代培，郭琦,田佳麗，馬鳳嬌，王銀平，劉凱*

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水漁業(yè)和種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214081；2.江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇 南京 210017;3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 無錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇 無錫 214081)

刀鱭Coilianasus為溯河產(chǎn)卵的洄游型魚類，在中國(guó)渤海、黃海和東海均有分布，每年2月刀鱭開始進(jìn)入長(zhǎng)江進(jìn)行生殖洄游，繁殖完成后返回近海育肥[1]。刀鱭曾是長(zhǎng)江下游重要的捕撈對(duì)象，20世紀(jì)70—80年代刀鱭在上海市、江蘇省和安徽省的年平均捕撈量約為2 904 t，隨著長(zhǎng)江流域水利工程的興建、水環(huán)境污染的加劇及捕撈強(qiáng)度的提高，刀鱭資源量出現(xiàn)急劇衰退，進(jìn)入21世紀(jì)刀鱭魚汛幾近消失，其中，2001—2005年刀鱭年平均捕撈量下降為673 t，2010—2013年僅為116.6 t[2-4]。

線蟲主要寄生于魚的體腔、消化道、鰓、肝臟、鰾和生殖腺等部位。線蟲寄生魚體后，感染部位會(huì)組織加厚、充血或出血，線蟲在魚體內(nèi)生長(zhǎng)和移行會(huì)造成大腦、心臟等重要器官損傷，有的線蟲以宿主的血液為食，會(huì)造成宿主明顯消瘦，這些損傷可造成魚類發(fā)育不良，影響魚類繁殖，甚至導(dǎo)致魚類死亡，對(duì)魚類種群的補(bǔ)充產(chǎn)生較大影響[5]。對(duì)刀鱭寄生線蟲的調(diào)查研究最早始于20世紀(jì)70年代，徐屷南等[6]研究認(rèn)為，簡(jiǎn)單異尖線蟲僅感染長(zhǎng)江刀鱭，可作為洄游型刀鱭的“生物指標(biāo)”。Li等[7]利用長(zhǎng)江口刀鱭感染簡(jiǎn)單異尖線蟲等4種海水性寄生蟲的強(qiáng)度變化規(guī)律來探究刀鱭上溯洄游和降海洄游的時(shí)間。為進(jìn)一步確認(rèn)刀鱭感染線蟲的種類，劉凱[8]利用分子鑒定的方法確認(rèn)感染刀鱭的線蟲共有6種，均為海水性寄生蟲，其中，異尖屬2種，宮脂屬4種，優(yōu)勢(shì)種為派氏異尖線蟲Anisakispegreffii。目前，未見對(duì)洄游汛期內(nèi)刀鱭感染線蟲現(xiàn)狀開展連續(xù)調(diào)查的報(bào)道。本研究中，于2018年4—7月在長(zhǎng)江安慶段對(duì)刀鱭的線蟲寄生現(xiàn)狀開展連續(xù)調(diào)查，分析長(zhǎng)江刀鱭的線蟲感染現(xiàn)狀及其時(shí)間特征，以期為后續(xù)開展長(zhǎng)江刀鱭種群補(bǔ)充的影響研究提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 樣本采集站位與時(shí)間

于2018年4月18日至7月15日，在長(zhǎng)江下游安慶段設(shè)置4個(gè)采樣點(diǎn),逐日開展刀鱭樣本采集(圖1)，受天氣等因素的影響，部分日期未開展調(diào)查，實(shí)際調(diào)查時(shí)間為72 d。調(diào)查網(wǎng)具為流刺網(wǎng)，由2層襯網(wǎng)和1層內(nèi)網(wǎng)組成，網(wǎng)長(zhǎng)、網(wǎng)高分別為200、2.8 m，內(nèi)網(wǎng)和襯網(wǎng)網(wǎng)目分別為3、28 cm。調(diào)查期間，將流刺網(wǎng)一端固定于一艘漁船，另一艘漁船完成下網(wǎng)并固定網(wǎng)具的另一端，以順?biāo)较蜷_始拖網(wǎng)。同步測(cè)定水體的濁度、溶解氧(DO)、溫度和pH。

圖1 刀鱭調(diào)查區(qū)示意圖Fig.1 Sketch of sampling regions for investigation of estuarine tapertail anchovy Coilia nasus

