張皓淳

(遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，遼寧 沈陽 110034)

非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV) 在1921 年第一次被人類檢測(cè)到，發(fā)現(xiàn)地為肯尼亞，家豬、野豬都能感染。因?yàn)樗拗鞯牟灰恢滦?，非洲豬瘟(African swine fever，ASF)的臨床癥狀也有所差異，家豬感染后的臨床表現(xiàn)比較接近傳統(tǒng)豬瘟的，都會(huì)出現(xiàn)呼吸窘迫、全身出血等癥狀，死亡率達(dá)到100%。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織將ASF 納入A 類疫病。

ASFV 是一種帶有囊膜的DNA 病毒，全長(zhǎng)170 kb～190 kb，基因組涵蓋150～167 個(gè)開放閱讀框(open reading frames，ORFs)，可編碼超過150 種蛋白，包括p54 蛋白、p30蛋白等。其中磷蛋白p30 基因（phosphoprotein p30 gene，CP204L）位于ASFV 基因組保守區(qū)，編碼的p30 蛋白是ASFV 重要的毒力蛋白，具有較好的抗原性。p30 蛋白在ASFV 感染早期就已產(chǎn)生，且數(shù)量較多，可以導(dǎo)致感染豬產(chǎn)生中和抗體，是一種比較理想的血清學(xué)診斷以及免疫學(xué)測(cè)定的抗原[1-2]。我國(guó)于2018 年8 月開始出現(xiàn)非洲豬瘟疫情，現(xiàn)已嚴(yán)重影響我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，因此建立快速診斷方法對(duì)確保養(yǎng)豬生產(chǎn)正常進(jìn)行極為重要。

本試驗(yàn)成功構(gòu)建了pET-32a-p30 原核表達(dá)載體，利用表達(dá)的p30 蛋白免疫蛋雞，能夠得到ASFV p30 蛋白的特異性卵黃抗體，根據(jù)測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)該卵黃抗體具有良好的生物學(xué)活性，可以為今后研發(fā)用卵黃抗體檢測(cè)非洲豬瘟疾病打下一個(gè)良好的基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)所用15 羽產(chǎn)蛋期白來杭蛋雞購(gòu)自錦州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 主要試劑

弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購(gòu)自Sigma 公司，pMD-18T-p30、pET-32a 由本實(shí)驗(yàn)室保存，辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP) 標(biāo)記物購(gòu)自Abcam 試劑公司。一抗為非洲豬瘟病毒陽性血清，來自國(guó)家外來動(dòng)物疫病研究中心；二抗為HRP 標(biāo)記羊抗豬IgG，來自Abcam 試劑公司。異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-Dthiogalactoside，IPTG) 購(gòu)自生工生物工程(上海) 股份有限公司。低相對(duì)分子質(zhì)量蛋白marker、禽成髓細(xì)胞血癥病毒(avian myeloblastosis virus，AMV)反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA 連接試劑盒由大連寶生物公司生產(chǎn)。質(zhì)粒小提試劑盒、DNA 純化回收試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。

1.3 主要儀器

超凈工作臺(tái)(型號(hào)為SW-CJ-IF) 購(gòu)自蘇州泰安空氣技術(shù)有限公司，多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司，高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自日本HITACHI 公司，移液器購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司。

2 方法

2.1 引物設(shè)計(jì)

參照已公布的ASFV 磷蛋白p30 基因的核苷酸序列(GeneBank 登錄號(hào)：FR682468.1) 設(shè)計(jì)引物，上游引物序列為5’-CGGGATCCGATTTTATTTTAAATAT-3’，下游引物序列為5’-CCGCTCGAGAATGTAGGTGAGATA AAAGCTT-3’，在引物上添加酶切位點(diǎn)以及保護(hù)性堿基。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

2.2 ASFV 磷蛋白p30 基因克隆及表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

以pMD-18T-p30 為模板對(duì)ASFV 磷蛋白p30 基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)參數(shù)為：cDNA 1 μL、上下游引物(10 μmol/L)0.5 μL、2×PCR mix 10 μL、ddH2O 8 μL；PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 2 min；94℃ 30s、56 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物回收后，與pET-32a 載體分別進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物回收后，用T4 連接酶連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-32a-p30，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌液PCR、雙酶切及DNA 測(cè)序鑒定正確后，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 p30 抗原蛋白的制備

取少許菌至LB 培養(yǎng)基(Amp+，50 mg/mL)中，37 ℃過夜培養(yǎng)，取2 mL 新鮮菌液添加到裝有200 mL LB 培養(yǎng)基的錐形瓶中，37 ℃，225 r/min 培養(yǎng)至OD 值為0.6～0.8，然后添加終濃度為1.0 mmol/L 的IPTG，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，時(shí)間2 h；5 000 r/min，離心10 min，棄去上清液。剩下的菌體進(jìn)行純化，并檢測(cè)蛋白濃度。用Western blotting 檢測(cè)p30蛋白的抗原性，純化的p30 蛋白經(jīng)轉(zhuǎn)膜，封閉后，ASFV 陽性血清為一抗，HRP-羊抗豬-IgG 作為二抗，最后使用二氨基聯(lián)苯胺(3,3’-diaminobenzidine，DAB)顯色處理，鑒定純化蛋白的抗原性。

