朱隴強(qiáng)，朱志煌，朱雷宇，王定全，王健鑫*，林琪*

(1.福建省水產(chǎn)研究所 福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點實驗室，福建 廈門 361013；2.浙江海洋大學(xué) 海洋微生物分子生態(tài)與應(yīng)用實驗室,浙江 舟山 316022)

匙指蝦科Atyidae屬于甲殼動物亞門Crustacea軟甲綱Malacostraca十足目Decapoda真蝦下目Caridea，該科物種廣泛分布于熱帶和溫帶的淡水和海水環(huán)境中[1]。全球匙指蝦科物種約400種，分布于約40個屬中[2]，最典型特征是螯上具有毛發(fā)狀的剛毛，體型通常較小(全長<35 mm)[3]。匙指蝦科物種在沉積物分解、顆粒有機(jī)物處理及生境底棲生物群落組成過程中發(fā)揮著重要的生態(tài)作用[4]。近年來，基于部分線粒體基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析指出,匙指蝦科物種分類關(guān)系受地殼運動影響，古老的岡瓦大陸斷裂與特提斯海封閉可能是引起該類群物種進(jìn)一步分化的主要原因。因此，盡可能全面地收集匙指蝦科物種線粒體基因組數(shù)據(jù)，對開展分子系統(tǒng)學(xué)的相關(guān)研究非常有必要。

線粒體普遍存在于真核細(xì)胞中，負(fù)責(zé)大多數(shù)細(xì)胞ATP的產(chǎn)生，呈閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，通常由參與電子傳遞的37個編碼基因(13個PCGs、22個tRNA和2個rRNAs)組成[1]。線粒體基因通常被用作遺傳標(biāo)記，以確定生物進(jìn)化和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[5-6]。本研究中，基于GenBank中已公布的24種匙指蝦科物種線粒體基因組的全序列，并結(jié)合地理學(xué)知識對其進(jìn)行分子系統(tǒng)學(xué)相關(guān)分析，以期為深入研究匙指蝦科物種系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)的獲取

從GenBank線粒體基因組數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中檢索到本研究中24種匙指蝦科物種線粒體全基因組序列，并檢索各物種樣本的來源(圖1)。未檢索到中文名稱的物種直接用拉丁名表示，物種相關(guān)信息見表1。

圖1 GenBank中已公布的匙指蝦科線粒體基因組樣本類群的分布Fig.1 Distribution of the mitogenome sample taxa of Atyidae published in GenBank

1.2 方法

1.2.1 基因變異位點分析 使用ClustalW 2軟件對24種匙指蝦科物種線粒體基因組的13個PCGs序列和2個rRNA序列進(jìn)行多重序列比對，然后選擇DnaSP 6[7]軟件中的多態(tài)位點分析剔除缺失位點,并整理各基因的變異位點值。

1.2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析 使用ClustalW 2軟件對24種匙指蝦科物種線粒體基因組中13個PCGs序列進(jìn)行串聯(lián)比對，外類群為中華小長臂蝦Palaemonsinensis線粒體基因組中13個PCGs序列。將比對后的序列通過Gblocks軟件[8]提取保守序列。基于jModelTest軟件[9]對保守序列的替代模型進(jìn)行分析，根據(jù)赤池信息準(zhǔn)則(akaike criteria,AIC)，GTR+I+G (-lnL=150 789.030 2)為最佳替代模型用于后續(xù)計算分析。采用最大似然法(Maximum likelihood，ML)、鄰接法(Neighbor joining，NJ)和貝葉斯法(Bayesian inference，BI)分別構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。其中，采用PhyML 3.1軟件構(gòu)建ML樹，通過自展法(Bootstrap=1 000)評估節(jié)點可靠性;采用MEGA 5.0軟件構(gòu)建NJ樹，自展值設(shè)置為1 000;采用MrBayes 3.2.6軟件[10]構(gòu)建BI樹，運行世代數(shù)為1×107，運行一次由4條鏈組成，包括3條熱鏈(heated chain)和1條冷鏈(cold chain)，每運行500個世代取樣一次，每500個運行世代顯示一次進(jìn)展信息，收斂診斷設(shè)置為5 000。

