秦志華，蔡晴霞，王建琳，王述柏，譚子超，張林林，郭 沛，單 虎

（1青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266109；2青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東 青島 266109）

0 引言

構(gòu)樹又稱楮樹[1]，其嫩枝、葉、根、皮和果等富含蛋白質(zhì)、脂肪、粗纖維、多糖等營養(yǎng)物質(zhì)[2]，富含生物堿、黃酮類、多酚類、木脂素類、萜類揮發(fā)油類等多種活性物質(zhì)[3-4]，具有抗氧化、抗菌、增強免疫力、抗病毒等功效[5]，既可用于畜禽飼料，又可入藥[6-7]。構(gòu)樹因其獨特的營養(yǎng)和藥用價值近年來備受國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注，研究報道較多。據(jù)報道構(gòu)樹葉提取物中含有大量黃酮類化合物，是其主要活性成分，極具開發(fā)價值[8-10]。目前用于提取黃酮類化合物的方法有加熱回流提取法、微波輔助提取法、超聲波提取法等[11]。據(jù)報道乙醇加熱回流提取法具有設(shè)備簡單、易操作、提取充分等優(yōu)點，但不適合不耐熱成分的提取，對溶劑要求量大，提取時間較長[12-14]。不同植物中黃酮類化合物的提取工藝條件不盡一致[15-16]。李全國[17]報道采用乙醇回流法提取棗葉中總黃酮的最佳工藝條件為乙醇濃度50%、料液比1:10、回流時間1.0 h、提取溫度70℃，在此條件下得到的總黃酮提取量為14.31 mg/g。許中暢[18]報道采用乙醇回流提取法提取向日葵花盤總黃酮的最佳工藝條件為乙醇濃度80%、料液比20:1(mL:g)、提取溫度80℃、提取時間2 h，總黃酮提取量為25.32 mg/g。陳況況[19]研究顯示，采用加熱回流法提取水芹中黃酮類的最佳工藝為料液比1:25、乙醇濃度70%、加熱時間2.5 h、溫度73.8℃，總黃酮提取量為31.5 mg/g DW。有關(guān)構(gòu)樹葉采用乙醇加熱回流法的提取工藝報道較少。因此，本試驗對乙醇加熱回流法提取構(gòu)樹葉黃酮類化合物的提取溫度、時間、乙醇濃度、料液比等條件進行了篩選優(yōu)化，在此基礎(chǔ)上進一步采用正交試驗設(shè)計對構(gòu)樹葉黃酮的提取工藝進行了優(yōu)化，旨在建立一種構(gòu)樹葉總黃酮的高效、便捷提取工藝，從而為其開發(fā)利用提供科學(xué)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 構(gòu)樹葉粉末（過40目篩）；蘆丁標準品（購自索萊寶生物科技有限公司）；無水乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鹽、氫氧化鈉（分析純，天津恒興化學(xué)試劑制造有限公司）。試驗于2017年4—6月在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院實驗室進行。

1.1.2 主要儀器 AR2140電子分析天天平（上海奧斯豪國際貿(mào)易公司）；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；WFZ754型紫外可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司）；KDM電子調(diào)溫電熱套（龍口市先科儀器有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 蘆丁標準曲線的制作 蘆丁標準品加少量無水乙醇溶解，70%乙醇溶液定容，即得蘆丁標準品溶液。根據(jù)NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法檢測510 nm下不同濃度蘆丁標準品溶液的吸光值[20]。制作的標準曲線見圖1，回歸方程見式(1)。

圖1 蘆丁標準曲線

1.2.2 單因素試驗設(shè)計篩選最優(yōu)提取條件 采用單因素試驗設(shè)計，分別研究不同乙醇濃度、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度、液料比條件下的構(gòu)樹葉總黃酮提取量，篩選最優(yōu)條件。

乙醇濃度：以乙醇為溶劑，提取濃度分別設(shè)置為：50%、60%、70%、80%、90%。其他提取條件一致：料液比為1:20(g:mL)，反應(yīng)溫度50℃，反應(yīng)時間1 h。單因素試驗結(jié)果顯示最佳乙醇添加濃度為70%。

反應(yīng)時間：反應(yīng)時間分別設(shè)置為：1、1.5、2、2.5、3 h。其他提取條件一致：以70%乙醇為溶劑，料液比為1:20(g:mL)，反應(yīng)溫度為50℃。單因素試驗結(jié)果顯示最佳反應(yīng)時間為2.5 h。

