盧錫琴，張麗莉，黃世玉，王國棟，王藝?yán)?，和四?/p>

(集美大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東海海水健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361021)

雜色鮑Haliotisdiversicolor是中國南方一種特色養(yǎng)殖鮑類，其肉質(zhì)緊密、營養(yǎng)豐富，深受消費(fèi)者青睞。近年來，高密度集約化鮑苗種的生產(chǎn)和養(yǎng)殖，面臨著疾病頻繁發(fā)生的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，特別是在夏季，水溫升高和水體缺氧時(shí)鮑會產(chǎn)生強(qiáng)烈應(yīng)激，且水體中易滋生大量細(xì)菌，疾病頻發(fā)[1]，其中，副溶血弧菌Vibrioparahaemolyticus是鮑細(xì)菌性疾病的主要病原之一[2]。因此，雜色鮑的遺傳改良是其養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展的迫切需求，而研究雜色鮑在高溫應(yīng)激、缺氧應(yīng)激中的表達(dá)情況可為培養(yǎng)優(yōu)良性狀的鮑品種提供新的思路和相應(yīng)的數(shù)據(jù)支撐。

細(xì)胞凋亡(apoptosis)是一個(gè)基本而又復(fù)雜的生物學(xué)過程，在發(fā)育、內(nèi)穩(wěn)態(tài)和免疫中發(fā)揮殺死和清除不必要細(xì)胞的作用[3]。Caspase(cysteinyl aspartate specific proteinase)是在細(xì)胞凋亡的激活和執(zhí)行過程中發(fā)揮作用的主要酶類[4-5]。根據(jù)Caspase家族在凋亡通路的位置，Caspase成員可分為啟動型Caspase(Caspase-2、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-10)和執(zhí)行型Caspase(Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7)[6-7]。啟動型Caspase成員位于Caspase細(xì)胞凋亡傳導(dǎo)通路的上游，與輔助因子發(fā)生相互作用而自我活化，從而激活下游的Caspase[8]；執(zhí)行型Caspase能夠特異性地裂解底物，導(dǎo)致機(jī)體結(jié)構(gòu)和生化發(fā)生改變，引發(fā)細(xì)胞凋亡[9]。另外，Caspase家族還有一類炎癥介導(dǎo)因子(Caspase-1、Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11、Caspase-12)[10-11]，在細(xì)胞凋亡中起輔助作用[10]。Caspase-3是典型的Caspase家族成員，位于凋亡級聯(lián)反應(yīng)的下游，匯集整合凋亡刺激信號[4,12]，是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者，在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著重要的作用[4]。

目前，鮑的Caspase-3分子克隆尚未見報(bào)道，細(xì)胞凋亡在應(yīng)激條件方面的作用分析也鮮有報(bào)道。為此，本研究中克隆了雜色鮑caspase-3基因的全長cDNA序列，并分析了該基因在雜色鮑組織、早期發(fā)育和各種應(yīng)激下的表達(dá)，以期了解細(xì)胞凋亡在鮑應(yīng)激和發(fā)育過程的作用，為雜色鮑的發(fā)育和應(yīng)激條件提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用雜色鮑購于福建省廈門市大嶝島養(yǎng)殖場，體質(zhì)量為(7.50±2.00)g，體長為(4.10±0.50)cm，暫養(yǎng)期間溶解氧為6.0～6.5 mg/L，水溫為23～25 ℃，每天投喂新鮮海帶或石莼一次，每兩天換1/2新鮮海水。

1.2 方法

1.2.1 樣品的采集與處理 隨機(jī)選取8只健康雜色鮑進(jìn)行解剖，分別收集每只鮑的肝胰腺、血淋巴、腎、鰓和外套膜等組織，并分別放入凍存管中，經(jīng)液氮速凍后置于-80 ℃冰箱中保存，用于樣品總RNA提取。

