胡 珊 黃 皓 陳杰連 梁衛(wèi)驅(qū)連輝明 侯 晨 羅華建 謝佩吾

(1.東莞市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究中心,廣東 東莞 523086；2. 廣東省林業(yè)科學(xué)研究院 / 廣東省森林培育與保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州 510520)

樟樹Cinnamomum camphora，又名香樟、烏樟、樟木、芳樟等，為樟科樟屬常綠闊葉喬木，原產(chǎn)于我國東南以及西南各地，廣西、廣東、江西、福建、臺灣、湖南、湖北、四川、云南等地均有分布[1]。樟樹皮、根、莖、葉均可提取精油，該精油具有抑菌、止痛、抗癌、抗氧化等作用，是香料香精、醫(yī)藥衛(wèi)生等行業(yè)的重要原料[2-5]。

樟樹精油的提取方法有水蒸氣蒸餾法、有機(jī)溶劑提取法、超臨界二氧化碳萃取法、超聲波輔助提取法、同時(shí)蒸餾萃取法、微波輔助水蒸餾法等[6]。但亞臨界萃取樟樹精油的研究甚少。周海旭等[7-8]研究表明以丁烷為溶劑，提取溫度為65 ℃、解析溫度45 ℃、提取時(shí)間40 min 為樟樹精油亞臨界萃取的最優(yōu)工藝條件，得率為3.54%，該精油對大腸桿菌Escherichia coli、金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus、綠膿桿菌Pseudomonas aeruginosa、枯草桿菌Bacillus subtilis均有不同程度的抑制作用。

溶劑種類是影響提取效果的重要因素。根據(jù)相似相溶原理，溶劑種類會影響提取物中化學(xué)成分的組成，進(jìn)而影響其應(yīng)用效果。因此，通過比較不同提取溶劑所得提取物化學(xué)成分和應(yīng)用效果，能夠篩選出合適的提取溶劑種類[9]。目前，不同溶劑亞臨界萃取樟樹葉精油未有研究。本研究選取丙烷、四氟乙烷、正丁烷、正丁烷與乙醇混合溶劑亞臨界萃取樟樹葉，分析4 種溶劑亞臨界提取樟樹葉精油的化學(xué)成分；選取常見的植物病原真菌水稻紋枯病原菌Rhizoctonia solani、辣椒疫霉病原菌Phytophthora capsici和植物病原細(xì)菌青枯菌Ralstonia salanacearum、胡蘿卜軟腐果膠桿菌Pectobacterium carotovorum作為供試菌，研究4 種不同樟樹葉精油對植物病原菌的抑制作用，為樟樹葉的深加工技術(shù)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

新鮮樟樹葉由廣東華清園生物科技有限公司提供。培養(yǎng)基包括營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（北京陸橋技術(shù)股份有限公司）；馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；CPG 培養(yǎng)基：水解酪蛋白1 g，蛋白胨10 g，葡萄糖5 g，瓊脂20 g，加水配制1 L 培養(yǎng)基。供試植物病原菌包括真菌病原菌：水稻紋枯病原菌、辣椒疫霉病原菌，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理系提供；細(xì)菌病原菌：青枯菌、胡蘿卜軟腐果膠桿菌，購買于商城北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司。試驗(yàn)試劑包括丙烷（河南亞臨界萃取技術(shù)研究院有限公司），四氟乙烷（霍尼韋爾，廣州中冷貿(mào)易有限公司），正丁烷（河南亞臨界萃取技術(shù)研究院有限公司），無水乙醇（西隴科學(xué)股份有限公司）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)備

CBE-20 L 型亞臨界萃取儀、CBEW-10 L 亞臨界乙醇萃取儀、CBEW-5 L 亞臨界水萃取儀（均由河南亞臨界萃取技術(shù)研究院有限公司制造）；電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；YXQ-LS-75G 立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；ZHWY-211B 恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）；SWCJ-1F 潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；LRH-250 生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；LAD-050FCI 空氣能熱泵烘干系統(tǒng)（廣東瑞星新能源科技有限公司）；WN-200+水冷全能粉碎機(jī)（廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司）等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程 新鮮樟樹葉→烘干→粉碎→稱重→濾袋盛裝后置于萃取罐→亞臨界流體萃取→溶劑分離回收→制得萃取物（計(jì)算得率）→抑菌作用測定。

1.3.2 不同溶劑亞臨界萃取樟樹葉 采用丙烷、四氟乙烷、正丁烷、正丁烷、正丁烷與乙醇混合溶劑（正丁烷與乙醇的體積比為9 ∶1）4 種不同溶劑分別按表1 中的工藝條件亞臨界萃取樟樹葉，得到相應(yīng)的初提物。

