張永梅,曾賢德,曾雄,閔曦曦,陳煒,邱結華
(南昌大學第二附屬醫(yī)院 1.檢驗科 2.血管外科,江西南昌 330006)
小動脈為阻力動脈或阻力血管,一般是指直徑200~500 μm 的動脈,其在維持機體血壓穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)組織血供中發(fā)揮重要作用[1-4]。正常情況下,其具有一定的緊張性,從而維持機體正常血壓[5],調(diào)節(jié)器官和組織的血液灌注,而病理狀態(tài)將導致多種心血管系統(tǒng)疾病[6-7]。因此,小動脈功能調(diào)節(jié)機制的研究對心血管系統(tǒng)疾病的防治有非常重要價值。小動脈舒縮功能的調(diào)控取決于兩個方面[8-9],第一、游離Ca2+濃度;第二、Ca2+敏感性(非Ca2+依賴),其中包括細胞骨架肌動蛋白(actin)穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)[10-11]。
腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK)被稱為“能量調(diào)節(jié)器”[12-15],機體中廣泛分布,在調(diào)節(jié)機體能量代謝和供需平衡方面發(fā)揮重要作用[16]。隨著AMPK 研究的深入,近年來發(fā)現(xiàn)其下游靶蛋白的數(shù)量和種類眾多,具有多種生物學效應。動物體內(nèi)實驗研究[17]表明非特異性活化AMPK 可以降低動脈血壓。在最近的兩項研究中發(fā)現(xiàn),AMPK 可通過血管平滑肌肌漿/內(nèi)質(zhì)Ca2+-ATP 酶(sarcoplasmic/endoplasmic Ca2+-ATPase,SERCA)調(diào)節(jié)因子phospholamban 和BKCa通道調(diào)節(jié)Ca2+濃度,及通過調(diào)控細胞骨架actin 的穩(wěn)態(tài)來調(diào)節(jié)小動脈舒張(Ca2+敏感性)[10,18-19]。
前期研究[10]發(fā)現(xiàn)AMPK 通過14-3-3 蛋白的協(xié)助增加cofilin 去磷酸化,從而增加cofilin 活性,促進細胞骨架鏈狀肌動蛋白(filamentous actin,F(xiàn)-actin)蛋白降解為單體肌動蛋白(globular actin,Gactin)。目前在小動脈中14-3-3 蛋白協(xié)助cofilin 去磷酸化的具體機制尚有待研究,本研究通過小鼠腸系膜上動脈研究AMPK 活化cofilin 的機制。
C57BL6/N 小鼠20 只(上海寶牧實驗動物養(yǎng)殖場),雌雄不限,年齡8~12 周。所有操作均嚴格遵循動物實驗相關規(guī)程。
方法如文獻[18]報道。簡要如下:斷頭處理小鼠,固定四肢,酒精噴灑消毒,切開皮膚皮下組織及腹壁,于腸系膜上動脈根部切斷,完整解剖游離腸系膜,用冷凍MOPS 緩沖液保存。在顯微鏡下按動脈分級分離腸系膜上動脈。取第II、III 級動脈用于實驗。
按照文獻[10]的方法進行實驗:采用壓力myograph 模型,MOPS 液為緩沖液、血管壓力維持在60 cmH2O(1 cmH2O=0.098 kPa),水浴加溫至37 ℃,并確保后續(xù)實驗均在37 ℃恒溫下進行。首先,采用1 μmol/L 腎上腺素和30 μmol/L 乙酰膽堿(acetylcholine,Ach)處理進行功能檢測,選取收縮率[(血管起始直徑-收縮后直徑)/血管起始直徑]>30%及舒張率[(舒張后血管直徑-收縮后直徑)/(血管起始直徑-收縮后直徑)]>90%的動脈用于后續(xù)實驗。主要實驗步驟如下:⑴用含SERCA抑制劑Thapsigargin(1 μmol/L)且無Ca2+的MOPS 預處理血管5 min;⑵采用高鉀(125 mmol/L)+Ca2+(0.5 mmol/L)+Thapsigargin(1 μmol/L)的MOPS 溶液預收縮腸系膜上動脈5 min;⑶分別加入AMPK激活劑PT1 30 μmol/L 和DMSO(PT1 溶劑)處理血管60 min,比較激活與非激活AMPK 狀態(tài)下腸系膜上動脈擴張程度;⑷血管功能實驗后收集各組血管,快速液氮處理,-80 ℃保存,用于后續(xù)的分子實驗。
