李金澤，湯菊芬，黃瑜，簡(jiǎn)紀(jì)常，施鋼，蔡佳，*

(1.廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，廣東省水產(chǎn)動(dòng)物病害防控與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病害控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南方海洋科學(xué)與工程廣東省實(shí)驗(yàn)室(湛江)，廣東 湛江 524088；2.廣西科學(xué)院廣西北部灣海洋研究中心，廣西海洋天然產(chǎn)物與組合生物合成化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530007)

斜帶石斑魚Epinepheluscoioides屬于鱸形目，是中國(guó)南方重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚類之一[1]。近年來(lái)，隨著其養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大和增養(yǎng)殖密度的提高，斜帶石斑魚在養(yǎng)殖過(guò)程中頻繁發(fā)生寄生蟲疾病、細(xì)菌性疾病和病毒性疾病。其中，寄生蟲疾病主要為瓣體蟲病和小瓜蟲病，細(xì)菌性疾病主要為爛尾病和潰爛病，病毒性疾病主要為虹彩病毒病和病毒性神經(jīng)壞死病[2]，這些疾病嚴(yán)重影響了石斑魚產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，開展石斑魚抗感染免疫反應(yīng)研究，有助于挖掘該過(guò)程中的關(guān)鍵因子或信號(hào)通路，并為開發(fā)新型疾病防控技術(shù)提供理論參考。

T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白-4(T-cell immunoglobulin and mucin-domain-containing molecule 4,TIM-4)家族是一類Ⅰ型跨膜糖蛋白，最早在小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，有TIM-1、TIM-2、TIM-3、TIM-4 4個(gè)成員，位于11號(hào)染色體上相鄰位置，而人類中只鑒定到3個(gè)TIM家族基因，分別是TIM-1、TIM-3、TIM-4，位于第5號(hào)染色體上[3]。TIM家族成員具有特征性的Ig(immunoglobulin)結(jié)構(gòu)域，是胞外的主要功能結(jié)構(gòu)域，其含有的4～6個(gè)保守半胱氨酸在折疊過(guò)程中可形成二硫鍵用以維持Ig結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，還能介導(dǎo)TIM蛋白與配體的識(shí)別和結(jié)合[4]。TIM蛋白最初被定義為A型肝炎病毒受體和一種腎臟損傷分子，是調(diào)節(jié)腎臟缺血的上皮細(xì)胞分子[5]，隨后的研究發(fā)現(xiàn)，TIM蛋白在細(xì)胞增殖、凋亡、自噬、遷移、組織再生和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用[6-8]，在病毒感染、過(guò)敏反應(yīng)、自身免疫和腫瘤免疫等病理過(guò)程中維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[9]。其中，TIM-4基因通過(guò)結(jié)合磷脂酰絲氨酸受體的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)控制細(xì)胞凋亡[10]，并作為配體與TIM-1基因結(jié)合，通過(guò)TIM-1～TIM-4途徑共刺激T細(xì)胞增殖，參與體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)[11]。然而，關(guān)于斜帶石斑魚TIM-4的免疫作用目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究中，通過(guò)擴(kuò)增獲得斜帶石斑魚TIM-4基因的蛋白編碼區(qū)，分析其序列特征，檢測(cè)該基因在健康魚體中的組織分布，以及經(jīng)LPS和Poly I:C刺激后的表達(dá)變化，并構(gòu)建TIM-4原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(BL21)中進(jìn)行誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，以期為進(jìn)一步研究該基因在斜帶石斑魚免疫調(diào)節(jié)中的功能提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用斜帶石斑魚(40～50 g)采集于廣東省湛江市某水產(chǎn)批發(fā)市場(chǎng)。

載體與菌株：克隆載體pMDTM19T 質(zhì)粒購(gòu)于TaKaRa公司；pGEX-4T-1載體及大腸桿菌DH5α、BL21由廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