1.2 方法

1.2.1 樣本處理 現(xiàn)場(chǎng)采集1 658尾刀鱭樣本，經(jīng)統(tǒng)一編號(hào)后進(jìn)行表觀生物學(xué)測(cè)定。仔細(xì)檢查刀鱭鰓、體表、腹腔、圍心腔膜、性腺膜、肝臟及消化道內(nèi)外等處的線蟲，全數(shù)采集計(jì)數(shù)并保存于無水乙醇中。此外，隨機(jī)抽取1 044尾刀鱭，統(tǒng)計(jì)線蟲在其體內(nèi)各個(gè)部位的分布情況。

1.2.2 線蟲分子鑒定 從采集到的線蟲樣本中隨機(jī)抽取252條作為分子鑒定樣本，其中4—7月每月抽取數(shù)量分別為60、69、63、60條。使用TIANamp Marine Animals DNA Kit提取線蟲DNA，-20 ℃冰箱中凍存。采用保守引物擴(kuò)增ITS1-5.8S-ITS2序列，引物序列為NC5-ITS-R(5′TAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT 3′)和NC2-ITS-F(5′TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT 3′)[8]，模板為線蟲總DNA。PCR反應(yīng)體系(30 μL)：上、下游引物各1.2 μL，DNA模板2 μL，2×Premix Taq (TaKaRa)15 μL，用ddH2O補(bǔ)足至30 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃下預(yù)變性5 min；94 ℃下循環(huán)變性45 s，56 ℃下退火復(fù)性30 s，72 ℃下延伸1 min，共進(jìn)行35個(gè)循；最后在72 ℃下延伸10 min。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，將凝膠條帶大小與預(yù)期結(jié)果相符的樣品送至無錫亦欣生物技術(shù)有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果登錄NCBI進(jìn)行Blast對(duì)比分析。

1.2.3 寄生生態(tài)學(xué)指標(biāo)的測(cè)定與計(jì)算 參照Bush等[9]和吳金英等[10]的方法，使用以下寄生生態(tài)學(xué)指標(biāo)：

感染率=寄生線蟲的宿主數(shù)/檢查的宿主總數(shù)×100%，

感染強(qiáng)度=檢查到的線蟲數(shù)/寄生線蟲的宿主總數(shù)，

感染豐度=檢查到的線蟲數(shù)/檢查的宿主總數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示，用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan法進(jìn)行組間多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 水體理化參數(shù)

各時(shí)段水體理化指標(biāo)見表1,調(diào)查水域水體濁度平均值為(31.56±13.14)NTU，溶解氧質(zhì)量濃度平均值為(6.92±0.55)mg/L，水溫平均值為(24.65±2.83)℃，pH平均值為(7.71±0.19)。

表1 調(diào)查水域水體理化指標(biāo)的時(shí)間特征Tab.1 Characteristics for environmental parameters in different months

2.2 刀鱭生物學(xué)特征

現(xiàn)場(chǎng)采集的1 658尾刀鱭樣本，頜骨長(zhǎng)均大于頭長(zhǎng)。其中，左頜骨長(zhǎng)/頭長(zhǎng)的平均值為(1.18±0.09)mm，右頜骨長(zhǎng)/頭長(zhǎng)的平均值為(1.17±0.09)mm；全長(zhǎng)為176.47～397.86 mm，平均值為(273.22±24.27)mm；體長(zhǎng)為162.41～394.72 mm，平均值為(252.68±23.31)mm；體質(zhì)量為18.09～157.22 g，平均值為(53.27±16.51)g；雌雄比為0.97(表2)。

2.3 刀鱭感染線蟲的頻率分布

調(diào)查采集的刀鱭樣本中感染個(gè)體為1 575尾，感染率為96.32%。所有感染樣本中共檢出線蟲16 838條，平均感染強(qiáng)度為(10.69±9.67)條/尾，平均感染豐度為(10.16±9.67)條/尾，感染線蟲數(shù)量最多個(gè)體為2018年6月11日采集的1尾體質(zhì)量51.05 g的刀鱭，共檢出線蟲145條。在所有感染線蟲的刀鱭樣本中，寄生數(shù)量介于1～9條的個(gè)體最多，占比為52.53%；寄生數(shù)量大于30條的個(gè)體共計(jì)62尾，占比為3.93%；大于100條的共2尾，占比為0.12%(圖2)。

圖2 線蟲在刀鱭中的頻率分布Fig.2 Percent of host infection in different number of estuarine tapertail anchovy Coilia nasus