選取性腺發(fā)育狀況良好的雜色鮑進(jìn)行催產(chǎn)和人工授精。催產(chǎn)和人工授精參考王國棟等[13]的方法。授精成功后使用解剖鏡實(shí)時(shí)觀察胚胎發(fā)育情況，并收集受精卵到稚鮑各個(gè)時(shí)期的樣品，經(jīng)液氮速凍后置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 應(yīng)激試驗(yàn)

1)細(xì)菌病原感染應(yīng)激試驗(yàn)。試驗(yàn)組和對照組各取8只雜色鮑，試驗(yàn)組使用微量注射器在雜色鮑腹足肌肉處注射濃度為1.1×108CFU/mL的副溶血弧菌菌液50 μL，對照組注射等體積的無菌生理鹽水。注射后分別取試驗(yàn)組和對照組0、3、6、12、24、48 h時(shí)的雜色鮑，解剖后取其血淋巴，經(jīng)液氮速凍后，置于-80 ℃冰箱中保存，用于總RNA提取。

2)高溫應(yīng)激試驗(yàn)。根據(jù)本課題組前期雜色鮑高溫應(yīng)激的研究結(jié)果，確定高溫應(yīng)激溫度為31 ℃。應(yīng)激處理自25 ℃開始，以1 ℃/h升溫至28 ℃時(shí)作為第1時(shí)相(0 h)取樣點(diǎn)，至31 ℃時(shí)作為第2時(shí)相(3 h)取樣點(diǎn)；此后維持水溫不變，以6、24、96、192 h時(shí)分別作為第3、4、5、6時(shí)相點(diǎn)。以25 ℃作為對照組，取樣時(shí)間點(diǎn)與高溫應(yīng)激試驗(yàn)組相同。高溫應(yīng)激試驗(yàn)組及對照組分別取8只健康雜色鮑的鰓、血淋巴和肝胰腺于液氮中速凍后，置于-80 ℃冰箱中保存，用于總RNA提取。

3)缺氧應(yīng)激試驗(yàn)。缺氧應(yīng)激試驗(yàn)參考張鑫等[14]的方法，設(shè)定2 mg/L的溶氧量為本次試驗(yàn)的缺氧條件?？諝馄貧?5.5 mg/L)為對照組的溶氧量。在4、24、96、192 h各取試驗(yàn)組和對照組8只鮑魚的血淋巴和鰓，經(jīng)液氮速凍后，置于-80 ℃冰箱中保存，用于總RNA提取。

1.2.3 總RNA的提取及檢測 取20 mg凍存的樣品組織加入0.5 mL Trizol，置于全自動樣品快速研磨儀(JXFSTPRP-48)冰浴勻漿后，按照Trizol抽提試劑盒說明書進(jìn)行總RNA的提取。提取完成后取3 μL 總RNA進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測，取1 μL用微量紫外分光光度計(jì)測定RNA濃度。

1.2.4caspase-3基因片段的克隆和序列分析 根據(jù)雜色鮑轉(zhuǎn)錄組中的caspase-3部分核酸序列，用Primer 5軟件設(shè)計(jì)RACE引物來擴(kuò)增此基因的全長cDNA序列，并采用NCBI中的ORF finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)驗(yàn)證開放閱讀框(ORF)的正確性。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、連接、轉(zhuǎn)化后測序，CBI vector screen在線(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/VecScreen/VecScreen.html)去除載體序列，采用bl2seq進(jìn)行比對拼接。利用BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行序列同源性比對分析。采用ExPASY分析工具(http://www.expasy.org/tools/pi_tool.html)預(yù)測蛋白的等電點(diǎn)和分子量，利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)在線預(yù)測蛋白的功能結(jié)構(gòu)域。采用ClustalX2.1軟件進(jìn)行序列多重比較，利用MAGE 7.0軟件(Neighbor-joining法)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.5 定量PCR反應(yīng)體系及條件 總RNA經(jīng)隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄后作為定量PCR模板。采用羅氏LightCycler480 Real Time PCR System進(jìn)行定量PCR。

