王會周 陳志東 石禮盛 黃淑敏

( 1. 深圳市寶安區(qū)羅田林場, 廣東 深圳 518100; 2. 福建農林大學 林學院, 福建 福州 350002 )

濕地松Pinus elliottii生長性狀優(yōu)良，基于脂材兩用的開發(fā)應用價值，目前已成為我國南方主要造林樹種[1]。速生、高抗、優(yōu)質多功能目標林木育種是實現林業(yè)可持續(xù)經營的根本與保障。然而當前濕地松速生高抗種子園產量較低，育種周期又長，遠遠不能滿足當前種苗良種化大規(guī)模發(fā)展的需要[2]。因此，生產上建立一種高效的繁殖濕地松優(yōu)良種質的技術體系尤為迫切。

無性繁殖是能保持親體優(yōu)良性狀的一種繁殖技術[3]。扦插作為無性繁殖技術中最簡單易行的一種手段，被廣泛應用于林業(yè)科研和生產。以往研究發(fā)現，濕地松扦插具有明顯的生理年齡效應，母株年齡為1～3 年時，扦插生根可達90%以上，而母株年齡為6 年時，扦插生根率不足30%[2]。季孔庶等[4]也發(fā)現，4 年生以上馬尾松Pinus massoniana母株插穗生根能力顯著下降。楊峰等[5]認為，年齡效應是進行松樹嫁接、扦插、組織培養(yǎng)等無性繁殖時的共同難題，不定根誘導是組培、扦插無性育苗中的關鍵技術環(huán)節(jié)，年齡效應直接影響不定根發(fā)生。為加快濕地松優(yōu)良種質材料的推廣應用，進一步提升濕地松無性育苗中的生根穩(wěn)定性極為重要。激素在植物不定根形成中起到至關重要的作用[6-7]。因此，本試驗以4 年生濕地松母株上所采穗條為試驗材料，通過扦插育苗的方法，分析不定根誘導過程中插穗根莖解剖構造與內源激素水平變化，以期揭示內源激素對濕地松生根的影響，為濕地松生根能力優(yōu)化與提升提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以優(yōu)良的濕地松種子培育實生苗為采穗母株，通過截頂促萌修剪方式進行母株管護，采集4 年生母株在當年3 月份生產的5～8 cm 長、生長健壯、未木質化穗條為試驗材料，通過扦插方式開展不定根誘導試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 不定根誘導 采用容器扦插育苗的方法，以黃泥為育苗基質，參照前人最優(yōu)[8]的濕地松扦插育苗生根處理方式（扦插成活率97.5%），以1 000 mg/L IAA 浸泡插穗基部5 min 后插入經高錳酸鉀消毒的黃泥杯（Ф=4 cm，高=7 cm）。不定根誘導試驗在控制環(huán)境條件的光照培養(yǎng)箱中進行，溫度25±1℃，光照強度2 000 lx，每日光照16 h，相對濕度85%。試驗重復5 次，每重復60 株。

1.2.2 不定根解剖構造觀察 顯微鏡觀測：在扦插生根處理中每隔5 天取出穗條，經流水沖洗干凈后，切下約5～8 mm 長度大小的根莖基部，轉入FAA 固定液進行，依次用30%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、100% 酒精系列脫水，然后進行透蠟和包埋。最后用轉動切片機切片，進行番紅固綠對染后用阿拉伯中性樹膠封片，觀察不定根發(fā)生并顯微拍照。重復3 次取樣進行觀察拍照。

油鏡觀測：為進一步清晰觀測濕地松生根過程中根莖細胞變化，參考吳均章和韓素芬方法[9]，利用油鏡進行顯微觀測。取樣時間與方法同上，然后將根莖樣品轉入FAA 液固定，再依次用50%、70%、80%、95%、100%酒精脫水。脫水后將根莖置入Technovit7100 活化液中滲透，然后采用電鏡超薄切片用的定向包埋板, 于40 ℃溫箱中使之快速固化，最后用旋轉切片機切片，利用Gimsa 染色后在1%偏重亞硫酸鈉溶液中漂洗，將切片自然晾干后放入二甲苯透明，中性樹膠封藏。重復3 次取樣在油鏡下進行觀察拍照。

