張得香 朱 超 周加義 王修啟

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣東省動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣州 510642)

酵母培養(yǎng)物(yeast culture，YC)是指在特定培養(yǎng)基上經(jīng)酵母菌厭氧充分發(fā)酵后所形成的一種微生態(tài)制劑，主要由酵母細(xì)胞代謝產(chǎn)物、發(fā)酵變異培養(yǎng)基和少量無(wú)活性酵母細(xì)胞組成，富含各種小肽、氨基酸、維生素和有機(jī)酸，被廣泛應(yīng)用于單胃動(dòng)物、反芻動(dòng)物和水產(chǎn)動(dòng)物生產(chǎn)中[1-4]。YC中各種功能性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不僅在穩(wěn)態(tài)條件下具有促進(jìn)腸黏膜發(fā)育的功能，而且在腸道損傷后，能刺激隱窩-絨毛軸再生，保護(hù)腸道完整性[5-7]。

腸黏膜上皮形態(tài)的發(fā)生由隱窩底部的干細(xì)胞驅(qū)動(dòng)，經(jīng)增殖、遷移和分化形成各種功能細(xì)胞單位，包括絨毛蛋白(Villin)標(biāo)記的腸吸收細(xì)胞、嗜鉻粒蛋白A(chromogranin A，CGA)標(biāo)記的腸內(nèi)分泌細(xì)胞、黏蛋白2(mucin 2，MUC2)標(biāo)記的杯狀細(xì)胞以及溶菌酶(lysozyme，LYZ)標(biāo)記的潘氏細(xì)胞[8]。這些功能細(xì)胞各司其職，共同維護(hù)腸道健康。雖然已有研究報(bào)道，YC可改善腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)[1,9-10]，然而其作用機(jī)制尚不清楚。因此，本研究以小鼠為載體，探究YC在調(diào)節(jié)干細(xì)胞增殖分化、改善腸道功能方面的作用，旨在為YC在養(yǎng)殖中的精準(zhǔn)供給和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

YC主要由酵母細(xì)胞代謝產(chǎn)物、經(jīng)過(guò)發(fā)酵后變異的培養(yǎng)基和少量已無(wú)活性的酵母細(xì)胞所構(gòu)成，由河南某生物技術(shù)有限公司提供；酵母培養(yǎng)物顆粒飼料和C57BL/6小鼠均由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選取36只6周齡健康狀況良好、體重[(19.85±1.45) g]相近的雄性小鼠，在鼠房適應(yīng)3 d后，隨機(jī)分為3組，每組12個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1只。對(duì)照組飼喂玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧(對(duì)照組粗蛋白質(zhì)水平用酪蛋白補(bǔ)足)，試驗(yàn)組分別用0.5%和1.0% YC替代基礎(chǔ)飼糧中的玉米。試驗(yàn)期10 d，在試驗(yàn)第11天處死小鼠。試驗(yàn)飼糧參照無(wú)特定病原體(SPF)維持鼠料營(yíng)養(yǎng)需要配制，試驗(yàn)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.3 樣品采集

將小鼠安樂(lè)死，采集各組小鼠十二指腸(位置為幽門(mén)1 cm處往下至“U”狀彎曲結(jié)束處)和空腸(位置為“U”狀彎曲結(jié)束處1～6 cm)，在直尺的比對(duì)下，截取長(zhǎng)度相近自然狀態(tài)下伸展的十二指腸和前端空腸，結(jié)果精確到0.1 cm；縱向剪開(kāi)腸道，清除內(nèi)容物，吸水紙吸干水分后，采用特種準(zhǔn)確度級(jí)(I級(jí))、精度為0.000 1 g的天平(LS120A，瑞士普利賽斯公司)稱(chēng)量小腸重量，計(jì)算十二指腸和空腸單位長(zhǎng)度重量：

十二指腸單位長(zhǎng)度重量(mg/cm)=1 000×十二指腸重量/十二指腸長(zhǎng)度；空腸單位長(zhǎng)度重量(mg/cm)=1 000×空腸重量/空腸長(zhǎng)度。

將樣品分為2份，1份固定于4%多聚甲醛中，用于制作切片；1份置于凍存管中-80 ℃冰箱保存，用于勻漿及生化指標(biāo)檢測(cè)。

1.4 空腸總超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活性及丙二醛(MDA)含量檢測(cè)