主要試劑：Ex Taq DNA聚合酶、限制性核酸內(nèi)切酶EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ及T4DNA連接酶等購(gòu)自TaKaRa公司(日本)；質(zhì)粒提取試劑盒及膠回收試劑盒購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；TransZol Up Plus RNA Kit和相關(guān)反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒(TransStart Green qPCR Super Mix)等購(gòu)自北京全式金公司；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購(gòu)自西安晶彩生物科技有限公司；10×PBS、1×PBS購(gòu)自碧云天公司；胰蛋白胨、無(wú)水乙醇等均為分析純；PCR引物及序列測(cè)定均由廣州生工生物技術(shù)有限公司完成。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)所用的斜帶石斑魚脾臟細(xì)胞(GS 細(xì)胞)由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)秦啟偉教授惠贈(zèng)。LPS購(gòu)于碧云天公司，Poly I:C購(gòu)于Apexbio公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)合成 在本實(shí)驗(yàn)室斜帶石斑魚轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中[12]篩選出斜帶石斑魚TIM-4基因的蛋白編碼區(qū)序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)正反向引物及熒光定量引物(表1)。

表1 本研究所用引物Tab.1 The primers used in this study

1.2.2 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 根據(jù)TransZol Up Plus RNA Kit說(shuō)明書方法進(jìn)行斜帶石斑魚總RNA的提取。將斜帶石斑魚的脾臟、皮膚、心臟、頭腎、小腸、鰓、腎臟、大腦、肌肉、胃組織置于2 mL無(wú)RNA酶的離心管中，加入1 mL的Trizol Up及1個(gè)鋼珠，使用研磨器研磨3 min；將200 μL氯仿加入組織勻漿中，充分振蕩后將混合液于4 ℃下以12 000 r/min離心15 min，將分層后的上層水相轉(zhuǎn)移至1.5 mL無(wú)RNA酶的離心管中，加入等體積提前預(yù)冷的異丙醇，室溫下靜置10 min；離心后棄上清液，加入500 μL體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇，溫和振蕩后以8 000 r/min離心5 min，棄上清液，室溫晾干10 min，而后加入無(wú)RNA酶的水溶解RNA樣品。取1 μL的RNA使用超微量生物檢測(cè)儀檢測(cè)其濃度，按照全式金公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書，分別向其中加入Anchored Oligo (dT)181 μL、Easy Script RT/RI Enzynle Mix 1 μL、gDNA Remove 1 μL、2×Es Reaction Mix 10 μL、RNase-free water 2 μL和RNA 5 μL，樣品經(jīng)過(guò)混合，于42 ℃ 下反應(yīng)15 min，85 ℃ 下作用5 s，進(jìn)行cDNA合成，產(chǎn)物于-20 ℃下保存待用。

1.2.3TIM-4基因的蛋白編碼區(qū)擴(kuò)增 按照Ex Taq 酶說(shuō)明書推薦體系,擴(kuò)增TIM-4基因的蛋白編碼區(qū)。PCR 反應(yīng)體系(20 μL)：上、下游引物(TIM-4-S和TIM-4-A，10 μmol/L)各1 μL，cDNA模板1 μL，Ex Taq 10 μL，ddH2O 7 μL。PCR 反應(yīng)程序：94 ℃下預(yù)變性5 min；94 ℃下循環(huán)變性30 s，55 ℃下退火復(fù)性30 s，72 ℃下延伸90 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后在72 ℃下再延伸10 min，于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4TIM-4基因的生物信息學(xué)分析 在生物信息分析網(wǎng)站(NCBI)進(jìn)行基因序列比對(duì)及同源性分析，使用DNAMAN 5.0軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，比對(duì)后的序列利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.5TIM-4基因的組織表達(dá) 以β-actin作為內(nèi)參基因，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)平行復(fù)孔，采用qPCR法檢測(cè)TIM-4基因在斜帶石斑魚脾臟、心臟、頭腎、鰓、腦、腎臟、胃、腸、肌肉和皮膚10個(gè)組織中的表達(dá)情況，采用2-△△Ct法計(jì)算基因表達(dá)量[13]，以脾臟表達(dá)量為參照，計(jì)算各組織的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 LPS和Poly I:C刺激后GS細(xì)胞中TIM-4基因的表達(dá)變化 將GS細(xì)胞接種至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞量約為1×105cells/孔，分別加入終質(zhì)量濃度為1 mg/mL的LPS和5 mg/mL的Poly I:C進(jìn)行刺激[14]，在感染0、4、8、12、24、48 h時(shí)收集GS細(xì)胞，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后用于qPCR。qPCR反應(yīng)體系(10 μL)：模板0.5 μL，上、下游引物(TIM-4-RT-S與TIM-4-RT-A)各1 μL，2×SYBR Green Mix(Roche) 5 μL，ddH2O 2.5 μL。每個(gè)樣品設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，反應(yīng)條件:95 ℃下預(yù)變性10 s；95 ℃下循環(huán)變性5 s，58 ℃下退火復(fù)性15 s，72 ℃下延伸20 s，共進(jìn)行34個(gè)循環(huán)。