定量PCR反應(yīng)體系(共20 μL)：SYBR Green Realtime PCR Master Mix 9 μL(購自 Promega公司GoTaq qPCR Master Mix，A6001)，10 μmol/L正、反向引物各0.5 μL，cDNA 模板10 μL。定量PCR體系反應(yīng)程序：95 ℃下預(yù)變性2 min；95 ℃下變性15 s，60 ℃下退火 1 min，72 ℃下延伸30 s，進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)。選擇β-actin為內(nèi)參基因(將內(nèi)參基因歸一化)，具體引物信息見表1。

表1 試驗(yàn)用引物和序列Tab.1 Primers and sequence information in the experiment

1.3 數(shù)據(jù)處理

由LightCycler480 Real Time PCR System儀器測出Ct值，采用2-△△Ct法計(jì)算各樣品的基因表達(dá)量，以缺氧應(yīng)激4 h的第一個(gè)生物學(xué)重復(fù)組的表達(dá)量為基值,計(jì)算各樣品的相對表達(dá)量。待測基因的表達(dá)量用8個(gè)生物學(xué)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±S.E.)表示。采用SPSS 22.0軟件對雜色鮑不同組織和發(fā)育階段的基因表達(dá)量進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，采用Duncan法進(jìn)行組間多重比較；對雜色鮑高溫應(yīng)激、缺氧應(yīng)激的表達(dá)量進(jìn)行單樣本T檢驗(yàn)(Student’sTtest)分析。顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜色鮑caspase-3基因的克隆和序列分析

雜色鮑caspase-3基因cDNA全長為1 192 bp，3′UTR為298 bp，5′UTR為135 bp，ORF為759 bp，編碼252個(gè)氨基酸。預(yù)測其編碼的蛋白相對分子質(zhì)量為28 480，等電點(diǎn)為6.08，含有一個(gè)完整的CASc結(jié)構(gòu)域；9～130 aa為半胱氨酸蛋白家族大亞基(P20)活性位點(diǎn)，160～252 aa為小亞基(P10)活性位點(diǎn)，116～127 aa為半胱氨酸CYS活性位點(diǎn)，72～86 aa為組氨酸HIS信號(圖1)。

*為終止子；短虛劃線為P20活性位點(diǎn)(9～130 aa)；實(shí)下劃線為P10活性位點(diǎn)(160～252 aa)；虛線方框?yàn)镠IS信號(72～86 aa)，實(shí)線方框?yàn)镃YS活性位點(diǎn)(116～127 aa)。* is terminator;the short dashed lines indicate the P20 active site (9-130 aa);The active site of P10 (160-252 aa) is shown in solid underline;HIS signal (72-86 aa) is shown in the dashed box,and CYS active site(116-127 aa) is shown in the box.圖1 雜色鮑caspase-3基因的核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide sequence and the deduced amino acid sequences of caspase-3 gene in variously colored abalone Haliotis diversicolor

2.2 Caspase-3氨基酸序列的同源性分析

采用ClustalX 2.1軟件和MEGA7 軟件對氨基酸序列進(jìn)行多重比對分析，比對結(jié)果顯示，雜色鮑Caspase-3有一個(gè)高度保守的大亞基(P20)和一個(gè)小亞基(P10)，保守基序HIS信號(HKDTDCFVCVILTHG)和CYS活性位點(diǎn)(QACRG)位于P20上。所有序列均在相同位置含有保守的半胱氨酸殘基。經(jīng)BLAST比對顯示，雜色鮑Caspase-3與厚殼貽貝MytiluscoruscusCaspase-7的氨基酸序列一致性最高(48.62%)，與高等脊椎動物人HomosapiensCaspase-3、馬EquuscaballusCaspase-3、山羊CaprahircusCaspase-7的氨基酸序列一致性為44.44%～45.42%，與軟體動物美洲牡蠣CrassostreavirginicCaspase-3、長牡蠣CrassostreagigasCaspase-7的氨基酸序列一致性分別為44.09%、45.67%(圖2)。Caspase-3氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，雜色鮑Caspase-3氨基酸序列與長牡蠣、厚殼貽貝、加州海兔Aplysiacalifornica等軟體動物聚成一大支，與斑馬魚Daniorerio、褐家鼠Rattusnorvegicus和人等脊椎動物聚成另一大支(圖3)。

