張永梅，曾賢德，曾雄，閔曦曦，陳煒，邱結(jié)華

（南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院 1.檢驗(yàn)科 2.血管外科，江西南昌 330006）

小動脈為阻力動脈或阻力血管，一般是指直徑200～500 μm 的動脈，其在維持機(jī)體血壓穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)組織血供中發(fā)揮重要作用[1-4]。正常情況下，其具有一定的緊張性，從而維持機(jī)體正常血壓[5]，調(diào)節(jié)器官和組織的血液灌注，而病理狀態(tài)將導(dǎo)致多種心血管系統(tǒng)疾病[6-7]。因此，小動脈功能調(diào)節(jié)機(jī)制的研究對心血管系統(tǒng)疾病的防治有非常重要價值。小動脈舒縮功能的調(diào)控取決于兩個方面[8-9]，第一、游離Ca2+濃度；第二、Ca2+敏感性（非Ca2+依賴），其中包括細(xì)胞骨架肌動蛋白（actin）穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)[10-11]。

腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）被稱為“能量調(diào)節(jié)器”[12-15]，機(jī)體中廣泛分布，在調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝和供需平衡方面發(fā)揮重要作用[16]。隨著AMPK 研究的深入，近年來發(fā)現(xiàn)其下游靶蛋白的數(shù)量和種類眾多，具有多種生物學(xué)效應(yīng)。動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究[17]表明非特異性活化AMPK 可以降低動脈血壓。在最近的兩項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，AMPK 可通過血管平滑肌肌漿/內(nèi)質(zhì)Ca2+-ATP 酶（sarcoplasmic/endoplasmic Ca2+-ATPase，SERCA）調(diào)節(jié)因子phospholamban 和BKCa通道調(diào)節(jié)Ca2+濃度，及通過調(diào)控細(xì)胞骨架actin 的穩(wěn)態(tài)來調(diào)節(jié)小動脈舒張（Ca2+敏感性）[10,18-19]。

前期研究[10]發(fā)現(xiàn)AMPK 通過14-3-3 蛋白的協(xié)助增加cofilin 去磷酸化，從而增加cofilin 活性，促進(jìn)細(xì)胞骨架鏈狀肌動蛋白（filamentous actin，F(xiàn)-actin）蛋白降解為單體肌動蛋白（globular actin，Gactin）。目前在小動脈中14-3-3 蛋白協(xié)助cofilin 去磷酸化的具體機(jī)制尚有待研究，本研究通過小鼠腸系膜上動脈研究AMPK 活化cofilin 的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

C57BL6/N 小鼠20 只（上海寶牧實(shí)驗(yàn)動物養(yǎng)殖場），雌雄不限，年齡8～12 周。所有操作均嚴(yán)格遵循動物實(shí)驗(yàn)相關(guān)規(guī)程。

1.2 動脈的分離和處理

方法如文獻(xiàn)[18]報道。簡要如下：斷頭處理小鼠，固定四肢，酒精噴灑消毒，切開皮膚皮下組織及腹壁，于腸系膜上動脈根部切斷，完整解剖游離腸系膜，用冷凍MOPS 緩沖液保存。在顯微鏡下按動脈分級分離腸系膜上動脈。取第II、III 級動脈用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 血管功能實(shí)驗(yàn)

按照文獻(xiàn)[10]的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：采用壓力myograph 模型，MOPS 液為緩沖液、血管壓力維持在60 cmH2O（1 cmH2O=0.098 kPa），水浴加溫至37 ℃，并確保后續(xù)實(shí)驗(yàn)均在37 ℃恒溫下進(jìn)行。首先，采用1 μmol/L 腎上腺素和30 μmol/L 乙酰膽堿（acetylcholine，Ach）處理進(jìn)行功能檢測，選取收縮率[（血管起始直徑-收縮后直徑）/血管起始直徑]＞30%及舒張率[（舒張后血管直徑-收縮后直徑）/（血管起始直徑-收縮后直徑）]＞90%的動脈用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。主要實(shí)驗(yàn)步驟如下：⑴用含SERCA抑制劑Thapsigargin（1 μmol/L）且無Ca2+的MOPS 預(yù)處理血管5 min；⑵采用高鉀（125 mmol/L）+Ca2+（0.5 mmol/L）+Thapsigargin（1 μmol/L）的MOPS 溶液預(yù)收縮腸系膜上動脈5 min；⑶分別加入AMPK激活劑PT1 30 μmol/L 和DMSO（PT1 溶劑）處理血管60 min，比較激活與非激活A(yù)MPK 狀態(tài)下腸系膜上動脈擴(kuò)張程度；⑷血管功能實(shí)驗(yàn)后收集各組血管，快速液氮處理，-80 ℃保存，用于后續(xù)的分子實(shí)驗(yàn)。