表1 不同溶劑的亞臨界萃取工藝Table 1 Subcritical extraction process with different solvents

1.3.3 樟樹葉精油的純化 所得萃取物用20 倍體積的無水乙醇溶解，于-18 ℃下冷凍24 h，過濾，除去不溶的蠟質(zhì)、纖維等成分，濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)（40 ℃，0.01 MPa)，得樟樹葉精油。計(jì)算得率[10]。樟樹葉精油得率（%）=萃取得到的樟樹葉精油質(zhì)量/萃取的樟樹葉質(zhì)量×100。

1.3.4 樟樹葉精油成分GC-MS 分析[11]（1）色譜柱：SH-Rxi-5Sil MS 石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；（2）氣相條件（GC）：升溫程序：初始柱溫為 70 ℃，以 2 ℃/min 速度升溫至 160 ℃,保持2 min，再以 10 ℃/min 速度升溫至220 ℃保持5 min，全程共運(yùn)行 51 min。進(jìn)樣量 0.5 μL，采用分流的方式進(jìn)樣，進(jìn)樣口溫度230 ℃。載氣為氦氣，過柱載氣恒流速為1.19 mL/min。（3）質(zhì)譜條件（MS）：離子源溫度 200 ℃，接口溫度 250 ℃，掃描范圍（m/z）50～500。溶劑延遲3 min。（4）化合物鑒定：將總離子流圖中各峰經(jīng)質(zhì)譜掃描后得到質(zhì)譜圖，通過標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫進(jìn)行檢索分析鑒定，并采用峰面積歸一定量法計(jì)算各組分在揮發(fā)油中的相對百分含量。

1.3.5 樟樹葉精油抑菌作用 （1）樟樹葉精油配制：無菌條件下，將精油用少量二甲基亞砜（DMSO） 溶解配制成100 mg/mL 溶液。（2）真菌病原菌抑制試驗(yàn)：采用 PDA 平板對峙法[12]。用6 mm打孔器打取真菌菌餅移入到PDA 平板中央，在距菌餅約2 cm 處等距離呈等邊三角形的3 點(diǎn)打孔，每個(gè)孔內(nèi)加100 μL 樟樹葉精油溶液，每處理3 次重復(fù)，以不加精油的處理為空白對照。28 ℃培養(yǎng)至空白對照菌落長滿，測量各處理的菌落直徑，計(jì)算抑制率。抑制率（%）＝（空白對照菌落直徑－處理菌落直徑）/空白對照菌落直徑×100。（3）細(xì)菌病原菌抑制試驗(yàn)：濾紙片瓊脂擴(kuò)散法[13-14]。向滅菌好的培養(yǎng)皿中倒入約20 mL 的滅菌好的瓊脂培養(yǎng)基，待其凝固后，加入100 μL 的細(xì)菌菌液(濃度調(diào)整為108CFU /mL)，均勻涂布后于 30 ℃細(xì)菌培養(yǎng)箱中靜置 1 h。以平板中心點(diǎn)為中心，呈3 cm 等邊三角形狀放置直徑 6 mm 的滅菌圓形濾紙片，用移液槍吸取20 μL 樟樹葉精油彌散于濾紙上，每處理3 次重復(fù)，以不加精油的處理為空白對照。28 ℃恒溫條件下黑暗培養(yǎng)，24 h 后觀察精油對胡蘿卜軟腐果膠桿菌的抑菌效果，48 h 后觀察精油對青枯菌的抑菌效果，用十字交叉法測量抑菌圈直徑（d）。抑菌強(qiáng)度按以下標(biāo)準(zhǔn)判定：當(dāng)d＞1.5 cm 時(shí)，表示高度抑菌（S）；當(dāng)1.0 cm≤d≤1.5 cm 時(shí)，表示中度抑菌（I）；當(dāng)0 cm ≤d＜1.0 cm 時(shí)，表示低度抑菌（R）[15]。

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

采用SPSS17.0 及Microsoft Excel 2007 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，以最小顯著性差異法（LSD）多重比較檢驗(yàn)不同處理之間的差異顯著性(α ＝0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞臨界初提物的物理形態(tài)和精油得率

樟樹葉亞臨界初提物的物理形態(tài)及得率見表2。4 種亞臨界初提物狀態(tài)各不相同，有渾濁、沉淀和分層的現(xiàn)象，所得初提物均有濃郁的龍腦香味。正丁烷與乙醇混合溶劑提取物有明顯分層現(xiàn)象。采用正丁烷與乙醇混合溶劑萃取樟樹葉精油，乙醇在一定程度上增大了溶劑體系的極性，提取物中醇溶性成分較多，在初提物純化為精油的處理中損失較少，所以精油得率最高，為3.67%。

表2 樟樹葉4 種亞臨界初提物的性狀和精油得率Table 2 Properties of subcritical primary and essential oil yield extracts from camphor leaves

