熊火梅，羅菲，徐秋琴(九江市疾病預(yù)防控制中心微生物檢驗(yàn)科，江西九江 333000)

豬鏈球菌(Streptococcussuis,S.suis)可引起人感染豬鏈球菌病，是一種重要的人畜共患病病原菌，該病嚴(yán)重威脅人畜公共衛(wèi)生安全。根據(jù)豬鏈球菌莢膜多糖抗原可分為35個(gè)血清型，其中豬鏈球菌血清2型是引起人感染的主要血清型，可引起人腦膜炎、敗血病、心內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)炎和其他嚴(yán)重并發(fā)癥[1]。江西省于2006年報(bào)道1例人感染2型豬鏈菌病，于2014報(bào)道1例人感染1型豬鏈球菌病[2]，但均未見毒力和分子分型報(bào)道。本研究旨在對(duì)九江市發(fā)現(xiàn)的首例人感染豬鏈球菌進(jìn)行病原學(xué)鑒定、毒力基因、藥物敏感性分析和分子分型，為病原學(xué)診斷及疫情防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象 患者男，64歲，于2021年7月12日開始出現(xiàn)寒戰(zhàn)、高熱等癥狀，未就診。后因病情加重于7月14日到九江市中醫(yī)院就診，入院時(shí)高熱、意識(shí)障礙，腦膜刺激征陽性，采集腦脊液接種血瓊脂平板置37 ℃、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)15 h后，觀察菌落特征，挑取單個(gè)可疑菌落革蘭染色后鏡檢，BRUKER microflex質(zhì)譜鑒定為豬鏈球菌。流行病學(xué)調(diào)查顯示患者發(fā)病前買過3次豬肉，并洗過、切過豬肉，臨床診斷為人感染豬鏈球菌病。經(jīng)治療于7月22日轉(zhuǎn)出重癥監(jiān)護(hù)病房進(jìn)入普通病房治療，意識(shí)恢復(fù)后有聽力受損。

1.2主要儀器與試劑 GEL Doc2000凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)，PCR儀(德國Senso公司)，引物由上海生工生物公司合成，10×PCR buffer、dNTPs及DL2000 DNA marker(大連TaKaRa公司)，2×Taq MasterMix及細(xì)菌DNA提取試劑盒(Bacteria Gene DNA Kit)(康為世紀(jì)公司)，E-test測(cè)試條(意大利Liofilchem公司)。

1.3DNA提取 挑取適量菌苔按Bacteria Gene DNA Kit試劑盒說明書提取DNA。

1.416S rRNA、血清型別及毒力基因鑒定 按照中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所提供的引物，用PCR法檢測(cè)豬鏈球菌16S rRNA、血清2型豬鏈球菌特異性莢膜多糖編碼基因片段cps2J、溶菌酶釋放相關(guān)蛋白基因(muramidase-released protein,mrp)、溶血素基因(suilysin,sly)、豬鏈球菌的細(xì)胞外因子基因(extracellular factor,ef)。反應(yīng)體系共20 μL，包括10 μmol/L上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL、2×Taq Master Mix 10 μL，ddH2O 7 μL。擴(kuò)增參數(shù)：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，51～60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。退火溫度及時(shí)間、引物及擴(kuò)增片段大小見表1。擴(kuò)增產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析。所有陽性對(duì)照均由中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所提供。

表1 16S rRNA種、cps2J型及3種毒力基因引物序列、退火溫度及目的片段

1.5藥物敏感試驗(yàn) 對(duì)分離的菌株采用E-test條測(cè)試鏈霉素、壯觀霉素、頭孢克肟、慶大霉素、青霉素、利福平、萬古霉素、復(fù)方磺胺甲噁唑、克林霉素、紅霉素、四環(huán)素和阿奇霉素敏感性。藥敏結(jié)果參考美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)肺炎鏈球菌的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀，質(zhì)控菌株為肺炎鏈球菌ATCC49619。

1.6多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing，MLST) 按照中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所提供的引物，對(duì)豬鏈球菌7個(gè)管家基因aroA、cpn、dpr、gki、recA、mutS、thrA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系共20 μL，包括10 μmol/L上、下游引物各1 μL，模板1 μL、2×Taq Master Mix 10 μL，ddH2O 7 μL。dpr、mutS、recA擴(kuò)增參數(shù)：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。aroA、gki擴(kuò)增參數(shù)：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。cpn、thrA擴(kuò)增參數(shù)：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物送北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果導(dǎo)入數(shù)據(jù)庫https://pubmlst.org/ssuis/進(jìn)行比對(duì)，得到等位基因數(shù)值，查找對(duì)應(yīng)ST值。

