＊周亞坤

（北京市市政工程設(shè)計(jì)研究總院有限公司 北京 100082）

氮的高效穩(wěn)定去除仍是目前污水處理領(lǐng)域熱點(diǎn)問題之一[1-3]，大多數(shù)污水廠目前采用活性污泥法處理污水[4]，其反硝化處理能力雖基本滿足要求，但仍存在著較大的提升空間[5]，尤其在冬季低溫條件下污水廠的反硝化脫氮效果較差。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，通過有效反硝化細(xì)菌數(shù)量的增加來提高反硝化效率是有效的技術(shù)途徑[6-8]。因此快速馴化培養(yǎng)出高效反硝化脫氮菌群，并利用包埋固定化技術(shù)[9]將其制作成生物活性填料，投放到反硝化功能池中，可以有效提高反硝化菌群的數(shù)量及活性[10]，從而提高污水處理廠冬季低溫條件下的脫氮能力。

目前已有針對(duì)高效反硝化細(xì)菌馴化培養(yǎng)的研究，多為特定功能菌屬的純菌擴(kuò)增培養(yǎng)，菌種較為單一，抵抗外界環(huán)境條件的穩(wěn)定性不高。有研究通過序批式實(shí)驗(yàn)已馴化出反硝化速率為300mg·(L·h)-1的高效反硝化細(xì)菌[11]，但對(duì)于細(xì)菌的馴化機(jī)理及脫氮性能的進(jìn)一步提高仍需研究。有研究者系統(tǒng)地闡述了活性污泥的馴化機(jī)理[12-14]，但針對(duì)馴化成熟的高效菌應(yīng)用性能未作研究。對(duì)于包埋反硝化填料的研究，多局限于實(shí)驗(yàn)室配水條件下，應(yīng)用于實(shí)際污水的脫氮性能研究較少。有學(xué)者將反硝化填料應(yīng)用于二級(jí)出水脫氮的研究[15]，但其所用菌源未經(jīng)馴化培養(yǎng)，填料的脫氮性能較為低下。

本文實(shí)驗(yàn)以具有較高生物多樣性的活性污泥為菌源，以具有底物多樣性特點(diǎn)的乙酸鈉作為碳源，采用流加-間歇式培養(yǎng)方法（連續(xù)進(jìn)藥，間歇排水），梯度提高硝酸鹽負(fù)荷[16]，對(duì)反硝化細(xì)菌進(jìn)行馴化培養(yǎng)，得到了高效穩(wěn)定的廣譜性反硝化脫氮菌群[17]，通過細(xì)菌固定化技術(shù)制作成包埋反硝化填料[18]，在冬季低溫條件下對(duì)不同濃度的市政污水表現(xiàn)出了良好的脫氮性能。

1.材料與方法

(1)實(shí)驗(yàn)水質(zhì)及分析方法

以北京某污水處理廠二沉池回流污泥為菌源，實(shí)驗(yàn)用水為人工模擬硝酸鹽廢水，硝酸鉀提供氮源，乙酸鈉提供碳源，KH2PO4提供反硝化細(xì)菌所需要的磷，氮源和碳源的投加量隨反硝化速率的增加而提高，同時(shí)每升進(jìn)水中加1.25mL微量元素[19]，微量元素的組成如表1所示。

表1 微量元素組成表

依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)分析法[20]測定NO2--N、NO3--N、COD、污泥濃度（MLSS）、溫度（T）、pH，其中NO2--N、NO3--N分別采用N-（1-萘基）乙二胺光度法和紫外分光光度法（UV-1600PC，MAPADA），COD值采用連華科技快速測定法，MLSS采用濾紙烘干稱重法測定，溫度使用溫控器探頭測定，pH利用在線儀表監(jiān)測。

(2)流加-間歇式培養(yǎng)方法的建立

反應(yīng)器主體為304不銹鋼水箱，總體積為200L，配有一臺(tái)雙槳攪拌裝置（轉(zhuǎn)速范圍：0～250r/min可調(diào)），pH探頭連接自控裝置，通過控制蠕動(dòng)泵向反應(yīng)器內(nèi)投加稀硫酸（pH：3.5±0.5），調(diào)節(jié)反應(yīng)體系酸堿平衡，加熱環(huán)連接溫控裝置維持反應(yīng)器內(nèi)溫度恒定。