2.4 不同規(guī)格刀鱭的線蟲寄生特征

將刀鱭樣本按體長(zhǎng)分為7組，各體長(zhǎng)組刀鱭的線蟲感染情況分析顯示，小于200 mm體長(zhǎng)組的感染率最低(87.50%)，280～300 mm體長(zhǎng)組的感染率最高(97.50%)，當(dāng)?shù)恩q體長(zhǎng)大于300 mm時(shí)，線蟲感染率下降明顯(圖3(a))。平均感染強(qiáng)度和平均感染豐度隨體長(zhǎng)增加的變化趨勢(shì)較為一致，其中，兩個(gè)指標(biāo)均在260～279 mm體長(zhǎng)組最高，在體長(zhǎng)<200 mm組最低，且隨體長(zhǎng)增加均表現(xiàn)為先升高后下降趨勢(shì)(圖3(b))。

標(biāo)有不同字母者表示同一指標(biāo)下不同組間有顯著性差異,標(biāo)有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)，下同。Note:Means with different letters in same index are significant differences in different groups at the 0.05 probability level,and the means with the same letter are not significant differences,et sequentia.圖3 不同體長(zhǎng)組刀鱭中線蟲的感染強(qiáng)度和感染豐度Fig.3 Infection intensity and abundance of nematodes for estuarine tapertail anchovy Coilia nasus in different body length groups

2.5 不同采樣時(shí)間刀鱭的線蟲寄生特征

隨著時(shí)間推移，刀鱭的線蟲感染率、平均感染強(qiáng)度和平均感染豐度均呈現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)。感染率在6月上半月最高(98.32%)，其次是5月下半月(96.75%)，最低值在4月下半月(89.36%)(圖4(a))。平均感染強(qiáng)度和平均感染豐度的變化趨勢(shì)一致，二者均在6月上半月最高，分別為(12.04±11.64)、(11.84±11.65)條/尾，最低值則出現(xiàn)在4月下半月，分別為(6.90±6.13)、(6.17±6.18)條/尾，其中，平均感染強(qiáng)度和平均感染豐度在6月上半月均出現(xiàn)顯著性上升(P<0.05)，平均感染強(qiáng)度在7月上半月出現(xiàn)顯著性下降(P<0.05)，平均感染豐度在6月下半月出現(xiàn)顯著性下降(P<0.05)(圖4(b))。

圖4 線蟲寄生指標(biāo)的時(shí)間特征Fig.4 Infection of characteristics for nematodes in different months

2.6 刀鱭中線蟲的寄生部位

從隨機(jī)抽取的1 044尾感染刀鱭樣本中共檢出線蟲10 782條，按寄生部位統(tǒng)計(jì)附著或嵌入各組織內(nèi)的線蟲數(shù)量。線蟲寄生于腹腔內(nèi)壁、肝臟、腸道、胃、幽門盲囊和性腺，其中，線蟲分布數(shù)量最多的為腸道，共檢出線蟲4 449條，占檢出線蟲總數(shù)的41.26%，其次為幽門盲囊，檢出線蟲數(shù)量為3 359條，占比為31.15%，線蟲分布數(shù)量最少的是胃，僅檢出69條，占比為0.64%(圖5、圖6)。

圖5 刀鱭體內(nèi)線蟲的分布情況Fig.5 Distribution of nematodes in estuarine tapertail anchovy Coilia nasus

2.7 線蟲的種類組成

分子鑒定結(jié)果顯示，刀鱭感染的線蟲共6種，其中，異尖屬線蟲2種，分別為派氏異尖線蟲Anisakispegreffii和簡(jiǎn)單異尖線蟲A.simplex，宮脂屬4種，分別為內(nèi)彎宮脂線蟲Hysterothylaciumaduncum、費(fèi)氏宮脂線蟲H.fabri、中華宮脂線蟲H.sinens和廈門宮脂線蟲H.amoyense，派氏異尖線蟲數(shù)量最多，占抽樣線蟲總數(shù)的71.83%，其次是內(nèi)彎宮脂線蟲，占比為8.73%，廈門宮脂線蟲最少，占比為0.40%。派氏異尖線蟲電鏡圖見圖7。

A—線蟲寄生于刀鱭的腸道；B—線蟲寄生于刀鱭的肝臟；C—線蟲寄生于刀鱭的幽門盲囊；D—線蟲游離于刀鱭的腹腔內(nèi)壁；E—嵌入線蟲的刀鱭肝臟。A—parasitize the intestines；B—parasitize the liver；C—parasitize the pyloric caeca;D—parasitize the abdominal wall；E—liver embedded in nematodes.圖6 刀鱭中線蟲的寄生部位Fig.6 Parasitic pattern of nematodes in estuarine tapertail anchovy Coilia nasus