1.2.3 內源激素水平測定 根據生根解剖構造顯微觀察結果，于生根誘導處理第0（初期，R0）、20（根原基形成期，R20）、45 天（不定根形成期，R45）取樣測定內源激素水平的變化。使用儀器：美國安捷倫公司生產的Agilent 1290 液相色譜儀、Agilent 6460C 三重四極桿質譜儀和配電噴霧離子源，測定內源激素包括吲哚乙酸（IAA）、赤霉素（GAs）、脫落酸（ABA）和玉米素核苷（ZR），激素標準品為Sigma 公司生產，色譜純級。色譜條件和質譜條件參照王榮[10]的方法，取不同生根時間處理R0、R20、R45 插穗基部1 cm 長的根莖為測試樣品，各重約2 g，于液氮中研磨成粉末，分離上清液，過聚乙烯聚吡咯烷酮PVPP 柱和二乙基氨基乙基交聯葡聚糖凝膠（DEAESephadex A-25）柱凈化，過0. 22 μm 濾膜后檢測。重復3次取樣進行測定。

1.2.4 外源生長調節(jié)劑促根處理 根據解剖構造與內源激素水平分析結果，生根處理20 天后，采用4 個不同濃度多效唑（PBZ）水溶液噴施插穗針葉。其中，以0 mg/L PBZ（純水）為對照，設置25、50、100 mg/L 3 個PBZ 處理。噴施插穗針葉時，每株噴施5 mL，每隔10 天噴施一次，連續(xù)噴施3 次。于生根處理45 天，取出插穗觀察濕地松生根能力變化。統(tǒng)計不同PBZ 處理插穗生根率和長度≥5 mm 的不定根數目。其中，生根率（%）=（生根苗株數÷扦插穗條總數）×100，根條數=生根穗條不定根數目總和÷生根苗株數。每處理5 重復，每重復扦插60 株。生根培養(yǎng)溫度、光照、濕度條件同1.2.1。

1.3 數據處理

利用單因素方差分析（one-way ANOVA，α=0. 05）對不同PBZ 處理間的均值進行差異顯著性分析。數據采用SPSS 19.0 統(tǒng)計分析軟件進行方差分析及Duncan’s 多重比較（α=0.05）。

2 結果與分析

2.1 不定根發(fā)生過程分析

以濕地松4 年生母株上扦插穗條為初始材料（圖1A）進行不定根誘導，通過每隔5 天取樣動態(tài)觀察發(fā)現，濕地松生根處理20 天時，莖切口愈合（圖1B），45 天時形成不定根（圖1C）。同時，生根處理45 天后觀察到大量莖基部愈傷化程度嚴重的無根苗（圖1D）。通過顯微結構觀測證明，濕地松無潛伏根原基（圖1E），生根處理20天，在維管形成層誘導產生根原始體細胞（圖1F，黃色箭頭所示），在生根處理45 天時發(fā)育形成不定根（圖1G）。而生根處理45 天的無根苗中也發(fā)現了根原始體細胞團（黃色箭頭所示），但其周圍薄壁細胞中出現大量染色為紅色的栓化或脂質化物質（圖1H）。為進一步確證根莖細胞發(fā)育過程，在高倍高清油鏡顯微觀測下，根原始體細胞（紅色箭頭所示的具有增大細胞核的細胞）在生根處理20 天產生（圖1J），而生根處理45 天在有根與無根苗中均誘導出了根原始體，但在無根苗的根莖細胞中發(fā)現大量脂性物質（綠色箭頭所示，圖1K～1L）。上述結果表明，扦插生根處理20 和45天，可分別作為濕地松扦插苗根原基發(fā)生與不定根形成兩個關鍵時期。同時，根莖細胞中代謝物質積累與濕地松不定根發(fā)育和形成密切相關。

2.2 內源激素水平變化

內源激素與不定根形成及植物代謝物質積累緊密關聯。根據生長素（IAA）、細胞分裂素（ZR）、脫落酸（ABA）、赤霉素（GAs）四大類內源性激素在濕地松不定根形成中檢測結果發(fā)現，IAA、ABA、GAs 水平隨生根過程不同而變化，而ZR 水平變化不大。其中，IAA 先下降后上升、GAs 與之相反呈先上升后下降趨勢，ABA 則隨生根時間延長而增加。說明，IAA、ABA、GAs 顯著影響著濕地松不定根產生。根據生根處理45 天有根與無根苗中內源性激素水平的差異分析結果來看，IAA、ABA、ZR 無顯著差異，而無根苗中GAs 水平顯著高于有根苗。這暗示了，高濃度的內源GAs 與濕地松不定根形成困難密切相關。

2.3 PBZ 促根性分析

圖2 濕地松不定根生根過程中內源激素水平變化Fig.2 Endogenous hormone levels during adventitious rooting in Pinus elliottii