1.4 AMPK下游靶蛋白檢測

收集的標(biāo)本在液氮下碾成粉末狀，1×SDS 液裂解蛋白，Brandford 法蛋白定量，用Western blot 法檢測GAPDH、磷酸化AMPK（p-AMPK）、磷酸化cofilin（p-cofilin）的表達(dá)。用免疫熒光Western blot法檢測β-actin、熱休克蛋白20（heat shock protein 20，HSP20）及磷酸化HSP20（p-HSP20）。實(shí)驗(yàn)血管中G-actin 水平檢測：標(biāo)本按照G-actin/F-actin In Vivo Assay 試劑盒的說明步驟進(jìn)行處理（Cytoskeleton，Inc.，美國）[20]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

各種檢測蛋白表達(dá)量均為與內(nèi)參GAPDH 或β-actin 標(biāo)準(zhǔn)化值，采用SPSS 10.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血管功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果

血管活性功能檢測顯示兩組血管活性功能無顯著差異：PT1 組與對照組對1 mmol 腎上腺素收縮率分別為（37.25±1.86）%、（36.83±2.12）%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖1A）。PT1 組與對照組對30 μmol/L Ach 舒張率分別為（98.92±1.68）%、（97.83±1.95）%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖1B）。1 μmol/L Thapsigargin 無Ca2+的MOPS 預(yù)處理后PT1 組和對照組血管直徑分別為（261.4±12.4）μm 和（260.3±12.5）μm，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。預(yù)收縮5 min 后，PT1 組和對照組血管直徑分別為（134.5±6.3）μm、（135.3±7.7）μm，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。PT1 或DMSO 處理60 min 后，PT1 組血管明顯擴(kuò)張至（196.6±11.5）μm，對照組血管直徑為（136.1±8.1）μm，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）（圖1C）。

2.2 相關(guān)蛋白表達(dá)情況

與對照組比較，PT1 組血管組織中p-AMPK 水平明顯升高，而p-cofilin 水平明顯降低分別為對照組的（3.25±0.52）倍、（0.48 ±0.19）倍，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）（圖2）；與對照組比較，PT1 組血管組織中G-actin 水平明顯升高，為對照組的（2.26±0.64）倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）（圖3）；與對照組比較，PT1 組血管組織中總HSP20（t-HSP20）水平無明顯變化，但p-HSP20 水平明顯升高，為對照組的（2.45±0.52）倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）（圖4）。

3 討論

小動脈在機(jī)體血壓穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)組織血供中發(fā)揮重要作用[16]。前期通過體外完整小動脈（小鼠腸系膜上動脈）研究證實(shí)AMPK 可以通過非血管內(nèi)皮細(xì)胞依賴的兩種不同通路調(diào)節(jié)VSMC 胞漿游離Ca2+濃度從而調(diào)節(jié)VSMC/血管的舒縮[18]、也可以通過增加cofilin 活性降低細(xì)胞骨架F-actin 穩(wěn)態(tài)而擴(kuò)張血管[10]。本研究進(jìn)一步揭示AMPK 是通過HSP20 活化cofilin，從而發(fā)揮其促進(jìn)F-actin 去聚化功能，降低細(xì)胞骨架穩(wěn)態(tài)，降低VSMC 對Ca2+敏感性，從而導(dǎo)致血管擴(kuò)張。

通過各種條件刺激VSMC，使膜電位改變[21]，其胞漿游離Ca2+濃度升高，Ca2+與肌鈣蛋白結(jié)合，從而激活收縮單位：肌動蛋白（主要為F-actin）、肌球蛋白沿F-actin 長軸滑行，從而導(dǎo)致肌細(xì)胞收縮[22-23]。當(dāng)胞漿游離Ca2+濃度維持不變，如本研究采用高滲鉀溶液誘導(dǎo)細(xì)胞膜電位改變，VSMC 收縮能力的強(qiáng)弱主要由F-actin 穩(wěn)態(tài)決定。血管功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)激活A(yù)MPK 時，血管獲得緩慢擴(kuò)張，說明VSMC 收縮能力降低，即細(xì)胞骨架穩(wěn)態(tài)發(fā)生改變，主要表現(xiàn)為F-actin 去聚化加強(qiáng)。此也間接表明促進(jìn)F-actin 去聚化相關(guān)因子活性提高。