取空腸樣品，經(jīng)勻漿、離心后，取上清按照試劑盒(南京建成生物工程研究所)說(shuō)明書(shū)操作步驟檢測(cè)空腸T-SOD、GSH-Px活性和MDA含量。

1.5 伊紅-蘇木精(HE)染色

經(jīng)脫水、包埋、切片制作5 μm空腸切片，HE染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察隱窩絨毛軸形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。每組選取6只小鼠，每只小鼠選取5張空腸切片，利用ImageJ軟件統(tǒng)計(jì)絨毛高度(villus height，VH)和隱窩深度(crypt depth，CD)，并計(jì)算絨毛高度和隱窩深度的比值(villus height/crypt depth，VH/CD)。

1.6 免疫熒光(immunofluorescence，IF)染色

腸道切片經(jīng)抗原修復(fù)、0.25%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)通透、5%牛血清白蛋白(BSA)封閉、一抗和二抗孵育、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)核染后，在熒光顯微鏡下拍照，并利用ImageJ軟件統(tǒng)計(jì)熒光信號(hào)強(qiáng)度或陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量。其中CGA(#ab15160)購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；裂解半胱天冬酶-3(cleaved caspase-3，#9664)、角蛋白20(KRT20，#13063)購(gòu)自美國(guó)CST公司；溶菌酶(LYZ，#A0099)購(gòu)自丹麥安捷倫公司；Villin(#sc-58897)購(gòu)自美國(guó)圣克魯斯生物技術(shù)(上海)有限公司；帶狀閉合蛋白-1(ZO-1，#339100)購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技公司；閉合蛋白(Occludin，#502601)和增殖細(xì)胞核抗原(PCNA，200947-6B12)購(gòu)自成都正能生物技術(shù)有限責(zé)任公司；熒光二抗(#125365，#133384)購(gòu)自美國(guó)JIR公司。

1.7 蛋白免疫印跡(Western blotting)

樣品經(jīng)放射免疫沉淀法(radio-immunoprecipitation assay，RIPA)裂解、二辛可寧酸含量(bicinchoninic acid，BCA)測(cè)定濃度后，加入Loading buffer制作濃度均一的蛋白樣品；隨后通過(guò)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉封閉、一抗和二抗孵育以及化學(xué)發(fā)光儀拍照獲得蛋白條帶，用ImageJ軟件統(tǒng)計(jì)灰度值。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析組間差異顯著性，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著，0.05

2 結(jié) 果

2.1 YC對(duì)小鼠生長(zhǎng)性能的影響

由圖1-A可知，與對(duì)照組相比，0.5% YC組小鼠ADFI極顯著增加(P<0.01)，而1.0% YC組小鼠ADFI有增加的趨勢(shì)(P=0.073)。由圖1-B可知，與對(duì)照組相比，1.0% YC組小鼠ADG極顯著增加(P<0.01)。由圖1-C可知，與對(duì)照組相比，1.0% YC組小鼠F/G顯著降低(P<0.05)。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)注*表示差異顯著(P<0.05)，標(biāo)注**表示差異極顯著(P<0.01)。下圖同。

2.2 YC對(duì)小鼠十二指腸和空腸單位長(zhǎng)度重量的影響

由圖2-A可知，與對(duì)照組相比，0.5% YC組小鼠十二指腸單位長(zhǎng)度重量無(wú)顯著差異(P>0.05)，1.0% YC組小鼠十二指腸單位長(zhǎng)度重量顯著增加(P<0.05)。圖2-B可知，與對(duì)照組相比，0.5% YC組相小鼠空腸單位長(zhǎng)度重量有增加的趨勢(shì)(P=0.059)，1.0% YC組小鼠空腸單位長(zhǎng)度重量顯著增加(P<0.05)。因此，后續(xù)研究選擇空腸作為檢測(cè)對(duì)象。