實(shí)驗(yàn)采用流加-間歇的運(yùn)行模式，即連續(xù)進(jìn)藥，周期結(jié)束后將上清液排出。每個(gè)運(yùn)行周期為10h，其中流加進(jìn)水周期為8h，靜置排出上清液時(shí)間為2h。以出水TN（NO3-和NO2-）濃度接近零為指示標(biāo)準(zhǔn)，逐步提高進(jìn)水的NO3--N濃度，從而刺激反硝化細(xì)菌的生長。流加-間歇的培養(yǎng)方式，可有效解決反硝化過程中因污泥上浮而引起的細(xì)菌流失問題，同時(shí)還可以控制反應(yīng)器內(nèi)的COD濃度，阻止其他異養(yǎng)菌搶奪反硝化所需碳源，并實(shí)現(xiàn)其他異養(yǎng)菌、硫酸鹽還原菌、水解酸化細(xì)菌等的大量生長，控制反應(yīng)器內(nèi)溫度在26±1℃，利用pH探頭連接自控裝置控制反應(yīng)器內(nèi)pH為7.4±1，連續(xù)運(yùn)行反應(yīng)器至單位質(zhì)量污泥的反硝化速率趨于動(dòng)態(tài)平衡，連續(xù)運(yùn)行34d。

(3)微生物菌群結(jié)構(gòu)分析

通過高通量測序手段對(duì)不同馴化階段的污泥樣品進(jìn)行菌群結(jié)構(gòu)檢測分析，實(shí)驗(yàn)共選取3個(gè)樣品，每個(gè)樣品的選取時(shí)間如表2所示。

表2 各樣品選取情況統(tǒng)計(jì)

利用OMEGA試劑盒E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit從樣本中提取DNA，針對(duì)細(xì)菌16SrRNA的V3-V4區(qū)基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增測序，引物設(shè)計(jì)為V3-V4通用引物：341F引物（CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG）和805R引物（GACTGGAGTTCCTTGGCAC CCGAGAATTCCA），共進(jìn)行兩輪擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，利用Qubit3.0 DNA檢測試劑盒對(duì)回收的DNA精確定量，然后通過Illumina Hiseq2500 PE250平臺(tái)進(jìn)行高通量測序，測序數(shù)據(jù)利用 MEGAN 軟件進(jìn)行環(huán)境微生物的16S分析，可分別得到每個(gè)樣本對(duì)應(yīng)的優(yōu)質(zhì)序列，根據(jù)序列之間的相似性，將各序列分成不同的聚類操作分類單元（OTUs），最后對(duì)OTUs結(jié)果進(jìn)行分析計(jì)算。

(4)包埋反硝化填料應(yīng)用性能研究

為有效提高冬季低溫條件下（9～11℃），污水廠反硝化過程的脫氮性能，利用細(xì)菌包埋技術(shù)，將馴化成熟的高效反硝化細(xì)菌制作成包埋填料，考察其在冬季低溫條件下對(duì)于市政污水中TN（NO3-和NO2-）的去除能力。實(shí)驗(yàn)以北方某污水處理廠二級(jí)出水為原水，其TN濃度約為25mg·L-1，通過連續(xù)流反應(yīng)裝置研究包埋反硝化填料在冬季低溫條件下的脫氮能力。

2.結(jié)果與討論

(1)廣譜性高效反硝化細(xì)菌的馴化培養(yǎng)

①反硝化速率與進(jìn)水NO3-濃度變化關(guān)系

從圖1可以看出隨著進(jìn)水NO3-濃度不斷增大，反硝化速率呈現(xiàn)不斷上升的趨勢。培養(yǎng)初期，由于污泥體系中異養(yǎng)菌較為豐富，與反硝化細(xì)菌存在碳源的競爭，故反硝化速率增長較為緩慢。從第8d開始反硝化速率增長速度明顯加快，呈現(xiàn)對(duì)數(shù)增長趨勢，這說明反硝化細(xì)菌的菌群優(yōu)勢逐步建立，經(jīng)過34d的培養(yǎng)，反硝化速率最終達(dá)到了546.34mg·(L·h)-1，并趨于穩(wěn)定，此時(shí)反應(yīng)體系中反硝化細(xì)菌的生長代謝形成動(dòng)態(tài)平衡，反硝化細(xì)菌菌群優(yōu)勢形成。流加-間歇式培養(yǎng)反硝化細(xì)菌，NO3-與COD同時(shí)加入反應(yīng)器，有效控制了反應(yīng)體系中的COD濃度，從而抑制了其他異樣菌的生殖，保證了污泥體系的穩(wěn)定。