從有根與無根中內源性激素水平的分析來看，GAs 顯著影響濕地松不定根的形成。以GAs 生物合成抑制劑多效唑（PBZ）為促根劑在扦插20 天后噴施插穗針葉，分析PBZ 對濕地松不定根發(fā)育的促進性。由圖3 可知，相較未施用PBZ 對照處理（0 mg/L PBZ），施用50 mg/L PBZ 能明顯改善插穗生根率與根系質量，生根率和根系條數分別增加了63.0%和90.6%，但過高濃度PBZ（100 mg/L）較對照降低了20.5%和62.5%。說明，PBZ 能提升濕地松插穗生根能力，具有較強的促根性，但其使用濃度應控制在一個適度范圍。

圖3 PBZ 對濕地松不定根發(fā)育的促根性Fig.3 Promotive effects of PBZ on adventitious root development in Pinus elliottii

3 結論與討論

生根解剖構造觀察結果證明，濕地松無潛伏根原基，不定根通過由誘導根原始體發(fā)育形成。無潛伏根原基是植物生根困難的關鍵原因[11]。研究發(fā)現，植物不定根大多源于維管形成層[12-13]，在維管形成層中可直接誘導產生不定根原始體[14-16]。從植物細胞功能來看，維管形成層細胞分裂分化能力強，易被誘導、分化[17]。從本試驗研究結果來看，濕地松不定根誘導處理20 天，在維管形成層誘導產生了具有明顯增大細胞核的不定根原始體。之后，在生根處理45 天時隨著不定根原基細胞進一步分裂分化而發(fā)育成為不定根。與馬尾松P. massoniana、核桃Juglans regia、毛白楊Populus tomentosa等難生根木本植物相比，濕地松不定根發(fā)生部位相似[12-13,18]。在濕地松有根與無根苗中，均發(fā)現了大量誘導產生的根原基細胞團，但無根苗皮層及韌皮薄壁細胞中積累了大量脂性物質，從而可能形成了一種機械性障礙，阻礙了根原基細胞團進一步發(fā)育成為不定根。這說明，今后濕地松不定根再生要從不定根發(fā)生（根原基誘導）與形成（根原基發(fā)育）兩個階段進行考慮，尤其后者將直接影響著根系再生效果。

從本試驗濕地松插穗生根過程中IAA、ABA、ZR 和GAs 4 種內源激素水平的變化來看，IAA、ABA 和GAs 與濕地松不定根誘導密切相關，其中GAs 影響根原基發(fā)育。作為植物生長發(fā)育的重要調節(jié)因子，激素在不定根誘導中起到關鍵性作用[6-7]。通過分析IAA、ABA 和GAs 水平在濕地松不同生根時期的變化，能較好地反映內源激素在濕地松不定根再生中的作用。對IAA 而言，先下降后上升變化模式說明低水平IAA 利于根原基誘導，而高水平IAA 能促進不定根發(fā)育與形成；ABA 直線上升趨勢說明高水平的ABA 利于濕地松不定根的再生；GAs 先上升后下降，說明GAs 在濕地松不定根再生中早期能促進不定根原基產生，但后期不利于不定根形成，在濕地松生根中存在雙重作用，而生根處理45 天無根苗中高水平的GAs 也揭示了GAs 對濕地松不定根發(fā)育的潛在抑制性。為觀察GAs 在濕地松不定根發(fā)育中的作用，本試驗采用一種被廣泛使用的GAs 生物合成抑制劑多效唑（PBZ）[19-20]作為促根劑，在誘導出根原基后通過噴施針葉促根發(fā)育。根據試驗結果，在50 mg/L PBZ 作用下濕地松4 年生母株插穗生根率和根條數均顯著增加，說明GAs 在濕地松不定根發(fā)育中具有抑制性，外源性PBZ 能提升濕地松生根能力。

綜上所述，建議濕地松不定根誘導可采用兩步法，早期（扦插0～20 天）生根培養(yǎng)中可使用由生長素、赤霉素和脫落酸組成的一種復合型外源生長調節(jié)劑，后期（扦插21～45 天）培養(yǎng)中則使用多效唑。根據以往文獻報道，松樹生根能力有著顯著的遺傳基礎與生理年齡效應[4-5,21]，因此添加的生長調節(jié)劑濃度應根據材料來源（種源、家系、無性系）與材料類型（幼齡、成熟齡）進行相應調整。