越來越多的證據(jù)[24-25]表明細(xì)胞骨架穩(wěn)態(tài)在調(diào)節(jié)肌細(xì)胞舒縮中發(fā)揮重要作用。細(xì)胞骨架主要由actin 構(gòu)成，其為微絲的結(jié)構(gòu)蛋白，它是真核細(xì)胞中表達(dá)最豐富的蛋白質(zhì)，以兩種形式存在，即單體（G-actin）和多聚體（F-actin）[25-26]。細(xì)胞骨架穩(wěn)態(tài)主要為F-actin 的穩(wěn)態(tài)，肌細(xì)胞收縮的重要環(huán)節(jié)為磷酸化的肌球蛋白輕鏈與F-actin 發(fā)生橋接反應(yīng)，從而使肌細(xì)胞收縮[22]。F/G-actin 處于聚化和去聚化動態(tài)平衡，受到多種actin 結(jié)合蛋白和去聚化蛋白調(diào)節(jié)，如cofilin、VASP、Arp2/3complex 及paxillin 等[25]。Miranda 等[27]在上皮細(xì)胞中證實(shí)AMPK可以通過Rho/ROK-cofilin 通路調(diào)控細(xì)胞骨架穩(wěn)態(tài)。近期在血小板的研究也發(fā)現(xiàn)AMPK 通過調(diào)節(jié)VASP及cofilin 磷酸化水平來調(diào)控細(xì)胞骨架的重組[28-29]。同時有研究[28]表明AMPK 調(diào)節(jié)actin 穩(wěn)態(tài)在細(xì)胞移行功能中發(fā)揮重要作用，發(fā)現(xiàn)AMPK 可以通過其新型靶點(diǎn)Pdlim5，抑制Arp2/3 信號途徑，從而降低G-actin 聚化抑制細(xì)胞移行。前期研究發(fā)現(xiàn)活化AMPK 能通過增加cofilin 的活性（即非磷酸化cofilin水平）從而擴(kuò)張腸系膜上動脈[10]。本研究延續(xù)前期研究，進(jìn)一步證實(shí)AMPK 活化血管中G-actin 含量顯著升高，而p-cofilin 活化水平顯著降低，說明活化AMPK 能增加F-actin 去聚，降低細(xì)胞骨架穩(wěn)態(tài)，且此機(jī)理為cofilin 活性增強(qiáng)。

AMPK 為磷酸激酶，其降低cofilin 磷酸化水平依賴于間接途徑。前期研究發(fā)現(xiàn)在小鼠腸系膜上動脈中主要依賴14-3-3 蛋白來實(shí)現(xiàn)[10]。此外有研究[30-32]發(fā)現(xiàn)磷酸化轉(zhuǎn)導(dǎo)HSP20 可能通過與p-cofilin競爭結(jié)合14-3-3 蛋白發(fā)揮調(diào)節(jié)F-actin 穩(wěn)態(tài)的功能。本研究在延續(xù)前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)活化AMPK時，血管p-cofilin 水平降低的同時p-HSP20 水平相應(yīng)升高。增加的p-HSP20 將與p-cofilin 競爭14-3-3蛋白結(jié)合位點(diǎn)，從而使p-cofilin 游離、易于被去磷酸化，增加其活性?；罨痗ofilin 促進(jìn)F-actin 去聚化，降低細(xì)胞骨架穩(wěn)態(tài)性，從而誘導(dǎo)血管擴(kuò)張。

總之，在小鼠小動脈中，HSP20 參與協(xié)助AMPK 活化cofilin，主要為活化AMPK 可以增加p-HSP20 水平，競爭結(jié)合p-cofilin 位點(diǎn)，使其去磷酸化，增加cofilin 活性，從而降低細(xì)胞骨架actin 穩(wěn)態(tài)，調(diào)節(jié)血管舒縮。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。