hp相關(guān)性胃病脾氣虛證組優(yōu)勢菌群Fig.5 The dominant flora of Hp-related gastropathy with spleen-qi deficiency syndrome

3.5 胃黏膜組織NLRP3、IL-1β蛋白表達(dá)水平

與正常對照組比較,脾胃濕熱證組、脾氣虛證組NLRP3、IL-1β蛋白表達(dá)水平均顯著增加(P<0.05),詳見表7～8、圖6～7。

表7 Hp相關(guān)性胃病脾胃濕熱證、脾氣虛證的NLRP3蛋白表達(dá)Table 7 NLRP3 protein expression in Hp-related gastropathy with spleen-stomach damp-heat syndrome and spleen-qi deficiency syndrome

表8 Hp相關(guān)性胃病脾胃濕熱證、脾氣虛證的IL-1β蛋白表達(dá)Table 8 IL-1β protein expression in Hp-related gastropathy with spleen-stomach damp-heat syndrome and spleen-qi deficiency syndrome

4 討論

Hp相關(guān)性胃病在我國發(fā)病率較高,其發(fā)病機(jī)制主要與Hp感染相關(guān),若遷延不愈,Hp等菌群作為腫瘤微環(huán)境的重要因素之一,可通過影響機(jī)體免疫狀態(tài)促進(jìn)慢性胃炎向胃癌發(fā)生發(fā)展[16]。

注:A.脾胃濕熱證組;B.脾氣虛證組;C.正常對照組圖6 胃黏膜組織中NLRP3蛋白表達(dá)水平(×200)Fig.6 Expression of NLRP3 in gastric mucosa tissue(×200)

注:A.脾胃濕熱證組;B.脾氣虛證組;C.正常對照組圖7 胃黏膜組織中IL-1β蛋白表達(dá)水平(×200)Fig.7 Expression of IL-1β in gastric mucosa tissue(×200)

目前中醫(yī)藥對于Hp相關(guān)性胃病的臨床癥狀改善甚至逆轉(zhuǎn)取得了顯著的療效。脾胃濕熱證、脾氣虛證分別是Hp相關(guān)胃病實(shí)證及虛證的常見證型,然而目前關(guān)于Hp相關(guān)性胃病的研究多集中于腸道菌群或舌苔菌群特征的研究[10,17-21],不同中醫(yī)證型的胃內(nèi)微生態(tài)及炎癥水平變化的研究較少。因此，本文系統(tǒng)分析了Hp相關(guān)性胃病脾胃濕熱證、脾氣虛證患者胃黏膜的菌群特征及胃黏膜炎癥因子的表達(dá),研究發(fā)現(xiàn)Hp相關(guān)性胃病脾胃濕熱證患者幽門螺桿菌屬相對豐度顯著升高,奈瑟氏菌屬相對豐度顯著降低,幽門螺桿菌屬是脾胃濕熱證患者的胃黏膜優(yōu)勢菌屬。同時(shí),脾氣虛證患者幽門螺桿菌屬相對豐度亦顯著升高，提示二者均為幽門螺桿菌屬的易感證型。與課題組前期研究發(fā)現(xiàn)脾胃濕熱證和脾氣虛證均有較高的Hp感染率結(jié)果相一致。

菌群失衡可影響宿主免疫系統(tǒng)功能的正常發(fā)揮[9,22],IL-1β等炎癥因子作為先天宿主防御介質(zhì)直接受其影響[23],Fan等[24]發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌的增加可抑制IL-1β的表達(dá),從而緩解腸道炎癥。而炎癥作為機(jī)體免疫的重要環(huán)節(jié),亦可影響胃內(nèi)微生態(tài)的組成和結(jié)構(gòu),從而破壞胃黏膜菌群的動(dòng)態(tài)平衡[16,25],Ling等發(fā)現(xiàn)胃癌腫瘤微環(huán)境中的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞表達(dá)改變與胃微生物群失調(diào)相關(guān)[26]。本研究發(fā)現(xiàn)脾胃濕熱證組的胃黏膜菌群多樣性低于正常對照組,而NLRP3和IL-1β蛋白表達(dá)水平高于正常對照組,提示胃黏膜菌群多樣性減少、物種豐度下降等菌群失調(diào)現(xiàn)象可能與炎癥反應(yīng)相互作用,影響機(jī)體免疫,從而促進(jìn)了Hp相關(guān)性胃病脾胃濕熱證的形成。奈瑟氏菌屬等為正常對照組的優(yōu)勢菌，齊城成等[27]發(fā)現(xiàn)健康薄白苔和病理黃膩苔(濕熱證的主要征象之一)中奈瑟氏菌屬的豐度存在差異,認(rèn)為奈瑟氏菌屬可能是區(qū)別健康薄白苔和病理黃膩苔的菌群之一。

幽門螺桿菌屬導(dǎo)致Hp相關(guān)性胃病的發(fā)病可能與其導(dǎo)致胃黏膜長期處于炎癥狀態(tài)有關(guān)。IL-1β作為經(jīng)典的促炎細(xì)胞因子,多項(xiàng)研究表明IL-1β在Hp感染患者胃黏膜的表達(dá)高低與Hp感染的相關(guān)炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[28-30]。細(xì)胞毒素相關(guān)基因A蛋白(Cytotoxin associated gene A protein,CagA)是Hp的主要毒力因子之一,可通過激活NF-κB信號(hào)通路,活化NLRP3炎癥體,促進(jìn)IL-1β、IL-18的釋放,激活細(xì)胞焦亡,進(jìn)而加重炎癥反應(yīng)[22]。課題組前期發(fā)現(xiàn)Hp感染可激活NF-κB信號(hào),促進(jìn)其下游的相關(guān)因子IL-1β的高表達(dá)[11],隨后對IL-1β基因多態(tài)性的研究中發(fā)現(xiàn)IL-1β-511 TT基因型在脾胃濕熱證中的表達(dá)量有所升高,進(jìn)一步采用二代測序法篩查發(fā)現(xiàn)Hp感染患者體內(nèi)NODs通路被激活,NLRP3炎癥體處于高表達(dá)狀態(tài)[11]。本研究結(jié)果顯示Hp相關(guān)性胃病中脾胃濕熱證組和脾氣虛證組的NLRP3和IL-1β蛋白表達(dá)水平均顯著高于正常對照組,說明脾胃濕熱證、脾氣虛證的形成和NLRP3及IL-1β蛋白表達(dá)密切相關(guān)，但脾胃濕熱證的NLRP3和IL-1β感染以中、重度表達(dá)為多,而脾氣虛證中NLRP3和IL-1β的表達(dá)以輕、中度為主。提示NLRP3及IL-1β表達(dá)水平的升高可能是“濕熱”“脾氣虛”的重要致病機(jī)制之一。

綜上所述,胃黏膜菌群多樣性減少、炎癥程度升高可能是Hp相關(guān)性胃病脾胃濕熱證、脾氣虛證發(fā)病的內(nèi)在致病機(jī)理。脾胃濕熱證、脾氣虛證和正常對照組的差異優(yōu)勢菌群可能是其菌群標(biāo)志。本次研究尚未對不同證型之間菌群及相關(guān)機(jī)制進(jìn)行比較研究，課題組后續(xù)將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本,并納入Hp相關(guān)性胃病不同病種及不同證候,基于炎癥與菌群改變進(jìn)一步深入系統(tǒng)研究。