2.2 不同溶劑亞臨界萃取樟樹葉精油的化學(xué)成分分析結(jié)果

將樟樹葉精油經(jīng)GC-MS 檢測得到的總離子流圖進(jìn)行譜庫匹配和人工鑒定，使用峰面積歸一化法確定各化學(xué)成分的相對含量，分析結(jié)果見表3。在丙烷、四氟乙烷、正丁烷、正丁烷與乙醇混合溶劑提取的4 種樟樹葉精油中分別鑒定出29、33、34 和22 種化合物，相對總含量分別為94.91%、95.66%、94.87%、95.07%。4 種葉精油的化學(xué)組分均以醇類和烯烴類化合物為主，其中醇類有7～8種，相對含量在63.68%～83.14%之間；烯烴類有12～22 種，相對含量在9.77%～29.46%之間；除此以外，還檢測出酯類化合物1～2 種，以及酮類化合物1 種。

表3 4 種樟樹葉精油的GC/MS 分析結(jié)果Table 3 GC / MS analysis results of four essential oils from camphor leaves

類別Category序號Number保留時(shí)間/min Retention time化合物Compound相對含量/%Relative content丙烷Propane四氟乙烷Tetrafluoroethane正丁烷Butane正丁烷與乙醇混合溶劑Butane + ethanol 18 31.911 4(14),11-桉葉二烯Eudesma-4(14),11-diene - - - 0.8 19 31.476 大根香葉烯D Germacrene D 3.36 3.95 3.07 2.46 20 31.915 α-古蕓烯α-Gurjunene 8.4 8.73 7.74 -21 32.365 大根香葉烯B Germacrene B 2.58 2.8 2.41 1.74 22 33.016 α-布藜烯α-Bulnesene 0.35 0.40 - -23 33.827 δ-杜松烯δ-Cadinene 0.22 0.21 0.15 -24 36.031 α-愈創(chuàng)烯α-Guaiene 0.87 - 0.39 -25 36.032 γ-欖香烯γ-Elemene - 0.55 0.79 -26 37.383 氧化石竹烯Caryophyllene oxide - 0.34 0.28 -27 38.682 γ-芹子烯γ-Selinene 0.79 0.55 0.31 -醇類Alcohols 28 7.353 桉葉油醇Eucalyptol 1.33 1.56 1.18 1.16 29 8.745 松油醇Terpineol 0.16 0.2 0.15 0.12 30 9.929 芳樟醇Linalool - - - 0.1 31 13.417 龍腦Borneol 44.91 43.85 45.41 50.44 32 13.894 松油烯-4-醇4-Terpineol 0.28 0.37 0.27 0.27 33 14.648 α-松油醇α-Terpineol 0.83 - - -34 37.173 匙葉桉油烯醇Spathulenol - 0.66 0.63 -35 39.884 6-芹子烯-4-醇Selina-6-en-4-ol 16.6 14.57 15.26 0.86 36 45.136 喇叭醇Ledene alcohol 1.07 0.81 0.76 -37 50.447 葉綠醇Phytol - 0.56 4.60 29.45酯類Esters 38 3.02 2-辛基環(huán)丙烷十二酸甲酯Cyclopropanedodecanoic acid, 2-octyl-, methyl ester--0.02 -39 19.612 左旋乙酸冰片酯Bornyl acetate 2.02 2.33 0.81 2.05 Ketones 40 12.108 樟腦Camphor 0.85 1.1 0.81 0.74酮類

4 種樟樹葉精油共同鑒定出的化合物有18 種，其中10 種烯烴類（α-蒎烯、莰烯、β-蒎烯、β-月桂烯、D-檸檬烯、大根香葉烯B、大根香葉烯D、α-側(cè)柏烯、檜烯、β-水芹烯）、1 種芳香烴類（β-傘花烴）、5 種醇類（桉葉油醇、松油醇、龍腦、松油烯-4-醇、6-芹子烯-4 醇）、1 種酯類（左旋乙酸冰片酯）和 1 種酮類（樟腦）。龍腦是4 種樟樹葉精油的主要化學(xué)成分，相對含量在43.85%～50.44%之間，以正丁烷與乙醇混合溶劑提取的葉精油中龍腦的相對含量最高。

4 種樟樹葉精油中除龍腦外，其他的一些化學(xué)成分也是醫(yī)藥、化工等行業(yè)重要的工業(yè)原料。不同溶劑提取物中非龍腦的化學(xué)成分含量在49.56%～56.15%之間，其中相對含量超過 1% 的化學(xué)成分有7 種：α-蒎烯、D-檸檬烯、大根香葉烯B、大根香葉烯D、桉葉油醇、6-芹子烯-4-醇、左旋乙酸冰片酯，結(jié)果如圖1 所示。