收集的標本在液氮下碾成粉末狀,1×SDS 液裂解蛋白,Brandford 法蛋白定量,用Western blot 法檢測GAPDH、磷酸化AMPK(p-AMPK)、磷酸化cofilin(p-cofilin)的表達。用免疫熒光Western blot法檢測β-actin、熱休克蛋白20(heat shock protein 20,HSP20)及磷酸化HSP20(p-HSP20)。實驗血管中G-actin 水平檢測:標本按照G-actin/F-actin In Vivo Assay 試劑盒的說明步驟進行處理(Cytoskeleton,Inc.,美國)[20]。
各種檢測蛋白表達量均為與內(nèi)參GAPDH 或β-actin 標準化值,采用SPSS 10.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析,所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(±s)表示,組間比較采用t檢驗,P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。
血管活性功能檢測顯示兩組血管活性功能無顯著差異:PT1 組與對照組對1 mmol 腎上腺素收縮率分別為(37.25±1.86)%、(36.83±2.12)%,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖1A)。PT1 組與對照組對30 μmol/L Ach 舒張率分別為(98.92±1.68)%、(97.83±1.95)%,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖1B)。1 μmol/L Thapsigargin 無Ca2+的MOPS 預處理后PT1 組和對照組血管直徑分別為(261.4±12.4)μm 和(260.3±12.5)μm,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。預收縮5 min 后,PT1 組和對照組血管直徑分別為(134.5±6.3)μm、(135.3±7.7)μm,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。PT1 或DMSO 處理60 min 后,PT1 組血管明顯擴張至(196.6±11.5)μm,對照組血管直徑為(136.1±8.1)μm,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)(圖1C)。
與對照組比較,PT1 組血管組織中p-AMPK 水平明顯升高,而p-cofilin 水平明顯降低分別為對照組的(3.25±0.52)倍、(0.48 ±0.19)倍,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)(圖2);與對照組比較,PT1 組血管組織中G-actin 水平明顯升高,為對照組的(2.26±0.64)倍,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(圖3);與對照組比較,PT1 組血管組織中總HSP20(t-HSP20)水平無明顯變化,但p-HSP20 水平明顯升高,為對照組的(2.45±0.52)倍,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)(圖4)。
小動脈在機體血壓穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)組織血供中發(fā)揮重要作用[16]。前期通過體外完整小動脈(小鼠腸系膜上動脈)研究證實AMPK 可以通過非血管內(nèi)皮細胞依賴的兩種不同通路調(diào)節(jié)VSMC 胞漿游離Ca2+濃度從而調(diào)節(jié)VSMC/血管的舒縮[18]、也可以通過增加cofilin 活性降低細胞骨架F-actin 穩(wěn)態(tài)而擴張血管[10]。本研究進一步揭示AMPK 是通過HSP20 活化cofilin,從而發(fā)揮其促進F-actin 去聚化功能,降低細胞骨架穩(wěn)態(tài),降低VSMC 對Ca2+敏感性,從而導致血管擴張。