1.2.7TIM-4基因原核表達(dá)載體構(gòu)建 根據(jù)已經(jīng)得到的TIM-4基因的蛋白編碼區(qū)設(shè)計(jì)含酶切位點(diǎn)的引物TIM-4-S(EcoR Ⅰ)和TIM-4-A(Xho Ⅰ)，用Ex Taq酶擴(kuò)增含酶切位點(diǎn)的基因片段連接到pMDTM19T載體，對(duì)測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆TIM-4-19T和pGEX-4T-1載體采用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ進(jìn)行雙酶切。酶切反應(yīng)體系(50 μL)：DNA 5 μL，10×QuickCut Buffer 5 μL，QuickCutTMEcoR Ⅰ 2 μL，QuickCutTMXho Ⅰ 2 μL，ddH2O 36 μL。反應(yīng)程序?yàn)?7 ℃下反應(yīng)15 min，于4 ℃下保存。

經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳后，回收相應(yīng)的目的條帶，將切膠回收的DNA片段分別與雙酶切的表達(dá)質(zhì)粒用T4DNA酶進(jìn)行連接。連接體系為TIM-4-19T質(zhì)粒DNA 6 μL、pGEX-4T-1質(zhì)粒DNA 2 μL、T4DNA連接酶1 μL、T4Ligaze Buffer 1 μL，連接過(guò)夜，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，利用氨芐西林篩選TIM-4-4T重組質(zhì)粒陽(yáng)性克隆，陽(yáng)性克隆經(jīng)PCR鑒定后送至廣州生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒命名為TIM-4-4T。

1.2.8 TIM-4重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化 將構(gòu)建好的TIM-4-4T重組質(zhì)粒導(dǎo)入到大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，參考梁振宇等[15]的方法，對(duì)TIM-4重組蛋白的表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，當(dāng)OD600 nm為0.4～0.6時(shí)開始誘導(dǎo)，溫度分別設(shè)置為37、28、16 ℃，IPTG濃度分別設(shè)置為1.0、0.8、0.6、0.4、0.2 mmol/L，搖床6 h后收集樣品，然后在4 ℃下以6 000 r/min離心30 min，再用5 mL的PBS吹勻沖洗，如此重復(fù)兩次。再向其中加入50 μL PBS吹勻，再加入10 μL Protein Loading Buffer吹勻，熱水煮沸5 min后以14 000 r/min 離心4 min，將樣品置于-20 ℃下保存。經(jīng)過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳后用考馬斯亮藍(lán)染色，用Gel-Pro Analyzer分析結(jié)果。

取重組質(zhì)粒菌液200 μL，加入30 mL含氨芐西林(Ampillin)抗性的LB培養(yǎng)液，在37 ℃、0.4 mmol/L IPTG條件下誘導(dǎo)6 h后，分別移入2個(gè)15 mL的離心管中，以15 000 r/min離心2 min,去掉上清液，分別用7 mL PBS吹勻潤(rùn)洗兩遍，之后再將其吹勻,置于冰水混合物中超聲破碎重組細(xì)菌。超聲程序設(shè)置為功率300 W、開5 s、關(guān)8 s，超聲破碎15 min至菌液清澈透亮即可。取破碎后的液體移至低溫離心機(jī)，離心30 min，取離心后的上清液50 μL加10 μL Protein Loading Buffer吹勻，于-20 ℃下保存，將沉淀用10 mL尿素吹勻浸泡過(guò)夜。經(jīng)過(guò)SDS-PAGE后用考馬斯亮藍(lán)染色，采用Gel-Pro Analyzer分析結(jié)果。