圖1 4 種樟樹葉精油中相對含量超過1%的非龍腦化學(xué)成分Fig. 1 Chemical constituents other than borneol in the four essential oils from camphor leaves with a relative content of more than 1%

2.3 不同溶劑亞臨界萃取樟樹葉精油的抑菌作用

4 種樟樹葉精油對真菌病原菌和細(xì)菌病原菌的抑制作用如表4、表5 和圖2 所示，對真菌類病原菌水稻紋枯病菌的抑制率在66.07%～88.65%之間，辣椒疫霉病菌的抑制率在41.01%～64.94%之間；對細(xì)菌類病原菌青枯病菌的抑菌圈直徑在1.23±0.12～2.72±0.10 cm 之間，除正丁烷提取的樟樹葉精油對該菌表現(xiàn)中度抑菌，其余3 種精油均表現(xiàn)高度抑菌；胡蘿卜軟腐果膠桿菌的抑菌圈直徑在1.01±0.12～2.33±0.12 cm 之間，四氟乙烷、正丁烷與乙醇混合溶劑2 種溶劑提取的樟樹葉精油對該菌高度抑菌，其余2 種精油表現(xiàn)為中度抑菌。4 種樟樹葉精油對兩類病原菌的抑菌作用之間存在顯著差異，其中，以四氟乙烷為溶劑亞臨界提取的樟樹葉精油的抑菌效果最優(yōu)，對兩類病原菌均表現(xiàn)良好的抑菌作用，對真菌類病原菌水稻紋枯病菌和辣椒疫霉病菌的抑制率分別為88.65%、64.94%；對細(xì)菌類病原菌青枯病菌和胡蘿卜軟腐果膠桿菌的抑菌圈直徑分別為2.72±0.10 cm、2.33±0.12 cm。

表4 4 種樟樹葉精油對真菌病原菌的抑制作用Table 4 Antibacterial effect of four essential oils from camphor leaves on fungal pathogens

表5 4 種樟樹葉精油對細(xì)菌病原菌的抑制作用Table 5 Antibacterial effect of four essential oils from camphor leaves on bacterial pathogens

圖2 四氟乙烷亞臨界萃取樟樹葉精油的抑菌效果Fig. 2The antibacterial effect of essential oil from camphor leaves extracted with tetrafluoroethane

3 結(jié)論與討論

本研究以樟樹葉為原料，采用丙烷、四氟乙烷、正丁烷、正丁烷與乙醇混合溶劑4 種不同溶劑分別進(jìn)行亞臨界萃取得4 種樟樹葉精油。利用GC/MS 法分析4 種樟樹葉精油，共鑒定出40 種化合物，成分組成以醇類、烯烴類兩大類化合物為主，其中醇類有7～8 種，相對含量在63.68%～83.14%之間；烯烴類有12～22 種，相對含量在9.77%～29.46%之間。正丁烷與乙醇混合后，烯烴類物質(zhì)種類和相對含量明顯減少，醇類物質(zhì)的相對含量明顯增加，葉綠醇、龍腦相對含量增加最為明顯。添加極性強(qiáng)的乙醇作混合夾帶劑，在一定程度上增大溶劑體系的極性，提取物中醇溶性成分較多，這與王甜等[16]利用正丁烷＋乙醇 （夾帶劑）亞臨界萃取滁菊精油的研究結(jié)果一致。研究中以正丁烷為溶劑亞臨界萃取樟樹葉精油的化學(xué)成分與周海旭等[8]利用正丁烷亞臨界萃取的樟樹葉精油的化學(xué)成分有差異性，這可能與樟樹葉種類和種植區(qū)域不同有關(guān)。文獻(xiàn)中樟樹葉采集自湖南省長沙市，主要化學(xué)成分為桉油精（24.74%），研究中樟樹葉采集自廣東省平遠(yuǎn)縣，主要化學(xué)成分龍腦（45.41%）。4 種樟樹葉精油主要化學(xué)成分均為龍腦，相對含量在43.85%～50.44%之間，以正丁烷與乙醇混合溶劑提取的精油中龍腦相對含量最高。

4 種樟樹葉精油對真菌病原菌和細(xì)菌病原菌均有不同程度的抑制作用。這與丁雄等[17]研究龍腦樟鮮葉揮發(fā)油對細(xì)菌、酵母菌和霉菌均有一定的抑菌作用的結(jié)果一致。其中四氟乙烷萃取的樟樹葉精油抑菌效果最優(yōu)，對兩類病原菌均表現(xiàn)良好的抑菌作用。本研究首次以丙烷、四氟乙烷、正丁烷與乙醇混合溶劑亞臨界萃取樟樹葉，并研究4種樟樹葉精油對植物病原菌的抑制作用，為樟樹葉的深加工提供新技術(shù)，同時(shí)也為樟樹葉精油在各領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用提供參考依據(jù)。