3 討論

3.1 長(zhǎng)江安慶段刀鱭感染線蟲現(xiàn)狀

刀鱭作為典型的江海洄游型魚類及長(zhǎng)江下游流域名貴的經(jīng)濟(jì)魚類，兼具生態(tài)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。本次調(diào)查顯示，長(zhǎng)江安慶段刀鱭線蟲感染率極高，達(dá)到96.32%，平均感染強(qiáng)度和平均感染豐度分別為(10.69±9.67)、(10.16±9.67)條/尾，上述3項(xiàng)指標(biāo)均高于2011年和2017年長(zhǎng)江安慶段刀鱭線蟲感染調(diào)查結(jié)果[8,11]。刀鱭感染情況較為嚴(yán)重，考慮到本次調(diào)查基本覆蓋了當(dāng)年安慶段整個(gè)刀鱭洄游汛期，且解剖并統(tǒng)計(jì)了所有采集的樣本，故調(diào)查結(jié)果具有代表性。本研究中，刀鱭寄生線蟲分子鑒定結(jié)果顯示，刀鱭感染線蟲共6種，其中，異尖屬2種，宮脂屬4種，均為海水性寄生蟲[12]，這同2016年長(zhǎng)江下游刀鱭感染線蟲的物種相一致[8]。刀鱭洄游至長(zhǎng)江后，一方面長(zhǎng)江定居魚類和甲殼類感染線蟲較少[13-14]，另一方面刀鱭洄游過程中一般不攝食，故其感染淡水性線蟲的概率極低，這也與已有研究結(jié)果相符[8,11]。異尖科線蟲在海洋魚類中的感染率較高[15-17]，其寄生于海洋哺乳類后發(fā)育成熟，刀鱭作為中間宿主，其感染的線蟲均為幼蟲，不會(huì)在刀鱭體內(nèi)繁殖[18]，刀鱭體內(nèi)寄生的異尖科線蟲均因在近海攝食感染。刀鱭溯河進(jìn)入淡水后，遠(yuǎn)離感染源，因此，異尖線蟲感染情況應(yīng)反映出其在近海生活期間棲息水域中磷蝦等餌料生物的線蟲感染情況較為嚴(yán)重。

A—頭部，正面觀；B—頭部，側(cè)面觀；C—尾部，側(cè)面觀；D—尾尖。A—cephalic extremity,front view;B—cephalic extremity,lateral view;C—posterior region,lateral view;D—tip of tail.圖7 派氏異尖線蟲電鏡圖Fig.7 Electronic microscope diagraph of parasite Anisakis pegreffii

線蟲主要寄生于刀鱭腹腔內(nèi)，受洄游產(chǎn)生的滲透壓及外界水環(huán)境變化的影響較小，就刀鱭個(gè)體而言,在洄游過程中其線蟲感染強(qiáng)度不會(huì)發(fā)生顯著變化[19]。但刀鱭洄游群體平均感染強(qiáng)度則可能在洄游過程中發(fā)生改變，其變化可能來自感染嚴(yán)重的個(gè)體因損傷嚴(yán)重而導(dǎo)致死亡，進(jìn)而導(dǎo)致整體感染強(qiáng)度下降[20]。此外，僅有少數(shù)宿主感染寄生蟲數(shù)量大，而大多數(shù)宿主感染數(shù)量較少的這種寄生特征是寄生蟲與宿主相互關(guān)系的一種普遍形式，這對(duì)于宿主和寄生蟲都較為有利[21]。

本研究顯示，刀鱭因攝食而感染線蟲，除胃、腸道和幽門盲囊內(nèi)有線蟲寄生外，刀鱭的肝臟、性腺、腹腔內(nèi)壁及腸系膜均有線蟲附著寄生，由此可見，線蟲在刀鱭體內(nèi)會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)移，這可能是受線蟲密度的影響，也可能是線蟲個(gè)體發(fā)育所需[22]。從刀鱭各部位線蟲寄生比例來看，在腸道和幽門盲囊的寄生占比較高，分別為41.26%和31.15%。線蟲經(jīng)胃腸行移至刀鱭腹腔各器官，可能會(huì)引起消化道等組織損傷，進(jìn)而引發(fā)炎癥等免疫反應(yīng)。進(jìn)入腹腔后線蟲則會(huì)嵌入或刺穿刀鱭肝臟等臟器，產(chǎn)生直接損傷或?qū)е赂闻K纖維化等損傷[23]。