1.3 數(shù)據(jù)處理

基因表達(dá)量試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 21軟件進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan法進(jìn)行不同組織間基因表達(dá)量顯著性差異比較，用T檢驗(yàn)進(jìn)行不同時(shí)間點(diǎn)基因表達(dá)量顯著性差異比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 斜帶石斑魚TIM-4基因的蛋白編碼區(qū)擴(kuò)增及序列特征分析

利用PCR擴(kuò)增斜帶石斑魚TIM-4基因的蛋白編碼區(qū)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)，得到702 bp的目的條帶(圖1)，即基因的蛋白編碼區(qū)片段長(zhǎng)度為702 bp，可編碼234個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為25 100，理論等電點(diǎn)為5.41。利用SMART軟件預(yù)測(cè)該蛋白序列包含3個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，即V-Type(IGV)、BTK和PRY結(jié)構(gòu)域(圖2)。

2.2 TIM-4氨基酸序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析

采用DNAMAN軟件，將斜帶石斑魚TIM-4氨基酸與龍膽石斑魚E.lanceolatus、大黃魚Larimichthyscrocea、河鱸Percafluviatilis、泰國(guó)斗魚Bettasplendens、貝氏南極魚Trematomusbernacchii、人Homosapiens和小鼠MusmusculusTIM-4氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示，不同物種TIM-4氨基酸序列均含有Ig保守結(jié)構(gòu)域(圖2)。通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，斜帶石斑魚TIM-4氨基酸序列與魚類TIM-4氨基酸序列相似度較高，其中與龍膽石斑魚TIM-4氨基酸序列的一致性最高(85.66%)，而與人TIM-4氨基酸序列的一致性最低(17.10%)。

加粗部分為起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TGA)，灰色陰影部分為Ig結(jié)構(gòu)域。The bold part is the start codon (ATG) and the stop codon (TGA),and the underlined part is the Ig domain.圖1 斜帶石斑魚TIM-4基因的蛋白編碼區(qū)序列Fig.1 Sequence of protein coding region of TIM-4 gene in oblique grouper Epinephelus coioides

Ig保守結(jié)構(gòu)域用方框標(biāo)記；IGV、BTK、PRY功能結(jié)構(gòu)域用實(shí)線標(biāo)記。Conserved domain of Ig-type lectin is shown in the box;IGV,BTK and PRY functional domains are marked with solid lines.圖2 斜帶石斑魚與其他物種TIM-4氨基酸的多序列比對(duì)Fig.2 Multiple alignment of amino acid sequence of TIM-4 between oblique grouper Epinephelus coioides with other species

采用MEGA 7.0軟件構(gòu)建斜帶石斑魚與其他物種的TIM-4氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示，斜帶石斑魚TIM-4與龍膽石斑魚、大黃魚和泰國(guó)斗魚TIM-4聚為一支，且與龍膽石斑魚TIM-4的親緣關(guān)系最近(圖3)，這與氨基酸序列比對(duì)結(jié)果一致。

圖3 TIM-4氨基酸序列的進(jìn)化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of TIM-4 amino acid sequence

2.3 斜帶石斑魚TIM-4基因的組織表達(dá)

從圖4可見(jiàn)，TIM-4基因在斜帶石斑魚的脾臟、皮膚、心臟、頭腎、腸、鰓、腎臟、腦、肌肉、胃組織中均有表達(dá)，在胃中表達(dá)量最高(P<0.05)，其次是肌肉、腦和腎臟，在脾臟中表達(dá)量最低。

Sp—脾臟；Sk—皮膚；H—心臟；HK—頭腎；In—腸；G—鰓；K—腎臟；B—腦；M—肌肉；S—胃。標(biāo)有不同字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同字母者表示組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。Sp—spleen;Sk—skin;H—heart;HK—head kidney;In—intestinal;G—gill;K—kidney;B—brain;M—muscle;S—stomach.The means with different letters are significantly different in the groups at the 0.05 probability level,and the means with the same letter are not significant differences.圖4 TIM-4基因在不同組織中的表達(dá)量Fig.4 Expression level of TIM-4 gene in different tissues