1.2.3 物種分化時間估算 采用BEAST 2.6.3軟件[11]估算匙指蝦科各物種的分化時間?；诔喑匦畔?zhǔn)則，GTR+I+G為最佳分析模型。設(shè)置樹先驗(tree prior)選擇適用于分析來自不同物種序列的Yule模型。依據(jù)寬松對數(shù)正態(tài)分子鐘(uncorrelated relaxed lognormal clock)配合默認(rèn)參數(shù)配置的xml文件，將運行世代數(shù)設(shè)置為10 000,運行結(jié)束后所獲log文件中的ucld.stdev值為0.425，該值未接近0，故分子鐘選擇寬松分子鐘模型。依據(jù)生命進(jìn)化時間信息公共知識庫(http://www.timetree.org/)記錄的匙指蝦科起源時間和Jurado-Rivera等[12]對匙指蝦類群中部分適應(yīng)洞穴生活的蝦種分歧時間作為校準(zhǔn)節(jié)點，計算匙指蝦科的物種分歧時間。進(jìn)行馬爾可夫分析的運行鏈長為5×107，每運行1 000次抽樣一次，最后棄掉25%的老化鏈。采用FigTree 1.4.4軟件對估算結(jié)果進(jìn)行注釋。

2 結(jié)果與分析

2.1 匙指蝦科線粒體基因組的特征分析

從表1可見，匙指蝦科24個物種線粒體基因組的長度為15 318～16 430 bp，AT含量為62.20%～70.19%，高AT含量在十足動物中普遍存在。另外，24個匙指蝦科物種線粒體基因的排列順序完全相同，說明匙指蝦科物種在進(jìn)化中較保守。

表1 GenBank中已公布的匙指蝦科物種線粒體基因組序列信息Tab.1 Mitogenome sequence information of species in Atyidae published in GenBank

2.2 匙指蝦科線粒體基因組的差異位點分析

從表2可見：匙指蝦科線粒體基因組的15個基因(13個PCGs和2個rRNAs)中，nd6、atp8、nd2、nd4L、nd5、nd4和nd3 7個基因變異位點比例超過60%，cox1和cox3基因變異位點比例較低，分別為46.22%和48.85%；nd5基因變異位點數(shù)最多(1 098個)，其次為nd4和cox1基因，cox1基因變異位點比例較低，不適用于群體遺傳分析，而nd5和nd4基因變異位點比例較高，基因長度較長，且變異位點數(shù)也多，故可作為匙指蝦科理想的分子標(biāo)記，用于分析不同群體間的生物多樣性。

表2 匙指蝦科線粒體基因組的基因變異位點Tab.2 Gene variation sites in the mitogenome of Atyidae

2.3 匙指蝦科線粒體基因組的系統(tǒng)發(fā)育分析

基于24種匙指蝦科物種線粒體基因組的13個PCGs序列，利用ML、NJ和BI方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致，僅在個別物種間的分支關(guān)系存在差異。從圖2可見：Atyinae亞科聚為一大支,其內(nèi)部分支包括米蝦屬Caridina和新米蝦屬Neocaridina，新米蝦屬Neocaridina在米蝦屬Caridina內(nèi)聚為一支；Typhlatyinae、Caridellinae和Paratyinae亞科(TCP)聚為一大支，其中，Paratyinae單獨為一支，Caridellinae的兩個物種不在同一分支上；而Typhlatyinae聚為一支(除Typhlatyagalapagensis外)，其內(nèi)部分支包括Typhlatya、Stygiocaris和Typhlopatsa3個屬，其中Stygiocaris和Typhlopatsa聚為一支，互為姊妹關(guān)系。基于ML方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示，Halocaridinidesrubra與Typhlatyagalapagensis聚為一支，自展值較低(43)，Halocaridinidesfowleri獨自為一支，三者的關(guān)系為(…+(Halocaridinidesfowleri+(Halocaridinarubra+Typhlatyagalapagensis)+…))；基于NJ和BI方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹一致，結(jié)果顯示，這3個物種各自為一支且得到較高的自展值(>86)和后驗概率(>0.88)，它們之間的關(guān)系為(…+(Halocaridinidesfowleri+(Typhlatyagalapagensis+(Halocaridinarubra+…))))。

利用ML構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分支上的數(shù)值為自展值；利用NJ和BI構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分支上的數(shù)值為自展值和后驗概率。Value on the branch of the phylogenetic tree constructed by ML is the bootstrap probability;the value on the branch of the phylogenetic tree constructed by NJ and BI is the bootstrap probability and posterior probability.圖2 采用ML、NJ和BI方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree constructed using ML,NJ and BI methods