反應(yīng)溫度：反應(yīng)溫度分別設(shè)置為：40、50、60、70、80℃。其他提取條件一致：以70%乙醇為溶劑，料液比為1:20(g:mL)，加熱回流反應(yīng)時間2.5 h。單因素試驗結(jié)果顯示最佳反應(yīng)溫度為70℃。

料液比：料液比分別設(shè)置為1:20、1:25、1:30、1:35、1:40(g:mL)。其他提取條件一致：以70%乙醇為溶劑，反應(yīng)溫度70℃，反應(yīng)時間2.5 h。單因素試驗結(jié)果顯示最佳料液比為1:30。

上述試驗均采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法測定OD值，根據(jù)1.2.1標準曲線計算總黃酮含量。

1.2.3 提取工藝優(yōu)化試驗 根據(jù)1.2.2單因素試驗獲得的最佳參數(shù)，以乙醇濃度(A)、反應(yīng)時間(B)、反應(yīng)溫度(C)、料液比(D)為考察因素，每種因素設(shè)置3個水平，采用正交試驗設(shè)計L9(34)（見表1）研究最佳提取工藝，以提取液中總黃酮含量為評價指標。

表1 加熱回流法提取工藝的四因素三水平正交試驗設(shè)計

1.2.4 最佳工藝重復(fù)驗證試驗 對1.2.3獲得的最佳工藝進行驗證：稱取1.0 g構(gòu)樹葉粉末，在最佳提取工藝條件下進行總黃酮提取，重復(fù)5次，檢測提取液中總黃酮含量。

1.2.5 最佳工藝放大試驗 稱取10.0 g構(gòu)樹葉粉末，采用1.2.3獲得的最佳提取工藝進行總黃酮提取，重復(fù)5次，檢測提取液中總黃酮含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用Excel 2016軟件初步整理試驗數(shù)據(jù)，采用SPSS 22.0軟件進行回歸分析和正交試驗數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取條件對構(gòu)樹葉中總黃酮提取量的影響

2.1.1 不同乙醇濃度對總黃酮提取量的影響 不同乙醇濃度對總黃酮提取量的影響見圖2。如圖2所示，隨著乙醇濃度的增加，構(gòu)樹葉總黃酮的提取量呈先上升后下降趨勢，總黃酮提取量達到峰值的乙醇濃度為70%。劑量-效應(yīng)回歸方程見式(2)。計算得知：乙醇濃度為71.95%可獲得最佳提取量，接近于設(shè)定值70%。

圖2 不同乙醇濃度對總黃酮提取量的影響

2.1.2 不同反應(yīng)時間對構(gòu)樹葉中總黃酮提取量的影響不同反應(yīng)時間對構(gòu)樹葉中總黃酮提取量的影響見圖3。如圖3所示，反應(yīng)時間在1～2.5 h范圍內(nèi)，構(gòu)樹葉總黃酮提取量隨時間的增加呈增加趨勢，反應(yīng)時間2.5 h總黃酮提取量達到峰值，之后開始下降。劑量-效應(yīng)回歸方程見式(3)。計算得知：反應(yīng)時間2.58 h可獲得最佳提取量，接近于設(shè)定值2.5 h。

圖3 不同反應(yīng)時間對總黃酮提取量的影響

2.1.3 不同反應(yīng)溫度對構(gòu)樹葉中總黃酮提取量的影響不同反應(yīng)溫度對構(gòu)樹葉中總黃酮提取量的影響見圖4。如圖4所示，反應(yīng)溫度在40～70℃范圍內(nèi)，隨溫度升高構(gòu)樹葉總黃酮提取量呈上升趨勢，70℃時提取量達到峰值，之后呈下降趨勢。劑量-效應(yīng)回歸方程見式(4)。計算得知：反應(yīng)溫度70.88℃可獲得最佳提取量，接近于設(shè)定值70℃。

圖4 不同反應(yīng)溫度對總黃酮提取含量的影響

2.1.4 不同料液比對構(gòu)樹葉中總黃酮提取量的影響 不同料液比對構(gòu)樹葉中總黃酮提取量的影響見圖5。如圖5所示，隨著料液比增加，構(gòu)樹葉總黃酮提取量呈迅速增多而后下降趨勢，料液比為1:30(g/mL)時，總黃酮提取量達到峰值。劑量-效應(yīng)回歸方程(5)。計算得知：料液比1:29可獲得最佳提取量，接近于設(shè)定值1:30。