虛線方框表示保守基序 HIS 信號(HKDTDCFVCVILTHG)，實(shí)線方框表示 CYS 活性位點(diǎn)(QACRG)。表示CASc蛋白水解位點(diǎn)，★表示CASc的二聚體作用位點(diǎn)；▲表示caspase-3高度保守的半胱氨酸。The conservative motif HIS signal(HKDTDCFVCVILTHG)is shown in the dotted box,and the active sites of CYS(QACRG)are shown in the solid boxes. indicates the site of CASc protein hydrolysis,★ indicates the dimer action site of CASc;▲ indicates caspase-3 highly conserved cysteine.圖2 雜色鮑與其他物種Caspase-3氨基酸的多重序列比對Fig.2 Multiple alignment of amino acids sequence of Caspase-3 between variously colored abalone Haliotis diversicolor and other species

圖3 雜色鮑Caspase-3氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of Caspase-3 amino acid sequences in variously colored abalone Haliotis diversicolor

2.3 雜色鮑caspase-3在早期發(fā)育階段的表達(dá)

從圖4可見：在雜色鮑早期發(fā)育過程中，從受精卵時(shí)期開始到稚鮑時(shí)期均有檢測到caspase-3基因的表達(dá)，其中，在雜色鮑受精卵時(shí)期和2細(xì)胞期的表達(dá)量最高；4細(xì)胞期、桑椹胚期、囊胚期、原腸胚期和擔(dān)輪幼蟲期的表達(dá)量顯著低于受精卵時(shí)期和2細(xì)胞期(P<0.05)，但顯著高于面盤幼蟲早期與晚期、匍匐幼蟲早期和稚鮑期；面盤幼蟲早期caspase-3基因表達(dá)量為早期發(fā)育時(shí)期的最低表達(dá)量，到匍匐期時(shí)caspase-3基因表達(dá)量開始回升，到稚鮑時(shí)期表達(dá)量趨于穩(wěn)定。

1—受精卵期;2—2細(xì)胞期;3—4細(xì)胞期;4—桑椹胚期;5—囊胚期;6—原腸胚期;7—擔(dān)輪幼蟲早期;8—擔(dān)輪幼蟲晚期;9—面盤幼蟲早期;10—面盤幼蟲晚期;11—匍匐幼蟲早期;12—稚鮑。標(biāo)有不同字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)，下同。1—fertilized egg stage;2—2-cell stage;3—4-cell stage;4—morula stage;5—blastula stage;6—gastrula stage;7—early trochophore stage;8—late trochophore stage;9—early veliger stage;10—late veliger stage;11—creeping larva stage;12—juvenile abalone stage.The means with different letters are significant differences in different groups at the 0.05 probability level,and the means with the same letter are not significant differences,et sequentia.圖4 不同發(fā)育階段caspase-3基因的絕對表達(dá)量Fig.4 Absolute expression levels of caspase-3 at different development stages

2.4 caspase-3基因在雜色鮑組織中的表達(dá)

從圖5可見：caspase-3基因在雜色鮑各組織中均有表達(dá)，其中，肝胰腺組織中caspase-3的表達(dá)量最低，但與鰓、消化道、外套膜、腎和黏液腺組織中的表達(dá)量無顯著性差異(P>0.05)；血淋巴中caspase-3基因的表達(dá)量最高且顯著高于其他組織(P<0.05)。

1—肝胰腺；2—鰓；3—外套膜；4—腎；5—消化道；6—黏液腺；7—血淋巴。1—hepatopancreas;2—gill;3—mantle;4—kidney;5—digestive tract;6—mucous gland;7—hemolymph.圖5 不同組織中caspase-3基因的絕對表達(dá)量Fig.5 Absolute expression levels of caspase-3 gene in different tissues