2.4 動(dòng)物免疫

蛋雞隨機(jī)分為3 組，分籠飼養(yǎng)。第一組為空白對(duì)照組，給蛋雞注射生理鹽水。第二組為陰性對(duì)照組，給蛋雞注射免疫大腸桿菌。第三組為試驗(yàn)組，以胸部肌內(nèi)注射的方式給蛋雞接種抗原蛋白，劑量為0.2 mg/羽。每隔14 d免疫1 次。第一次乳化用弗氏完全佐劑；第二次和第三次乳化用弗氏不完全佐劑；結(jié)束后用弗氏不完全佐劑加強(qiáng)免疫。

2.5 采集血清及雞蛋

免疫前進(jìn)行翅靜脈采血，強(qiáng)化免疫7 d、14 d 后，分別進(jìn)行采血。血樣在4 ℃下靜置，隨后分離血清，－20 ℃下保存?zhèn)溆?。每日收集雞蛋，同時(shí)進(jìn)行標(biāo)記，4 ℃下保存?zhèn)溆谩Ｔ?1 d 時(shí)，測(cè)定蛋雞的血清IgG 效價(jià)，并單獨(dú)收集這一時(shí)期的雞蛋。

2.6 卵黃抗體的制備及純化

雞蛋清潔干凈后，用新潔爾滅溶液消毒，再用75%酒精擦拭雞蛋外殼，隨后用紫外燈照射，晾干后基本處于無菌狀態(tài)。打開蛋殼，分離蛋清，用滅菌濾紙擦凈蛋黃表面殘存的蛋清。用注射器針尖刺破蛋黃膜，吸取20 g 蛋黃液，約3 mL，將其保存在離心管內(nèi)，隨后加入3 mL PBS，振蕩混勻，再加冷氯仿進(jìn)行劇烈振蕩，室溫下靜置1 h，4 000 r/min 離心20 min，提取上清液[2]。

預(yù)處理后，用純水按10 ∶1 稀釋蛋黃液，混后用0.1 mol/L 的鹽酸溶液調(diào)pH 至5.0 左右，4 ℃下靜置10 min，然后4 ℃離心30 min。用0.45 μm 濾膜過濾上清液，收集濾液，作為卵黃抗體組分。將上述溶液添加至硫酸銨中保存。

將上述溶液4 ℃ 10 000 r/min 離心10 min，棄上清液，加入3 mL PBS 溶解沉淀，與硫酸鈉溶液混合，25 ℃ 10 000 r/min 離心15 min，棄上清液，添加去離子水進(jìn)行沉淀，得到二次鹽析組分。

2.7 卵黃抗體鑒定

2.7.1 間接ELISA 檢測(cè)血清和卵黃抗體效價(jià)

(1)血清抗體效價(jià)。以原核表達(dá)的p30 蛋白包被，4 ℃過夜，洗滌5 次后用5%脫脂奶粉37 ℃封閉2 h。以倍比梯度法稀釋免疫血清，按1 ∶2 500 稀釋HRP 標(biāo)記的二抗羊抗豬IgG，用酶標(biāo)儀檢測(cè)，在450 nm 處讀取相對(duì)應(yīng)的OD 值。

(2) 卵黃抗體效價(jià)。采用相同方式檢測(cè)卵黃抗體效價(jià)，以1 ∶10 000 稀釋HRP 標(biāo)記的二抗兔抗雞IgG[3]。陽性判定標(biāo)準(zhǔn)為：(樣本吸光值－空白吸光值)/(陰性吸光值－空白吸光值) ＞2.1，因此可得到血清與卵黃抗體效價(jià)。

2.7.2 免疫印跡

選擇相應(yīng)的蛋白樣本，通過SDS-PAGE分離后在硝酸纖維素膜(nitrocellulose filter membrane，NC 膜)上進(jìn)行轉(zhuǎn)移，經(jīng)過HRP 標(biāo)記后結(jié)合二抗兔抗雞IgG(1 ∶5 000)，進(jìn)行分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定及抗原p30 蛋白的表達(dá)純化