2.4 LPS、Poly I:C刺激后脾臟細(xì)胞中TIM-4基因的表達(dá)變化

從圖5可見(jiàn)：經(jīng)LPS刺激后，TIM-4基因在GS細(xì)胞中的表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，在4 h時(shí)下降到最低值；而經(jīng)Poly I:C刺激后，TIM-4基因在GS細(xì)胞中的表達(dá)量顯著上升(P<0.05)，在4 h時(shí)達(dá)到最高。

*表示與0 h的表達(dá)量相比有顯著性差異(P<0.05)。*，significant differences compared to 0 h (P<0.05).圖5 LPS和Poly I:C刺激后脾臟細(xì)胞中TIM-4基因的表達(dá)變化Fig.5 Differential expression of TIM-4 gene in GS by LPS and Poly I:C stimulations

2.5 重組蛋白表達(dá)分析

取TIM-4-4T陽(yáng)性克隆分別于37、28、16 ℃下，以1.0、0.8、0.6、0.4、0.2 mmol/L IPTG的濃度分別進(jìn)行誘導(dǎo)，SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果顯示，在37 ℃、0.4 mmol/L IPTG條件下誘導(dǎo)6 h時(shí)的重組蛋白表達(dá)量最高(圖6)。

M—蛋白marker；1～5—1.0、0.8、0.6、0.4、0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)；6—未誘導(dǎo)。M—protein marker；1-5—recombinant bacteria induced by IPTG at a dose of 1.0,0.8,0.6,0.4 and 0.2 mmol/L；6—non-reduced by IPTG.圖6 TIM-4重組蛋白表達(dá)與條件優(yōu)化Fig.6 Optimal conditions for the expression of TIM-4 recombinant protein

對(duì)不同溫度和IPTG濃度誘導(dǎo)下重組蛋白的可溶性分析表明，在溫度37 ℃、IPTG 0.4 mmol/L的條件下誘導(dǎo)的重組蛋白表達(dá)量最大，經(jīng)超聲破碎后，在沉淀中出現(xiàn)明顯的蛋白條帶(圖7)，這表明TIM-4蛋白主要以包涵體形式表達(dá)。

M—蛋白marker；1—TIM-4-4T超聲裂解上清液；2—TIM-4-4T超聲裂解沉淀。M—protein marker；1—sonicated supernatant of TIM-4-4T；2—sonicated sediment of TIM-4-4T.圖7 TIM-4-4T重組菌裂解上清液和沉淀中的重組蛋白Fig.7 TIM-4 recombinant protein of supernatant and precipitation of the lysis from TIM-4-4T recombinant strain

3 討論

3.1 TIM-4蛋白序列特征分析

TIM-4是TIM家族中的重要成員之一[4]。研究表明，TIM與哺乳動(dòng)物的過(guò)敏性疾病和自身免疫性疾病相關(guān)[16-18]，但目前尚未見(jiàn)魚類TIM-4的報(bào)道。本研究中,擴(kuò)增了斜帶石斑魚TIM-4基因的蛋白編碼區(qū)，長(zhǎng)度為702 bp，可編碼234個(gè)氨基酸，與其他已報(bào)道的TIM-4蛋白相同，TIM-4氨基酸序列含有IGV、BTK和PRY 3個(gè)功能結(jié)構(gòu)域。已有研究表明，TIM-4的IGV結(jié)構(gòu)域參與調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體的激活及影響病毒的侵染[19-20]；BTK結(jié)構(gòu)域能通過(guò)與G蛋白亞基的相互作用介導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[21]；PRY結(jié)構(gòu)域在與胞內(nèi)模式識(shí)別受體(RIG-I和NOD2)的互相作用中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，從而調(diào)節(jié)宿主的先天免疫[22]。由此推測(cè)，斜帶石斑魚TIM-4在病原感染及免疫應(yīng)答過(guò)程中可能具有類似作用。