2.5 副溶血弧菌感染后caspase-3基因的表達(dá)變化

從圖6可見：在感染0～6 h時(shí)，試驗(yàn)組與對照組caspase-3 mRNA相對表達(dá)量無顯著性差異(P>0.05)；12 h時(shí)相對表達(dá)量達(dá)到最大值，且顯著高于對照組(P<0.05)；24～48 h時(shí)表達(dá)量又逐漸恢復(fù)到對照水平(P>0.05)。

*表示與對照組有顯著性差異(P<0.05)，下同。* means significant difference compared with the control(P<0.05)，et sequentia.圖6 副溶血弧菌感染后caspase-3基因在血淋巴中的表達(dá)變化Fig.6 Change in caspase-3 gene expression in hemolymph injected with Vibrio parahaemolyticus

2.6 高溫應(yīng)激處理后caspase-3基因的表達(dá)變化

從圖7可見：經(jīng)高溫應(yīng)激處理后，鰓中的caspase-3 mRNA相對表達(dá)量在0、3 h時(shí)顯著高于對照組(P<0.05)，在6 h時(shí)表達(dá)量降到最低，在24 h時(shí)表達(dá)量又開始升高，其中，24、96 h時(shí)表達(dá)量與對照組無顯著性差異(P>0.05)，在192 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，且顯著高于對照組(P<0.05)；血淋巴中的caspase-3基因相對表達(dá)量在0～6 h時(shí)無顯著性差異(P>0.05)，24 h時(shí)表達(dá)量上調(diào)并達(dá)到最高水平，且顯著高于對照組 (P<0.05)，96、192 h時(shí)其表達(dá)量與對照組無顯著性差異(P>0.05)；肝胰腺中的caspase-3基因相對表達(dá)量在高溫應(yīng)激0～6 h時(shí)無顯著性差異(P>0.05)，24 h時(shí)試驗(yàn)組表達(dá)量上升到最大值，且顯著高于對照組(P<0.05)，96、192 h時(shí)表達(dá)量恢復(fù)至與對照組無顯著性差異的水平(P>0.05)。

圖7 高溫應(yīng)激后caspase-3基因在鰓、血淋巴和肝胰腺中的表達(dá)變化Fig.7 Change in caspase-3 gene expression in gills，hemolymph and hepatopancreas exposed to high temperature

2.7 缺氧應(yīng)激處理后caspase-3基因的表達(dá)變化

從圖8可見：經(jīng)缺氧處理后，在鰓組織中的caspase-3 mRNA在96 h時(shí)表達(dá)水平較對照組顯著上調(diào)(P<0.05)，在其他時(shí)間點(diǎn)缺氧試驗(yàn)組和對照組間無顯著性差異(P>0.05)；血淋巴中的caspase-3基因在4 h時(shí)就出現(xiàn)顯著性上調(diào)(P<0.05)，在24～96 h時(shí)試驗(yàn)組與對照組表達(dá)量均無顯著性差異(P>0.05)。

圖8 缺氧應(yīng)激后caspase-3基因在鰓和血淋巴中的表達(dá)變化Fig.8 Change in caspase-3 gene expression in gills and hemolymph exposed to hypoxia

3 討論

3.1 雜色鮑caspase-3基因序列分析

本研究中，雜色鮑caspase-3基因cDNA全長為1 192 bp，編碼252個(gè)氨基酸殘基Pro-Caspase蛋白，含有一個(gè)完整的CASc結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)為Caspase家族特有。Pro-Caspase可自體水解為P20和P10兩個(gè)亞基，結(jié)合形成異二聚體，異二聚體隨后形成具有酶活性的四聚體[15]。P20和P10在不同物種的Caspase-3中非常保守，已報(bào)道的幾種水產(chǎn)動物caspase-3基因的克隆和鑒定也表明了這一點(diǎn)[16-18]。雜色鮑的Caspase-3也具有保守的P20和P10序列，通過序列比對發(fā)現(xiàn),雜色鮑的Caspase-3與幾種模式生物的Caspase-3同源，含有Caspase-3的所有保守氨基酸殘基，具有參與細(xì)胞凋亡的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[19]。