重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后，所得目的片段為606 bp(圖1)，說明重組質(zhì)粒pET-32a-p30構(gòu)建成功。SDS-PAGE 結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pET-32a-p30 轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞后，經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)，能夠?qū)崿F(xiàn)蛋白形式表達(dá)的融合。所產(chǎn)生的分子質(zhì)量大約是42 ku(圖2)，符合預(yù)期標(biāo)準(zhǔn)。重組菌經(jīng)超聲裂解后，將獲得的上清液與沉淀通過SDSPAGE 電泳發(fā)現(xiàn)，沉淀中存在較多的目的蛋白。免疫印跡顯示，蛋白在純化后可以與ASFV 陽性血清發(fā)生反應(yīng)，表明重組蛋白表達(dá)正確，而且免疫原性較佳。

3.2 卵黃抗體鑒定

3.2.1 間接ELISA 檢測(cè)血清和卵黃抗體效價(jià)

p30 蛋白免疫蛋雞在免疫7 d 后能夠在血清中檢測(cè)出抗體。IgY 抗體免疫蛋雞在免疫14 d 后也仍然能夠檢測(cè)出。35 d 后IgY 效價(jià)達(dá)到最高，隨后有所回落，但是仍然能夠保持穩(wěn)定狀態(tài)，具有檢測(cè)價(jià)值。

3.2.2 免疫印跡

在IgY 抗體中，輕鏈的相對(duì)分子質(zhì)量大約為25 000，重鏈約為65 000(圖3)。經(jīng)二次鹽析后，在硝酸纖維素膜上轉(zhuǎn)移純化后的IgY，經(jīng)過封閉處理后與兔抗雞二抗結(jié)合，將會(huì)產(chǎn)生DAB 顯色，可以分析相應(yīng)的免疫印跡[4]。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)IgY 抗體進(jìn)行分離提純后生物活性較佳。

4 討論

作為A 類疫病，ASF 一旦大面積暴發(fā)將會(huì)造成嚴(yán)重的損失。和傳統(tǒng)豬瘟病毒不同，豬感染ASFV 后能夠產(chǎn)生特異性抗體，但是ASFV 容易發(fā)生基因突變，抗體并不能很好地保護(hù)豬，因此至今尚不存在對(duì)應(yīng)的疫苗。本試驗(yàn)選擇具備抗原免疫的蛋雞，蛋雞出現(xiàn)免疫反應(yīng)后，血液中的IgG 會(huì)轉(zhuǎn)移到卵黃中，形成IgY。IgY具備和哺乳動(dòng)物產(chǎn)生的IgY 不同的生物活性，特異性和穩(wěn)定性較高，在免疫學(xué)研究中具有重要價(jià)值。利用IgY 進(jìn)行檢測(cè)具有突出優(yōu)勢(shì)[5]。本試驗(yàn)利用ASFV p30 蛋白免疫蛋雞，分離提純免疫蛋白，研究其生物活性，為鑒定ASF 打下基礎(chǔ)。

獸醫(yī)常用病原學(xué)檢查ASFV，其中免疫熒光法對(duì)實(shí)驗(yàn)室操作有更高的要求，檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)，難度大，且成本較高。核酸檢測(cè)法存在較高的感染風(fēng)險(xiǎn)，免疫組化法在診斷上難度較大，且檢測(cè)結(jié)果無法作為確診依據(jù)。根據(jù)血清學(xué)理論，使用抗原抗體檢測(cè)法能夠有效規(guī)避病毒的傳播，提高檢測(cè)通量，因此已在免疫領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。ASFV 的主要結(jié)構(gòu)蛋白為p30 蛋白，也是血清抗體最為關(guān)鍵的結(jié)合位點(diǎn)，免疫原性相對(duì)較高。p30 蛋白作為研究對(duì)象，能夠?yàn)锳SFV 的檢測(cè)提供良好的路徑。

本研究通過原核表達(dá)獲得充足的p30 蛋白免疫母雞，并得到了相應(yīng)的IgY 抗體，不僅具有較高的活性，而且也有較強(qiáng)的特異性，表現(xiàn)出較高的效價(jià)。提取IgY 的方法主要采用沉淀蛋白的方法，如聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)沉淀法，按照抗體的制備方式，采用與之相適應(yīng)的提取方式。本研究采用了兩步鹽析方式能夠有效提取蛋黃液中的IgY。用ELISA 和 Western blotting 檢測(cè)能夠確定IgY 的活性成分，取得理想的檢測(cè)效果。

ASF 屬于烈性傳染病，受進(jìn)出口貿(mào)易的影響，導(dǎo)致ASF 嚴(yán)重影響我國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)。因此，通過ASFV p30 蛋白免疫蛋雞，分離提純免疫蛋白，研究其生物活性，用于鑒定ASF 具有重要價(jià)值。根據(jù)相關(guān)報(bào)道表明，在識(shí)別哺乳動(dòng)物的抗原蛋白表位時(shí)，當(dāng)其處于高度保守的狀態(tài)時(shí)，如果采用禽類抗體，將具有顯著效果。用IgY 抗體進(jìn)行檢測(cè)，具有重要的價(jià)值意義。