圖5 不同料液比對總黃酮提取含量的影響

2.2 不同提取工藝對構(gòu)樹葉總黃酮提取量的影響

不同提取工藝對構(gòu)樹葉總黃酮提取量的影響見表2。由表2可知，各因素對構(gòu)樹葉總黃酮提取量的影響大小順序為：A＞B＞C＞D，最佳提取條件為：A2B2C3D2。方差分析結(jié)果見表3，從統(tǒng)計學(xué)角度看，試驗數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計學(xué)意義，因此確定最佳提取工藝條件為：乙醇濃度70%，反應(yīng)時間2.5 h，反應(yīng)溫度80℃，料液比1:30。

表2 不同提取工藝對構(gòu)樹葉總黃酮提取量的影響

表3 方差分析

2.3 最佳提取工藝的重復(fù)驗證試驗結(jié)果

最佳工藝條件重復(fù)驗證試驗結(jié)果顯示，自1 g構(gòu)樹葉提取獲得的提取液樣品中構(gòu)樹葉總黃酮含量為23.11 mg/g，RSD=0.90%。高于正交設(shè)計結(jié)果中的最大值，表明所確定的提取工藝穩(wěn)定性和可靠性良好。

最佳工藝放大試驗結(jié)果顯示，自10 g構(gòu)樹葉提取獲得的提取液樣品中構(gòu)樹葉總黃酮含量為23.13 mg/g，與放大前試驗提取量一致，進一步驗證了所確定的提取工藝具有良好穩(wěn)定性和可靠性。

3 討論

加熱回流提取法利用乙醇等有機溶劑對樣品中的有效成分進行提取，溶劑沸點決定反應(yīng)溫度，加熱回流提取反應(yīng)時間較長，有利于樣品與溶劑充分接觸，使目標物質(zhì)充分浸出，但長時間高溫易使有效成分失活[21]。

大量研究表明采用加熱回流法提取植物中黃酮類化合物的提取工藝因植物種類不同，工藝條件不盡一致。向蓉等[15]報道，采用加熱回流法（乙醇濃度60%、加熱溫度88℃、回流反應(yīng)時間4 h，反復(fù)2次）提取辣蓼總黃酮，發(fā)現(xiàn)該提取工藝的提取率優(yōu)于索氏提取法和熱水提取法，與超聲提取法相差不大，但加熱回流提取時間長，能耗較大。趙雪梅等[22]報道常山胡柏皮中黃酮類化合物的最佳提取工藝參數(shù)為反應(yīng)時間150 min，乙醇濃度80%、反應(yīng)溫度20℃，料液比1:5，最大提取量1.98 mg/mL。張帆等[23]研究表明，采用乙醇加熱回流法提取芒果葉中總黃酮的最佳工藝為溫度100℃，時間2 h，液固比10，提取次數(shù)3次。目前構(gòu)樹葉總黃酮提取工藝的研究較少。汪雁等[24]以離子液體苯并噻唑甲烷磺酸鹽為提取劑，結(jié)合超聲輔助提取構(gòu)樹葉總黃酮，通過條件優(yōu)化后測得總黃酮含量為0.46 mg/g，該法操作復(fù)雜，得率較低。張志鵬等[25]研究發(fā)現(xiàn)采用加熱回流法提取航天雜交構(gòu)樹葉總黃酮的最佳提取工藝為乙醇濃度70%、料液比1:20(g:mL)、反應(yīng)時間6 h、反應(yīng)溫度100℃。本試驗結(jié)果顯示，采用乙醇為溶劑最佳濃度為70%，最佳反應(yīng)時間為2.5 h、最佳料液比為1:30(g:mL)、最佳反應(yīng)溫度為80℃，重復(fù)驗證和放大驗證試驗顯示，本試驗的提取工藝具有良好的穩(wěn)定性、提取得率較高，與上述報道比較，反應(yīng)時間縮短、反應(yīng)溫度較低。

4 結(jié)論

本試驗以構(gòu)樹葉為原料，采用單因素和正交試驗優(yōu)化后得到的加熱回流法提取構(gòu)樹葉總黃酮的最優(yōu)工藝為：乙醇濃度70%、反應(yīng)溫度80℃、提取時間2.5 h、料液比1:30(g:mL)。