3.2 雜色鮑早期發(fā)育階段caspase-3 mRNA的表達(dá)差異

本研究表明，在胚胎發(fā)育早期，caspase-3基因表達(dá)量在受精卵期和2細(xì)胞期無顯著差異，但顯著高于其他時(shí)期，4細(xì)胞期時(shí)表達(dá)量顯著下降，這表明caspase-3基因具有顯著的母系效應(yīng)，胚胎早期階段的mRNA主要來自母體在卵子中的積累。面盤幼蟲由擔(dān)輪幼蟲發(fā)育而來，需要新形成面盤、貝殼和面盤收縮肌等新結(jié)構(gòu)[20]，以細(xì)胞分化和增殖為主，細(xì)胞凋亡較少出現(xiàn)，因此，該時(shí)期的caspase-3基因表達(dá)量顯著下降。晚期面盤幼蟲發(fā)育至早期匍匐幼蟲時(shí)，面盤等組織開始退化崩解，細(xì)胞凋亡重新活躍。雖然caspase-3基因表達(dá)量有上升趨勢，但尚未達(dá)到顯著水平。早期匍匐幼蟲會形成足、鰓等新組織，需要細(xì)胞分化和增殖，故細(xì)胞凋亡的強(qiáng)度和水平可能會被適當(dāng)控制。雜色鮑caspase-3基因表達(dá)量在早期發(fā)育的關(guān)鍵階段均有顯著性變化，表明該基因參與了雜色鮑的早期發(fā)育。與此類似，雜色鮑的另一種caspase基因——CARD的表達(dá)與發(fā)育階段也有較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)[21]，這表明caspase基因在調(diào)節(jié)早期發(fā)育過程具有重要作用。

3.3 雜色鮑caspase-3 mRNA的組織表達(dá)差異

本研究表明，caspase-3基因在雜色鮑肝胰腺、血淋巴、腎、鰓、外套膜等組織中均有表達(dá)，但各組織中的表達(dá)量各異。這與厚殼貽貝中的caspase-8[22]、皺紋盤鮑Haliotisdiscushannai中的caspase-8[23]和凡納濱對蝦Litopenaeusvannamei中的caspase-3[24]的表達(dá)模式類似。水生無脊椎動物血淋巴是機(jī)體主要的免疫組織，在免疫防御屏障中發(fā)揮了重要作用[25]，能夠有效抵御外來病原的入侵[26]。細(xì)胞凋亡是貝類細(xì)胞免疫的主要方式之一，能夠防止病原體的擴(kuò)散，降低炎癥反應(yīng)，修復(fù)組織損傷[27]。本研究中，雜色鮑caspase-3基因在血淋巴中的表達(dá)水平顯著高于其他組織，表明其參與了雜色鮑免疫應(yīng)答過程。

3.4 副溶血弧菌感染、高溫應(yīng)激和缺氧應(yīng)激處理后雜色鮑caspase-3 mRNA的表達(dá)差異

雜色鮑的病原識別和免疫信號傳遞的基因，通常在弧菌感染3 h后上調(diào)表達(dá)[28-29]，而免疫效應(yīng)基因在感染后12 h上調(diào)表達(dá)[30-31]。本研究中，經(jīng)副溶血弧菌感染后12 h，caspase-3基因表達(dá)量顯著上調(diào)。這表明，caspase-3受免疫上游基因的調(diào)控，其響應(yīng)時(shí)間晚于病原識別和信號傳遞過程，可能主要參與了病原清除過程。對蝦感染病原后其caspase-3基因表達(dá)量同樣在12 h時(shí)顯著上調(diào)[32]，與雜色鮑的表達(dá)模式類似。