3.2 TIM-4基因的組織表達(dá)模式

本研究中，采用qPCR法分析了TIM-4基因在斜帶石斑魚各組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，TIM-4基因在所有檢測(cè)的組織中均有分布，在胃組織中表達(dá)量最高，其次是肌肉、腦、腎臟、鰓、腸等組織。已有研究表明，TIM-4基因是特定組織定位的巨噬細(xì)胞的標(biāo)記[23]，腸胃中巨噬細(xì)胞可與微生物群落共同調(diào)節(jié)平滑肌的運(yùn)動(dòng)，影響消化，因此，本研究中斜帶石斑魚TIM-4基因在胃中高表達(dá)，暗示其可能具有調(diào)節(jié)消化的功能。而肌肉中的巨噬細(xì)胞則與再生相關(guān)[24]，腦部的巨噬細(xì)胞則與抵御病原侵染相關(guān)[25]，因此，本研究中斜帶石斑魚TIM-4基因可能在生長(zhǎng)調(diào)控、抗病原感染及免疫應(yīng)答過(guò)程中也發(fā)揮作用。

3.3 LPS與Poly I:C刺激后TIM-4表達(dá)變化

TIM-4基因表達(dá)水平可由不同的刺激因子調(diào)節(jié)，如LPS、霍亂毒素和細(xì)胞因子等[8,26-29]。LPS是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分，能刺激細(xì)胞釋放炎癥因子，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[30-31]，細(xì)胞凋亡時(shí)細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸(ptdSer)外翻，TIM-4對(duì)ptdSer具有較高的親和力，能特異性識(shí)別凋亡細(xì)胞并介導(dǎo)吞噬凋亡細(xì)胞[7]，從而抑制炎癥與維持組織穩(wěn)態(tài)。本研究中，在LPS刺激后斜帶石斑魚TIM-4基因在脾臟細(xì)胞中的表達(dá)量顯著下降，表明TIM-4可能參與了炎癥因子通路的調(diào)控。而Poly I:C作為一種干擾素誘導(dǎo)劑，屬病毒核酸的類似物，能被MDA5和TLR3識(shí)別，從而激活Ⅰ型干擾素的表達(dá)[32-33]，因此，本研究中斜帶石斑魚TIM-4基因在Poly I:C刺激下表達(dá)量顯著上升，暗示TIM-4可能在干擾素表達(dá)的正向調(diào)控中發(fā)揮作用。

3.4 斜帶石斑魚TIM-4重組蛋白的制備

本試驗(yàn)中成功地表達(dá)出相對(duì)分子質(zhì)量約為25 100的斜帶石斑魚TIM-4重組蛋白。選擇pGEX-4T作為原核表達(dá)載體，是因?yàn)閜GEX-4T載體能在IPTG誘導(dǎo)下高效表達(dá)外源蛋白，且構(gòu)建的重組蛋白還能通過(guò)谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)親和層析柱簡(jiǎn)便、快速地純化，得到高純度的蛋白[34]。本研究表明，斜帶石斑魚TIM-4重組蛋白以包涵體的形式表達(dá)，在IPTG終濃度0.4 mmol/L、溫度37 ℃的條件下，誘導(dǎo)6 h時(shí)的重組蛋白表達(dá)量最大。

4 結(jié)論

1)本研究中，擴(kuò)增了斜帶石斑魚TIM-4基因的蛋白編碼區(qū)序列，預(yù)測(cè)的氨基酸序列含有IGV、BTK和PRY 3個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，表明TIM-4基因在抗病原感染及免疫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮作用。

2)TIM-4在斜帶石斑魚胃中的表達(dá)量最高，且經(jīng)LPS刺激后，TIM-4在脾臟細(xì)胞中的表達(dá)量顯著下降，經(jīng)Poly I:C刺激后TIM-4在脾臟細(xì)胞中的表達(dá)量顯著上升，表明TIM-4基因在斜帶石斑魚生長(zhǎng)調(diào)控、抗病原感染及免疫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮了作用。

3)斜帶石斑魚TIM-4重組蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約為25 100，主要以包涵體形式表達(dá)。