2.4 匙指蝦科線粒體基因組的分歧時間分析

基于最適合的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和分子進(jìn)化速率，用寬松分子鐘模型估算TCP物種最近的共同祖先在266.76～329.99 Mya(圖3，節(jié)點B)，其中，Caridellinae亞科物種最先出現(xiàn)分化是在205.63～285.12 Mya(圖3，節(jié)點C)；Typhlatyinae亞科物種最先出現(xiàn)分化是在174.94～242.37 Mya(圖3，節(jié)點E)，Typhlopatsa和Stygiocaris亞科物種最近的共同祖先在76.07～108.53 Mya(圖3，節(jié)點O)；Atyinae亞科物種最近的祖先在178.45～280.34 Mya(圖3，節(jié)點D)，其中新米蝦屬Neocaridina物種最近的共同祖先在14.70～41.69 Mya(圖3，節(jié)點W)。

3 討論

3.1 匙指蝦科物種系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

匙指蝦科所含物種相對較少，但其內(nèi)部分類關(guān)系一直存在爭議。本研究中，利用公共數(shù)據(jù)庫現(xiàn)有的線粒體基因組序列對24種匙指蝦科物種進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，研究結(jié)果與前人的結(jié)果對比發(fā)現(xiàn)，部分物種在分類地位上存在差異。本研究中，Typhlatyagarciai、Typhlatyapearsei、Typhlatyamitchelli、Typhlatyadzilamensis、Typhlatyaconsobrina和Typhlatyataina聚為一支，其內(nèi)部Typhlatyaconsobrina和Typhlatyataina互為姊妹關(guān)系且聚為一小支，其余4個物種聚為另一支，且各節(jié)點的ML值和BI值均較高，這與Jurado-Rivera等[12]基于13個PCGs序列的研究結(jié)果一致。然而Park等[13]基于13個PCGs序列的研究結(jié)果顯示，Typhlatyagarciai和Typhlatyapearsei與該分支其他物種的親緣關(guān)系均發(fā)生了變化(圖4A)，值得注意的是，該研究部分的分支節(jié)點支持度較低；Botello等[19]基于rrnL、COI、cytb、LSU、SSU和組蛋白H3A序列的研究結(jié)果顯示，Typhlatyagarciai獨自形成一支且與其余5個種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖4B)，各節(jié)點支持度較高，然而部分基因序列往往因可提取的信息有限而不能解決一些較煩瑣的系統(tǒng)發(fā)育問題，但該分支各物種親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近或許能支持本研究系統(tǒng)發(fā)育分析的準(zhǔn)確性。另外，本研究中還發(fā)現(xiàn)，基于不同的進(jìn)化分析方法，Halocaridinarubra和Typhlatyagalapagensis的親緣關(guān)系存在差異，前人的研究結(jié)果顯示，Halocaridinarubra和Typhlatyagalapagensis為姊妹關(guān)系且獨自形成一個分支[12，19]，這個結(jié)果與本研究中基于ML分析方法的研究結(jié)果一致，但本研究中節(jié)點支持度相對較低，說明二者的關(guān)系有待進(jìn)一步研究確定。

圖4 前人有關(guān)部分匙指蝦科物種的種類系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系假設(shè)[12,19]Fig.4 Previous hypotheses about the phylogenetic relationship of some species in Atyidae[12,19]

數(shù)字代表節(jié)點95% CI，板塊運動示意圖參考Jurado-Rivera等[12]的研究。Numbers represent 95% credible intervals (CI),and the sketch map of plate movement is referred to the study of Jurado-Rivera et al[12].圖3 匙指蝦科物種分歧時間估算Fig.3 Estimation of the divergence time of the species in Atyidae