圖1 反硝化速率與進(jìn)水NO3-負(fù)荷、出水TN之間的關(guān)系

②污泥濃度與比反硝化速率變化分析

從圖2可以看出前4d污泥濃度的增長較為緩慢，這是由于培養(yǎng)啟動(dòng)階段體系中的好氧型細(xì)菌消亡所致，從第5d開始MLSS增長率有了明顯提升，同時(shí)比反硝化速率（單位質(zhì)量污泥反硝化速率）也開始明顯提高，這表明反硝化細(xì)菌開始逐步適應(yīng)馴化條件，并在菌群結(jié)構(gòu)中逐漸占據(jù)一定優(yōu)勢，比反硝化速率最高可達(dá)到60.66mg·(g·h)-1，這表明馴化成熟的污泥體系不僅反硝化功能菌的數(shù)量得到了擴(kuò)增，單位質(zhì)量污泥的脫氮性能也得到了增強(qiáng)。

圖2 污泥濃度與比反硝化速率變化關(guān)系

③微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性變化分析

微生物結(jié)構(gòu)多樣性變化是活性污泥體系對(duì)馴化條件做出的進(jìn)一步調(diào)整，通過高通量測序可有效反應(yīng)不同培養(yǎng)階段微生物多樣性的變化。表3為樣品多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)表，本研究共選取了3個(gè)樣品，所有樣本的Coverage指數(shù)均在0.93以上，這表明測序比較全面的覆蓋了所有物種，保證了測序的有效性。

表3 不同階段微生物多樣性統(tǒng)計(jì)

如表3所示，通過測序從3個(gè)樣本中得到了61740、38239、71166條優(yōu)質(zhì)序列，分別被分為了6216、1496、4465個(gè)OTUs（操作分類單元）。Shannon指數(shù)可有效反應(yīng)樣本中微生物的多樣性，Shannon值越大，說明群落多樣性越高。Sample0到ZYK-4，樣本的Shannon指數(shù)從6.49降低到了2.61，這說明原始污泥具有較大的微生物菌群多樣性，隨著進(jìn)水負(fù)荷的不斷提高，污泥體系的多樣性呈現(xiàn)出遞減趨勢，這表明高硝酸鹽濃度的水質(zhì)條件對(duì)微生物菌屬進(jìn)行選擇，同時(shí)微生物菌群為適應(yīng)馴化條件而不斷做出適應(yīng)性調(diào)整。其中反硝化菌群能夠適應(yīng)并生存下來，不適應(yīng)的菌屬受到抑制或被淘汰出污泥體系。從微觀層面來看，高效反硝化細(xì)菌的馴化過程，即為馴化條件對(duì)污泥中微生物菌群進(jìn)行選擇的過程。

④微生物菌群結(jié)構(gòu)變化分析反硝化菌屬種類十分繁多，已有50多個(gè)屬和130多個(gè)種被報(bào)道[22-23]。反硝化功能菌群結(jié)構(gòu)變化是活性污泥馴化更高一級(jí)的適應(yīng)性調(diào)整，表4統(tǒng)計(jì)了各樣品中微生物在屬分類水平上的豐度變化情況，可以明顯看出在馴化條件的影響下，微生物菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的適應(yīng)性變化。

表4 不同培養(yǎng)階段微生物優(yōu)勢菌屬統(tǒng)計(jì)