圖2 YC對(duì)小鼠十二指腸和空腸單位長(zhǎng)度重量的影響

2.3 YC對(duì)小鼠空腸T-SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影響

由圖3-A可知，與對(duì)照組相比，0.5%和1.0% YC組小鼠空腸T-SOD活性極顯著增加(P<0.01)。由圖3-B可知，與對(duì)照組相比，0.5%和1.0% YC組小鼠空腸GSH-Px活性顯著增加(P<0.05)。由圖3-C可知，與對(duì)照組相比，0.5% YC組小鼠空腸MDA含量有降低的趨勢(shì)(P=0.079)，1.0% YC組小鼠空腸MDA含量顯著降低(P<0.05)。

圖3 YC對(duì)小鼠空腸T-SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影響

2.4 YC對(duì)小鼠空腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

圖4-A為小鼠空腸HE染色結(jié)果。由圖4-B可知，與對(duì)照組相比，0.5%和1.0% YC組小鼠空腸VH顯著增加(P<0.05)。由圖4-C可知，各組之間組小鼠空腸CD無(wú)顯著差異(P>0.05)。由圖4-D可知，與對(duì)照組相比，0.5%和1.0% YC組小鼠空腸VH/CD顯著增加(P>0.05)。

圖4 YC對(duì)小鼠空腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

2.5 YC對(duì)小鼠空腸緊密連接蛋白表達(dá)的影響

圖5-A為空腸中ZO-1和Occludin的IF染色結(jié)果。由圖5-B和圖5-C可知，與對(duì)照組相比，0.5%和1.0% YC組小鼠空腸ZO-1和Occludin熒光信號(hào)強(qiáng)度極顯著增加(P<0.01)，0.5%和1.0% YC組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。圖5-D為空腸中ZO-1和Occludin的Western blotting結(jié)果。由圖5-E可知，與對(duì)照組相比，0.5%和1.0% YC組小鼠空腸ZO-1和Occludin相對(duì)表達(dá)量極顯著上調(diào)(P<0.01)，0.5%和1.0% YC組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。

圖5 YC對(duì)小鼠空腸緊密連接蛋白表達(dá)的影響

2.6 YC對(duì)小鼠空腸細(xì)胞增殖的影響

圖6-A為空腸PCNA和cleaved caspase-3的IF染色結(jié)果。由圖6-B和圖6-C可知，與對(duì)照組相比，0.5%和1.0% YC組PCNA熒光信號(hào)強(qiáng)度極顯著增加(P<0.01)，而cleaved caspase-3熒光信號(hào)強(qiáng)度極顯著降低(P<0.01)。

圖6 YC對(duì)小鼠空腸細(xì)胞增殖的影響

2.7 YC對(duì)小鼠空腸細(xì)胞分化的影響

圖7-A為空腸KRT20、Villin、CGA和LYZ的IF染色結(jié)果。由圖7-B可知，與對(duì)照組相比，0.5%和1.0% YC組KRT20熒光信號(hào)強(qiáng)度極顯著增加(P<0.01)。由圖7-C可知，與對(duì)照組相比，0.5%和1.0% YC組Villin熒光信號(hào)強(qiáng)度顯著上調(diào)(P<0.05)。由圖7-D可知，與對(duì)照組相比，0.5%和1.0% YC組CGA熒光信號(hào)強(qiáng)度極顯著上調(diào)(P<0.01)；由圖7-E可知，與對(duì)照組相比，0.5%和1.0% YC組隱窩中LYZ陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著增加(P<0.05)。

圖7 YC對(duì)小鼠空腸細(xì)胞分化的影響

3 討 論

YC作為一種功能性飼料添加劑，含有大量蛋白質(zhì)、氨基酸和維生素等已知成分以及酵母菌分泌的各種代謝產(chǎn)物和某些未知的“生長(zhǎng)因子”等，可增加飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。研究表明，YC能改善飼料適口性，提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化率。而適口性關(guān)乎采食量的穩(wěn)定性，飼料消化率與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和動(dòng)物生長(zhǎng)性能成正比。研究表明，斷奶仔豬飼糧中添加0.5% YC可顯著增加ADFI[11]；在家禽上的研究同樣發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加1.25、1.50和2.50 g/kg YC均能提高飼料轉(zhuǎn)化率[12]。這與本研究結(jié)果一致，飼糧中添加0.5和1.0% YC具備提升小鼠生長(zhǎng)性能的作用，進(jìn)一步拓寬了YC在哺乳動(dòng)物飼糧中的添加范圍，為降低YC水平、控制飼料成本提供借鑒。