2 結(jié)果

2.1PCR鑒定結(jié)果 16S rRNA、cps2J和mrp、sly、ef3種毒力基因均為陽性，見圖1、2。

注：M，DL2000 DNA marker；1，16S rRNA陽性對(duì)照；2，16S rRNA。

2.2MLST分型結(jié)果 7個(gè)管家基因電泳結(jié)果見圖3。測(cè)序結(jié)果與MLST數(shù)據(jù)庫等位基因信息比對(duì)，基因型為ST1型。

注：M，DL2000 DNA marker；1、3、5，分別為mrp、ef、sly陽性對(duì)照；2，mrp；4，ef；6，sly；7，血清1型；8，血清2型。

注：M，DL2000 DNA marker；1，aroA；2，cpn；3，dpr；4，gki；5，mutS；6，recA；7，thrA。

2.3藥敏試驗(yàn)結(jié)果 E-test試驗(yàn)結(jié)果顯示,對(duì)鏈霉素、壯觀霉素、頭孢克肟、慶大霉素、氯霉素、青霉素、利福平、萬古霉素、復(fù)方磺胺甲噁唑和克林霉素均敏感，紅霉素、四環(huán)素和阿奇霉素均耐藥。

3 討論

mrp、ef和sly是豬鏈球菌最常研究的經(jīng)典毒力基因，研究表明mrp+ef+sly+基因型是2型豬鏈球菌典型的強(qiáng)毒株。為進(jìn)一步了解九江市首例人感染豬鏈球菌的致病性，本研究分析得出mrp、ef、sly等毒力基因均為陽性，是2型豬鏈球菌強(qiáng)毒株型，與該病例入院時(shí)意識(shí)障礙、恢復(fù)意識(shí)后有聽力受損等嚴(yán)重癥狀相符，也與貴州省報(bào)道的人感染豬鏈球菌毒力基因型相同[3]。洪家兵等[4]從豬分離到的62株豬鏈球菌中發(fā)現(xiàn)，70%以上的毒株含mrp，50%以上的毒株含ef，20%以上的毒株含sly，也證明了江西省豬鏈球菌毒力基因型具有多樣性，提示本省mrp+/syl+/ef+毒株型從豬傳染人的可能性。

研究表明，豬鏈球菌具有復(fù)雜的遺傳多樣性，并非所有血清2 型都顯示相同的毒力水平，本研究MLST選擇7個(gè)管家基因擴(kuò)增，結(jié)果顯示此次人感染豬鏈球菌血清2型為ST1型菌株，與江蘇省報(bào)道的相同[5]，而國內(nèi)最常見人感染豬鏈菌為1998年江蘇省和2005年四川省爆發(fā)的ST7型[6]。ST1型與ST7型一樣容易引起侵襲性病癥，同屬ST1克隆群，兩者的差異僅在thrA基因上，ST1分離株被認(rèn)為是含有最強(qiáng)毒的毒力基因，常常引起人間感染，可引起腦膜炎、休克等。Zhu等[7]對(duì)180 株豬鏈球菌血清2型分離株研究結(jié)果顯示，ST1與ST7 為主的強(qiáng)毒群毒力基因型與本研究完全一致，為sly+epf+mrp+。

本研究采用E-test條測(cè)試對(duì)13種抗菌藥物敏感性分析，結(jié)果顯示該菌株對(duì)紅霉素、四環(huán)素和阿奇霉素耐藥，與四川省臨床分離的28株2型豬鏈球菌藥物敏感性檢測(cè)結(jié)果相似[8]。阿奇霉素和紅霉素均屬于大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物，有報(bào)道稱從豬分離到豬鏈球菌大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥率>70%，四環(huán)素類藥物耐藥>90%[9]。研究顯示，江西省豬鏈菌球菌耐藥性比較嚴(yán)重，主要以多重耐藥為主[4]。其中對(duì)紅霉素耐藥率在80%以上，對(duì)四環(huán)菌耐藥率在90%以上。從江西省豬分離到的豬鏈球菌和人感染豬鏈球菌耐藥性分析結(jié)果提示應(yīng)警惕人感染豬鏈球菌出現(xiàn)多重耐藥性，提示臨床治療中需嚴(yán)格按照藥物敏感分析結(jié)果科學(xué)用藥。

志謝：感謝中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所鄭潮主任、王建平老師、杜小莉老師給予的指導(dǎo)和幫助。