通過各種條件刺激VSMC,使膜電位改變[21],其胞漿游離Ca2+濃度升高,Ca2+與肌鈣蛋白結合,從而激活收縮單位:肌動蛋白(主要為F-actin)、肌球蛋白沿F-actin 長軸滑行,從而導致肌細胞收縮[22-23]。當胞漿游離Ca2+濃度維持不變,如本研究采用高滲鉀溶液誘導細胞膜電位改變,VSMC 收縮能力的強弱主要由F-actin 穩(wěn)態(tài)決定。血管功能實驗發(fā)現(xiàn),當激活AMPK 時,血管獲得緩慢擴張,說明VSMC 收縮能力降低,即細胞骨架穩(wěn)態(tài)發(fā)生改變,主要表現(xiàn)為F-actin 去聚化加強。此也間接表明促進F-actin 去聚化相關因子活性提高。
越來越多的證據(jù)[24-25]表明細胞骨架穩(wěn)態(tài)在調(diào)節(jié)肌細胞舒縮中發(fā)揮重要作用。細胞骨架主要由actin 構成,其為微絲的結構蛋白,它是真核細胞中表達最豐富的蛋白質(zhì),以兩種形式存在,即單體(G-actin)和多聚體(F-actin)[25-26]。細胞骨架穩(wěn)態(tài)主要為F-actin 的穩(wěn)態(tài),肌細胞收縮的重要環(huán)節(jié)為磷酸化的肌球蛋白輕鏈與F-actin 發(fā)生橋接反應,從而使肌細胞收縮[22]。F/G-actin 處于聚化和去聚化動態(tài)平衡,受到多種actin 結合蛋白和去聚化蛋白調(diào)節(jié),如cofilin、VASP、Arp2/3complex 及paxillin 等[25]。Miranda 等[27]在上皮細胞中證實AMPK可以通過Rho/ROK-cofilin 通路調(diào)控細胞骨架穩(wěn)態(tài)。近期在血小板的研究也發(fā)現(xiàn)AMPK 通過調(diào)節(jié)VASP及cofilin 磷酸化水平來調(diào)控細胞骨架的重組[28-29]。同時有研究[28]表明AMPK 調(diào)節(jié)actin 穩(wěn)態(tài)在細胞移行功能中發(fā)揮重要作用,發(fā)現(xiàn)AMPK 可以通過其新型靶點Pdlim5,抑制Arp2/3 信號途徑,從而降低G-actin 聚化抑制細胞移行。前期研究發(fā)現(xiàn)活化AMPK 能通過增加cofilin 的活性(即非磷酸化cofilin水平)從而擴張腸系膜上動脈[10]。本研究延續(xù)前期研究,進一步證實AMPK 活化血管中G-actin 含量顯著升高,而p-cofilin 活化水平顯著降低,說明活化AMPK 能增加F-actin 去聚,降低細胞骨架穩(wěn)態(tài),且此機理為cofilin 活性增強。
AMPK 為磷酸激酶,其降低cofilin 磷酸化水平依賴于間接途徑。前期研究發(fā)現(xiàn)在小鼠腸系膜上動脈中主要依賴14-3-3 蛋白來實現(xiàn)[10]。此外有研究[30-32]發(fā)現(xiàn)磷酸化轉導HSP20 可能通過與p-cofilin競爭結合14-3-3 蛋白發(fā)揮調(diào)節(jié)F-actin 穩(wěn)態(tài)的功能。本研究在延續(xù)前期實驗的基礎上,發(fā)現(xiàn)活化AMPK時,血管p-cofilin 水平降低的同時p-HSP20 水平相應升高。增加的p-HSP20 將與p-cofilin 競爭14-3-3蛋白結合位點,從而使p-cofilin 游離、易于被去磷酸化,增加其活性?;罨痗ofilin 促進F-actin 去聚化,降低細胞骨架穩(wěn)態(tài)性,從而誘導血管擴張。
總之,在小鼠小動脈中,HSP20 參與協(xié)助AMPK 活化cofilin,主要為活化AMPK 可以增加p-HSP20 水平,競爭結合p-cofilin 位點,使其去磷酸化,增加cofilin 活性,從而降低細胞骨架actin 穩(wěn)態(tài),調(diào)節(jié)血管舒縮。
利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。