小腸是吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的主要場(chǎng)所。VH是反映腸吸收功能的關(guān)鍵指標(biāo)。研究表明，YC可促進(jìn)豬和肉雞小腸上皮發(fā)育，增加VH，刺激機(jī)體生長(zhǎng)[13-15]。本研究結(jié)果同樣顯示，飼糧中添加0.5和1.0% YC能夠促進(jìn)小鼠空腸絨毛生長(zhǎng)，改善腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)，且飼糧中添加1.0% YC增加十二指腸和空腸重量。因此，YC具有促更新和促再生的雙重作用。同時(shí)，小腸也是機(jī)體抵御外來(lái)病原菌侵襲的重要防線。細(xì)胞膜上Occludin末端與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)膜表面帶狀閉合蛋白(ZO)相連，并通過(guò)磷酸化修飾控制緊密連接蛋白復(fù)合物的功能。本研究表明，飼糧中添加0.5%和1.0% YC能調(diào)節(jié)空腸上皮緊密連接蛋白的定位和表達(dá)，增強(qiáng)腸道屏障功能。其機(jī)制可能為YC通過(guò)抑制核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)信號(hào)通路介導(dǎo)的腫瘤壞死因子-α的釋放，上調(diào)Occludin和ZO-1基因表達(dá)，加強(qiáng)細(xì)胞間的緊密連接，改善腸道通透性，阻礙腸道中的內(nèi)毒素進(jìn)入血液[14,16]。此外，YC中存在谷胱甘肽和超氧化物歧化酶等酵母代謝產(chǎn)物[17]。這些抗氧化物質(zhì)被證明能清除氧和氮自由基，降低腸道氧化應(yīng)激反應(yīng)，改善隱窩絨毛軸形態(tài)，維持腸上皮完整性。姚仕彬等[5]研究證實(shí)，YC水溶物對(duì)氧化物丙二醛誘導(dǎo)的草魚(yú)腸道黏膜細(xì)胞具有保護(hù)作用。這與本研究提出的YC具有提高小鼠小腸抗氧化功能的觀點(diǎn)一致。

腸道干細(xì)胞是腸上皮結(jié)構(gòu)形成的基石，YC中各種豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不僅能為腸道干細(xì)胞分裂提供能量和合成蛋白質(zhì)、脂質(zhì)的底物，而且可能作為信號(hào)分子刺激其不斷更新，促進(jìn)腸道消化吸收和增強(qiáng)腸道屏障功能。本課題組研究表明，谷氨酸和蛋氨酸等功能性物質(zhì)可通過(guò)激活哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1(mTORC1)和Wnt/β-連環(huán)蛋白(Wnt/β-catenin)信號(hào)加速腸道干細(xì)胞擴(kuò)增，促進(jìn)隱窩絨毛軸更新[18-19]。本研究結(jié)果表明，飼糧中添加0.5%和1.0% YC不僅具有促進(jìn)隱窩中腸細(xì)胞增殖的作用，而且能抑制絨毛上部細(xì)胞凋亡。本研究進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，YC能促進(jìn)其向吸收細(xì)胞、腸內(nèi)分泌細(xì)胞和潘氏細(xì)胞分化。而杯狀細(xì)胞分泌的黏蛋白及潘氏細(xì)胞分泌的溶菌酶和防御素是腸道化學(xué)和免疫屏障的重要組分。有研究表明，YC可增加腸道杯狀細(xì)胞MUC2 mRNA相對(duì)豐度[20]。其機(jī)制可能為吸收細(xì)胞、腸內(nèi)分泌細(xì)胞數(shù)量的增加使得YC組小鼠擁有更高的VH，進(jìn)而提高其生長(zhǎng)性能。然而，YC通過(guò)何種途徑影響腸道干細(xì)胞活性需進(jìn)一步挖掘。

4 結(jié) 論

飼糧中添加0.5%和1.0% YC均能促進(jìn)腸道上皮細(xì)胞增殖分化，維持腸上皮結(jié)構(gòu)和屏障功能完整性，增強(qiáng)腸道抗氧化能力，提高小鼠生長(zhǎng)性能。