3.2 長(zhǎng)江安慶段刀鱭感染線蟲的宿主差異

本研究顯示，在所有的感染樣本中，小規(guī)格體長(zhǎng)組(<240 mm)線蟲感染率明顯低于較大規(guī)格體長(zhǎng)組，感染強(qiáng)度和感染豐度也表現(xiàn)出了同樣的趨勢(shì)，這種趨勢(shì)在黃顙魚寄生蟲感染和黃鱔胃瘤線蟲感染情況中也同樣出現(xiàn)[24-25]。刀鱭感染的6種線蟲均為海水性寄生蟲，且均來自外源攝入。由于小規(guī)格刀鱭在近海生活的時(shí)間較短，經(jīng)捕食攝入線蟲的概率相對(duì)低于大規(guī)格個(gè)體，這與小規(guī)格個(gè)體感染指標(biāo)均低于較大規(guī)格個(gè)體是相符的。此外，本研究中還發(fā)現(xiàn)，線蟲感染數(shù)量大于40條/尾的刀鱭體長(zhǎng)和體質(zhì)量均顯著小于其他組，這應(yīng)與寄生線蟲對(duì)刀鱭的影響有關(guān)，線蟲寄生于刀鱭體內(nèi)依靠其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)生存，且對(duì)刀鱭的腸道、肝臟等組織產(chǎn)生損傷,從而影響刀鱭生長(zhǎng)。

3.3 長(zhǎng)江安慶段刀鱭感染線蟲的時(shí)間特征

本研究顯示，刀鱭的線蟲感染情況在不同時(shí)間段有所差異，隨著時(shí)間的推移，整體上刀鱭的線蟲感染率、感染強(qiáng)度和感染豐度均呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，3項(xiàng)指標(biāo)均在6月上半月達(dá)到峰值，最低值則均出現(xiàn)于4月下半月，這種不同時(shí)間段感染特征應(yīng)與刀鱭洄游群體的洄游習(xí)性有關(guān)。刀鱭2月初自長(zhǎng)江口向長(zhǎng)江進(jìn)行生殖洄游，4月初長(zhǎng)江安慶段陸續(xù)出現(xiàn)洄游型刀鱭，刀鱭感染線蟲的時(shí)間特征可能同刀鱭生活海域異尖線蟲暴發(fā)的時(shí)間相關(guān)。此外，刀鱭的線蟲感染強(qiáng)度與刀鱭個(gè)體規(guī)格相關(guān)，本研究中，刀鱭規(guī)格隨時(shí)間變化特征同其感染線蟲的時(shí)間特征趨勢(shì)較為一致，整體上均呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，2018年刀鱭專項(xiàng)捕撈尚未停止，受捕撈壓力影響，早期捕獲的刀鱭規(guī)格較小，而小規(guī)格刀鱭感染線蟲的概率較低，故其線蟲感染指標(biāo)較低。長(zhǎng)江安徽段刀鱭專項(xiàng)捕撈許可時(shí)段為4月27日—5月26日，隨著下游江段刀鱭許可捕撈逐漸停止[4]，刀鱭漁獲規(guī)格呈增大趨勢(shì)，在6月上半月達(dá)到最大，這同刀鱭感染線蟲情況的變化趨勢(shì)一致，后期隨著刀鱭洄游汛期接近末期，刀鱭資源量下降，捕獲的刀鱭漁獲規(guī)格也出現(xiàn)下降，其線蟲感染指標(biāo)也開始下降。刀鱭感染線蟲的時(shí)間變化特征同刀鱭漁獲規(guī)格變化趨勢(shì)一致，也較好地印證了刀鱭感染線蟲的時(shí)間、規(guī)格與感染強(qiáng)度的關(guān)系。

4 結(jié)論

1)刀鱭的線蟲感染率較高，但感染嚴(yán)重的個(gè)體數(shù)占比較小，52.53%的刀鱭感染線蟲數(shù)量介于1～9條。

2)刀鱭因攝食感染線蟲，其腸道和幽門盲囊的線蟲數(shù)量占比較高，且線蟲在刀鱭體內(nèi)會(huì)發(fā)生行移，在其肝臟、性腺、腹腔內(nèi)壁等處也有寄生。

3)刀鱭中寄生的線蟲共有6種，均為海水性寄生蟲，優(yōu)勢(shì)種為派氏異尖線蟲。

4)刀鱭的規(guī)格和洄游時(shí)間與其線蟲感染有一定的相關(guān)性，其中線蟲感染強(qiáng)度隨刀鱭體長(zhǎng)的增加及洄游時(shí)間的后移均表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)。