本研究中，經(jīng)高溫處理后caspase-3基因在雜色鮑血淋巴、肝胰腺和鰓中的表達(dá)規(guī)律類似，在某些時(shí)間點(diǎn)試驗(yàn)組表達(dá)量顯著高于對照組，與團(tuán)頭魴Megalobramaamblycephala中的casapase-3[33]、caspase-9[34]和日本鰻鱺Anguillajaponica中的caspase-6[35]表達(dá)模式相似。大部分貝類的運(yùn)動能力微弱，難以快速運(yùn)動躲避不良環(huán)境，且經(jīng)常受到高溫或者缺氧的脅迫，導(dǎo)致caspase基因的表達(dá)上調(diào)[22,36]。本研究中，鰓直接接觸外界水體，水溫上升后直接刺激鰓組織，導(dǎo)致鰓細(xì)胞損傷，誘導(dǎo)caspase-3基因的上調(diào)，啟動細(xì)胞凋亡清除受損細(xì)胞。所以在水溫快速上升階段(0～3 h)，鰓中的caspase-3基因顯著上調(diào)表達(dá)。而當(dāng)水溫穩(wěn)定在高溫初期，可能是損傷細(xì)胞暫時(shí)被清除，所以caspase-3基因的表達(dá)量與對照組無顯著性差異；但長時(shí)間高溫處理(高溫應(yīng)激192 h時(shí))會導(dǎo)致更嚴(yán)重的損傷，因此，caspase-3基因再次顯著上調(diào)。本研究中，機(jī)體內(nèi)部組織血淋巴和肝胰腺中的caspase-3基因表達(dá)模式類似，均在24 h時(shí)顯著上調(diào)，晚于鰓的上調(diào)表達(dá)時(shí)間，且在0、3、6、96、192 h時(shí)也未再次上調(diào)表達(dá)。這表明，血淋巴和肝胰腺對溫度變化刺激的敏感程度低于鰓。本試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)高溫處理24 h時(shí)，雜色鮑活力表現(xiàn)變?nèi)酰@或許可以從側(cè)面反映出機(jī)體需要caspase-3基因的參與和上調(diào)以穩(wěn)定其生理所需。

本研究表明，雜色鮑缺氧時(shí)，caspase-3基因在血淋巴和鰓的表達(dá)有所差異，血淋巴在處理4 h時(shí)caspase-3基因表達(dá)量顯著上升，而鰓組織在96 h時(shí)才開始顯著上升。機(jī)體不同部位的氧分壓不同，通常呼吸器官、血液和機(jī)體內(nèi)部各組織等的氧分壓依次降低[37]。雜色鮑鰓與外界水體直接接觸，其氧分壓接近環(huán)境的溶氧量。本試驗(yàn)中的低氧應(yīng)激濃度為2 mg/L，高于正常組織的氧分壓[38]。因此，即使處于低溶氧環(huán)境下的鰓也能獲得較充足的氧氣，短時(shí)間內(nèi)不會因缺氧導(dǎo)致鰓組織損傷，不需要啟動細(xì)胞凋亡程序。血淋巴作為氧氣運(yùn)輸?shù)慕M織，其氧分壓低于水體環(huán)境；當(dāng)機(jī)體處于缺氧環(huán)境時(shí)，血淋巴氧分壓下降產(chǎn)生缺氧應(yīng)激，所以在較早的時(shí)間里就需要caspase-3基因上調(diào)以維持機(jī)體穩(wěn)定。

4 結(jié)論

1) 本研究成功克隆出雜色鮑caspase-3基因，預(yù)測Ccaspase-3蛋白有一個(gè)完整的CASc結(jié)構(gòu)域。

2) 雜色鮑早期發(fā)育過程中，從受精卵時(shí)期開始到稚鮑時(shí)期均檢測到caspase-3基因的表達(dá)，且caspase-3基因的表達(dá)量在早期發(fā)育的關(guān)鍵階段均有顯著性變化，這表明其參與了雜色鮑的早期發(fā)育。

3) 在健康雜色鮑各個(gè)組織中均能檢測到caspase-3基因的表達(dá)量，其中，在血淋巴中的表達(dá)量顯著高于其他組織，這表明其參與了雜色鮑免疫應(yīng)答過程。

4) 副溶血弧菌感染、高溫應(yīng)激處理和缺氧應(yīng)激處理后caspase-3 mRNA表達(dá)量在雜色鮑血淋巴、肝胰腺和鰓組織中均有顯著性上調(diào)，暗示該基因在雜色鮑應(yīng)激中發(fā)揮了重要作用。