其中豐度變化明顯的Thauera和Pseudomonas，兩者均為污水處理中較為常見的反硝化菌屬[24]，且在培養(yǎng)過程中豐度較高。Thauera是Betaproteobacteria綱下的一類具有反硝化能力的革蘭氏陰性細(xì)菌，且具有降解多種芳香族污染物能力，Paracoccus菌屬已被Baker S C正式描述為反硝化副球菌屬[25]，屬內(nèi)存在異養(yǎng)硝化型細(xì)菌分支，說明了污泥體系具備一定的氨氮去除能力。

如表4所示，原始污泥樣本中反硝化主要功能菌屬Thauera豐度僅為2.85%，經(jīng)過馴化培養(yǎng)，兩種反硝化功能菌屬Thauera和Pseudomonas分別達(dá)到了26.87%和42.99%，擴(kuò)大了近25倍，成為了污泥中的絕對(duì)優(yōu)勢菌群，同時(shí)具有反硝化功能的菌群多樣性得到了提升，如具有反硝化功能的Paracoccus（12.58%）較活性污泥也有了明顯提升。如圖3所示，反硝化同功菌群的結(jié)構(gòu)也在不斷的發(fā)生變化，隨著馴化濃度的提高，Thauera最終取代Pseudomonas成為菌群中的優(yōu)勢菌屬。由此可以看出通過馴化培養(yǎng)，污泥體系中具有反硝化功能的菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化，但反硝化功能菌群的豐富有了明顯的提升，這也是污泥反硝化性能保持高效且穩(wěn)定的原因。

圖3 不同培養(yǎng)階段微生物群落結(jié)構(gòu)變化（屬水平）分析

(2)低溫條件下包埋反硝化細(xì)菌填料應(yīng)用性能分析

冬季低溫條件下污水廠生物脫氮單元普遍存在細(xì)菌活性較差，脫氮性能不高等問題，為考察馴化成熟的反硝化細(xì)菌對(duì)低溫條件下市政污水的實(shí)際脫氮效果，將馴化后的污泥離心濃縮至含水率為85%，將其與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%的PVA凝膠混合成包埋液，將包埋液均勻涂裝在圓柱形條狀載體上，在過飽和的硼酸溶液中交聯(lián)，最后切成1cm長度的筒狀填料，分裝于懸浮填料球中。

①對(duì)低氮濃度市政污水的脫氮性能分析

由圖4可以看出，冬季低溫條件下污水廠二級(jí)出水中約含有25mg·L-1的TN，在運(yùn)行前初期包埋反硝化填料對(duì)TN的去除率增長較為緩慢，從第5d開始填料開始逐步適應(yīng)二級(jí)出水水質(zhì)，對(duì)TN的去除率表現(xiàn)出較快的增長，經(jīng)17d左右的運(yùn)行，出水TN可降至5mg·L-1以下。運(yùn)行過程中，填料對(duì)二級(jí)出水中COD的利用率最高可達(dá)67.51%，這有效降低了深度處理單元碳源的投加量。由此不難看出，對(duì)于低氮濃度的二級(jí)出水，包埋反硝化填料能夠保持良好的脫氮性能，這對(duì)于強(qiáng)化污水廠二級(jí)出水的脫氮效果具有重要意義。

圖4 包埋反硝化填料強(qiáng)化二級(jí)出水脫氮性能分析

3.結(jié)論

以污水廠回流污泥為菌源，通過流加-間歇的培養(yǎng)方式梯度提高硝酸鹽負(fù)荷，得到了去除速率為546.34mg·(L·h)-1的高效反硝化脫氮菌群。

高通量測序研究發(fā)現(xiàn)馴化條件使原始活性污泥多樣性顯著降低，但豐富了反硝化同功菌群結(jié)構(gòu)的多樣性，其中Thauera和Pseudomonas變化較為明顯，豐度由2.85%達(dá)到了69.86%，最終形成了同具反硝化功能但種類不盡相同的廣譜性反硝化菌群，與馴化條件形成了新的動(dòng)態(tài)平衡，這為細(xì)菌及填料高效穩(wěn)定的脫氮性能奠定了基礎(chǔ)。

冬季低溫條件下，包埋反硝化填料可使污水廠二級(jí)出水TN穩(wěn)定在5mg·L-1以下，這對(duì)提升污水廠冬季對(duì)于市政污水的脫氮能力具有重要的參考意義。