3.2 匙指蝦科物種分歧演化

基于系統(tǒng)進(jìn)化樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)可知，匙指蝦科物種被分為兩大支系，TCP為一個支系，Atyinae類群為另一支系。在TCP支系中，來自澳大利亞的物種Paratyaaustraliensis在石炭紀(jì)中期到二疊紀(jì)晚期時段就以分化形成(圖3，節(jié)點B)，比岡瓦大陸斷裂的時間至少早100 Mya，說明該物種的形成與岡瓦大陸的斷裂毫無聯(lián)系，由此推測，該物種可能起源于南太平洋或隨著洋流擴(kuò)散到澳大利亞[20]。古老的岡瓦大陸斷裂與特提斯海封閉導(dǎo)致一些同類群生物隔離和高度分散分布。來自Typhlatyinae亞科的洞穴蝦分布于東太平洋、加勒比海、大西洋、地中海、馬達(dá)加斯加和澳大利亞附近島嶼(圖1)，這類物種從未在開闊的海洋棲息地被報道，大多數(shù)物種棲息在島嶼或狹窄的海岸[12]。這種棲息環(huán)境導(dǎo)致這些物種具有較強(qiáng)的地域性，地理板塊運動可能是導(dǎo)致這些物種分散的最好媒介。在Typhlatyinae亞科中，Typhlatyagalapagensis棲息于加拉帕戈斯群島且在侏羅紀(jì)早期就以分化形成(圖3，節(jié)點E)，加拉帕戈斯群島獨特的地理位置及Typhlatyagalapagensis適應(yīng)洞穴棲息的特點，可能會導(dǎo)致該物種的入侵能力極為有限。由此推測，加拉帕戈斯群島可能在侏羅紀(jì)時期就已存在，但這種推測仍需進(jìn)一步驗證?；贚eprieur等[21]的研究可知，從白堊紀(jì)時代開始，岡瓦大陸開始出現(xiàn)斷裂，特提斯海域面積縮小，而岡瓦大陸的斷裂可能是導(dǎo)致Typhlatyinae中棲息于岡瓦大陸沿岸的洞穴蝦出現(xiàn)分化的主要原因(圖3，節(jié)點H)。來自岡瓦大陸沿岸的洞穴蝦物種被分為兩個支系，其中，第一支系所含物種主要位于大西洋西部及位于非洲東部一個未描述的種(圖3，節(jié)點I),該類群中的Typhlatyailiffei、Typhlatyasp.JR2016聚為一支(圖3，節(jié)點L)，分化時間發(fā)生在87.47～125.08 Mya，這與Jurado-Rivera等[12]估算的分歧時間91～121 Mya基本相吻合；該類群的其余物種地理分布相對較集中且聚為一支(圖1，圖3，節(jié)點M)。另一支系所含物種主要位于地中海西部、澳大利亞西部、馬達(dá)加斯加和加勒比海(圖1)，該類群中位于加勒比海的Typhlatyamonae和位于地中海的Typhlatyaarfeae、Typhlatyamiravetensis聚為一支(圖3，節(jié)點K)，分歧時間發(fā)生在91.12～124.14 Mya，這與南美洲和非洲被大西洋分隔的時間基本相吻合[21]；該類群中位于馬達(dá)加斯加的Typhlopatsapauliani與位于澳大利亞西部的Stygiocaris物種聚為一支，分歧時間發(fā)生在76.06～108.53 Mya，但印度板塊與南極洲分裂的時間約為120 Mya[21]，所以岡瓦大陸的斷裂時間不能解釋該分支的分歧時間，但有研究推測，Stygiocaris物種的祖先生活在古特提斯海沿海棲息地，隨后被板塊的運動分隔開[22]。所以，任何一個物種的進(jìn)化不可能符合一種單一的構(gòu)想，它需要更加復(fù)雜的混合模型來反映。

來自Atyinae亞科的物種主要分布在太平洋南部和西北部(圖1)。該分支中所含物種均為淡水蝦，其中，米蝦屬Caridina幼蟲的發(fā)育需要高鹽度水體，其幼蟲孵化后進(jìn)入浮游期，被動漂流在海洋中，蛻變后又遷徙到淡水棲息地[23]。本研究中現(xiàn)有的4種米蝦屬Caridina物種中，Caridinamultidentata在二疊紀(jì)早期到侏羅紀(jì)早期時段分化形成(圖3，節(jié)點D)，為獨立一個分支，該物種以其獨有的形態(tài)適應(yīng)在湍急的水流中攀附棲息[23]，說明該物種隨洋流擴(kuò)散的能力較強(qiáng)，其余C.indistincta、C.gracilipes和C.cf.niloticaHMG-216 3種米蝦在三疊紀(jì)早期到白堊紀(jì)早期時段分化形成，同期分化形成的還有新米蝦屬Neocaridina(圖3，節(jié)點G)，Caridina3種米蝦均適應(yīng)于水流流速較低的植被下棲息[23-24]，說明它們隨洋流擴(kuò)散的能力較弱。

4 結(jié)論

1)匙指蝦科物種線粒體基因的排列順序相同，nd5和nd4基因可作為匙指蝦科理想的分子標(biāo)記，用于分析不同群體間的生物多樣性。

2)基于NJ和BI方法構(gòu)建的24種匙指蝦科物種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系完全一致,基于ML方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中個別物種間的分支關(guān)系存在差異，其中，Atyinae亞科為單系群，Typhlatyinae和Caridellinae亞科均為非單系群。

3)根據(jù)分子鐘估算結(jié)果推測，Atyinae物種最近的共同祖先可能出現(xiàn)在178.45～280.34 Mya，即二疊紀(jì)早期到侏羅紀(jì)時段，Paratyinae、Typhlatyinae和Caridellinae亞科物種最近的共同祖先可能出現(xiàn)在266.76～329.99 Mya，即石炭紀(jì)中期到二疊紀(jì)時段。